一种生物酶促合成手性含氮化合物的方法

1.本发明涉及一种生物酶作为极性反转/不对称共轭加成反应催化剂的应用。


背景技术：

2.大于95％的药物分子中含有氮原子，氮原子的存在不仅能提高化合物的水溶性和细胞渗透性，还可以增加化合物与生物靶点的相互作用，手性含氮化合物的合成一直是人们关注的热点。
3.通常共轭加成反应是由含有活泼亚甲基结构的化合物形成碳负离子后作为亲核试剂，与亲电共轭体系(亲电试剂)进行加成。最近报道了一种n-苄基取代亚胺类化合物极性反转方法，在奎宁碱类手性催化剂的作用下，苄基碳原子先形成碳负离子，通过共轭离域使得原羰基碳由缺电子变为富电子，从而实现了碳正向碳负的反转，进一步发生了不对称共轭加成反应。但奎宁碱类手性催化剂合成步骤繁琐，反应条件苛刻，价格昂贵等问题使其在实际应用上受到限制。
4.生物酶作为一种绿色、高效的催化剂在有机合成中应用愈发广泛，且生物酶法不仅可以精准地构建立体中心，还可以方便地完成化学法难以进行的反应。本发明涉及一种在生物酶催化下，n-苄基取代亚胺类化合物的苄基碳原子先形成碳负离子，该碳负离子通过共轭离域使得原羰基碳由碳正性变为碳负性，再进一步进行共轭加成反应得到手性含氮化合物。该方法催化效率高，选择性好，因此该发明具有非常重要的应用价值。


技术实现要素：

5.本发明目的之一在于提供了多种生物酶，包括来源于巨大芽孢杆菌的青霉素g酰化酶、来源于rhizomucor miehei的脂肪酶rmim、来源于chromobacterium violaceum的ω-转氨酶 cv2025，作为极性反转/不对称共轭加成反应催化剂的应用，具有底物适应性广、催化效率高、选择性好、操作简单、反应条件温和、能够回收利用等优点；目的之二在于提供利用酶催化剂催化极性反转/不对称共轭加成反应的方法，适用范围较广，产物收率高，选择型好。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.1、一种生物酶法催化合成手性含氮化合物的应用。
8.2、利用生物酶催化极性反转/不对称共轭加成反应的方法，其特征在于：以生物酶为催化剂，将n-苄基取代亚胺作为亲核试剂与亲电试剂如α,β-不饱和醛/酮/羧酸/酯/酰胺/腈/硝基化合物等发生反应，反应温度20～60℃，亲核试剂与亲电试剂投料比为1～10：1～2。
9.进一步，利用生物酶作为催化剂的方法，其特征在于：所述生物酶可以为来源于巨大芽孢杆菌的青霉素g酰化酶、来源于rhizomucor miehei的脂肪酶rmim、来源于chromobacterium violaceum的ω-转氨酶cv2025。
10.进一步，作为催化剂的生物酶是以下蛋白质(a)或者(b)；
11.(a):一种包含序列表中seq id:1、seq id:2、seq id:3的氨基酸残基序列的蛋白质；
12.(b):一种包含序列表中seq id:1、seq id:2、seq id:3的氨基酸残基序列经过取代和/或缺失和/或添加至少一个或多个氨基酸残基而获得的具有催化极性反转/不对称共轭加成反应活性的蛋白质。
13.进一步，作为催化剂的生物酶的编码基因，其特征在于，所述的生物酶的编码基因具有下述核苷酸序列(a)或(b)；
14.(a):序列表中seq id:4、seq id:5、seq id:6所述的核苷酸序列；
15.(b):编码序列表中seq id:4、seq id:5、seq id:6序列的多核苷酸序列。
16.本发明的目的是通过一下另一技术方案实现的：
17.含有本发明所述生物酶编码基因的重组表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围宿主菌。
18.3、利用生物酶法作为极性反转/不对称共轭加成合成手性含氮化合物催化剂的方法，其特征在于：所述亲核试剂n-苄基取代亚胺(a)与亲电试剂α,β-不饱和醛/酮(b)结构可如下式所示：
19.ar为不同取代的苯环，杂环；r1为烷烃，芳香烃等；r2为h，cf3，ch3等
[0020][0021]
本发明相比现有技术具有如下优势：
[0022]
本发明中提供了一种利用生物酶催化进行极性反转/不对称共轭加成反应的方法，合成了手性含氮化合物，该方法具有底物适用性广、催化效率高、选择性好和可回收利用等优点。
具体实施方式
[0023]
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
[0024]
实施例中使用的来源于巨大芽孢杆菌的固定化青霉素g酰化酶购自杭州创科生物科技有限公司、来源于rhizomucor miehei的固定化脂肪酶rmim购自诺维信(中国)投资有限公司、来源于chromobacterium violaceum的固定化ω-转氨酶cv2025，由实验室保存菌种与购自西安蓝晓科技有限公司的树脂材料lx-1000ep进行共价固定所得。
[0025]
实施例中采用薄层色谱法监测反应进程；快速柱色谱法采用100～200目硅胶加压柱；h
1 nmr采用brukerav-400型核磁共振仪(以tms为内标)；ee值采用高效液相色谱手性固定相法测定，手性固定相采用ad-h手性柱，产物的绝对构型通过与文献报道的色谱峰保留
时间进行比较确定。
[0026]
生物转化实施例1：不同酶催化的极性反转/不对称共轭加成反应
[0027][0028]
在圆底烧瓶中加入1,1,1-三氟-n-(4-硝基苄基)丙烷-2-亚胺0.4mmol、