一种利用半乳糖苷酶鉴定具有分泌功能信号肽的方法与流程

1.本发明涉及信号肽鉴定技术领域，尤其涉及一种利用半乳糖苷酶鉴定具有分泌功能信号肽的方法。


背景技术：

2.本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种利用半乳糖苷酶基因能够催化底物半乳糖苷键显蓝色特点来鉴定具有分泌功能信号肽的方法。
3.分泌蛋白指的是在细胞内合成，能够分泌到细胞外发挥作用的蛋白质。信号肽位于分泌蛋白的n端，一般由15-30个氨基酸组成。当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔，最终被转移到细胞外，信号肽则被切除。
4.半乳糖苷酶是指一类水解含半乳糖苷键物质的酶类，利用这一特性，选择合适显色底物显色检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种成本低、准确率高、成本低、耗时短的鉴定信号肽是否具有分泌功能的方法。本发明利用半乳糖苷酶是指一类水解含半乳糖苷键底物显色的特点，在酵母中实验，可以快速高效的检测信号肽是否具有分泌功能。
6.本发明为解决上述问题，提供一种利用半乳糖苷酶鉴定具有分泌功能信号肽的方法，
7.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.上述利用半乳糖苷酶鉴定具有分泌功能信号肽的方法中，所述半乳糖苷酶基因能够催化底物半乳糖苷键显蓝色，包括以下步骤：(1)将待鉴定信号肽连接半乳糖苷酶c端构建表达载体；(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；(3)将步骤(1)构建的表达载体转化至酵母感受态细胞涂布在加有半乳糖苷酶底物的酵母缺陷型培养基上，观察生长出来的菌斑是否显蓝色，若菌斑显蓝色，则待检测信号肽具有分泌功能，若菌斑显白色，则待检测信号肽不具有分泌功能。所述报告基因为半乳糖苷酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq id no.2所示。其中所述表达载体为酵母表达载体，所述感受态细胞为酵母感受态细胞。另外，本技术还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤(1)阶段，将半alpha factor的信号肽连接半乳糖苷酶蛋白c端构建表达载体得到，所述alpha factor的信号肽的氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4。另，本技术还提供上述利用半乳糖苷酶鉴定具有分泌功能信号肽的方法在筛选具有分泌功能的信号肽中的应用。
9.采用本发明的产生的有益效果为：
10.本技术利用半乳糖苷酶鉴定具有分泌功能信号肽，与传统的通过基因工程构建、
蛋白诱导表达后才能鉴别分泌功能信号肽的方法，本技术具有成本低、准确率高、耗时短等优点，具有广泛应用于信号肽鉴定技术领域的潜力。
具体实施方式
11.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
12.本发明根据半乳糖苷酶(gal)片段序列设计特异性引物，gal-f(seq id no.5)和gal-r(seq id no.6)，扩增gal的c端序列，获得扩增产物gal-c。按照如下反应进行pcr扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸5min。扩增完成后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，获得长度为目的大小的dna扩增条带；使用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。将切胶回收后gal-c片段与hindiii酶切处理回收后pgadt7线性化载体通过一步连接试剂盒(货号：c112-01，vazyme biotech co.,ltd)，并在gal-c片段的n端引入hindiii和ndei酶切位点，载体命名为pmel1。
13.将alpha factor的信号肽序列(氨基酸序列如seq id no.3)连接半乳糖苷酶的c端序列(核苷酸序列seq id no.1)，构建酵母瞬时表达载体，获得可以在酵母上表达完整的的载体。
14.具体过程如下：
15.根据片段序列设计特异性引物，alpha factor-f(seq id no.7)和alpha factor-r(seq id no.8)扩增alpha factor的信号肽区域，获得扩增产物alpha factor。按照如下反应进行pcr扩增：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。扩增完成后，在1％的琼脂糖凝胶上电泳，获得长度为目的大小的dna扩增条带；使用凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。将载体通过hindiii和ndei酶进行双酶切，酶切产物用凝胶回收试剂盒进行回收。通过一步连接试剂盒(货号：c112-01，vazyme biotech co.,ltd)将基因片段和载体连接，转化大肠杆菌jm109，挑取阳性克隆，经pcr和测序验证。
16.通过化学转化酵母的方法获得含有目的载体的酵母。半乳糖苷酶酵母菌转化在电转化仪上进行，将电击杯及杯架置于冰上。设置电转化仪参数，电容c＝25μf，电压v＝2.5kv(电击杯为0.2cm)。电转完成后，加入1mllb培养液至电击杯中，重新悬浮细胞并转移ep管中，30℃振荡培养1-2h。离心收集细胞，弃上清，保留50-100μl液体，轻轻混匀涂布于含有卡那霉素的lb平板上，30℃培养，待长出单菌落后，挑取单菌落进行阳性菌落验证。
17.将构建的pmel1表达载体转化至酵母感受态细胞涂布在加有半乳糖甘酶底物的酵母缺陷型培养基上，观察生长出来的菌斑是否显蓝色，若菌斑显蓝色，则待检测信号肽具有分泌功能，若菌斑显白色，则待检测信号肽不具有分泌功能。
18.实施例2
19.为了验证方法的可靠性，选择alpha factor(氨基酸序列如seq id no.3)的分泌功能进行进行检测。通过实施例1中(1)的方法将alpha factor的信号肽序列(氨基酸序列如seq id no.3)连接半乳糖苷酶的c端序列(核苷酸序列seq id no.1)，构建酵母瞬时表达载体，获得可以在酵母上表达完整的的载体，将目的基因表达载体。将构建的alpha factor表达载体转化至酵母感受态细胞涂布在加有半乳糖甘酶底物的酵母缺陷型培养基上，观察
leu ala ala pro val asn thr thr thr glu asp glu thr ala gln ile pro ala glu ala val ile gly tyr ser asp leu glu gly asp phe asp val ala val leu pro phe ser asn ser thr asn asn gly leu leu phe ile asn thr thr ile ala ser ile ala ala lys glu glu gly val ser leu glu lys arg glu ala glu ala
29.seq id no.4
30.atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctctcgagaaaagagaggctgaagct
31.seq id no.5 5'caagcttggtgtcactttcgctttggcagcagt 3'
32.seq id no.6 5'actgctgccaaagcgaaagtgacaccaagcttg 3'
33.seq id no.7 5'caagcttgatgagatttccttcaatttttactg 3'
34.seq id no.8 5'cagtaaaaattgaaggaaatctcatccatatgg 3'ccatatgg

技术特征：
1.一种利用半乳糖苷酶对底物作用显色以鉴定具有分泌功能的信号肽的方法，其特征在于，所述半乳糖苷酶基因能够催化底物半乳糖苷键显蓝色，包括以下步骤：(1)将待鉴定信号肽连接半乳糖苷酶c端构建表达载体；(2)将步骤(1)构建的表达载体转化感受态细胞；(3)将步骤(1)构建的表达载体转化至酵母感受态细胞涂布在加有半乳糖苷酶底物的酵母缺陷型培养基上，观察生长出来的菌斑是否显蓝色，若菌斑显蓝色，则待检测信号肽具有分泌功能，若菌斑显白色，则待检测信号肽不具有分泌功能。所述报告基因为半乳糖苷酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示，其核苷酸序列如seq id no.2所示。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述表达载体为酵母表达载体。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述感受态细胞为酵母感受态细胞。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括设立阳性对照，所述阳性对照是在步骤(1)阶段，将半alpha factor的信号肽连接半乳糖苷酶蛋白c端构建表达载体得到，所述alpha factor的信号肽的氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4。5.权利要求1-4任一所述的方法在筛选具有分泌功能的信号肽中的应用。

技术总结
本发明提供了一种利用半乳糖苷酶对底物作用显色以鉴定具有分泌功能信号肽的方法，包括以下步骤：(1)将待鉴定信号肽连接半乳糖苷酶的C端构建表达载体，所述半乳糖苷酶的C端氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)将步骤(1)构建的表达载体转化至酵母感受态细胞涂布在加有半乳糖苷酶底物的酵母缺陷型培养基上，观察生长出来的菌斑是否显蓝色，若菌斑显蓝色，则待检测信号肽具有分泌功能，若菌斑显白色，则待检测信号肽不具有分泌功能。待检测信号肽不具有分泌功能。


技术研发人员：后加乐 王雪玲
受保护的技术使用者：后加乐
技术研发日：2022.02.22
技术公布日：2023/9/20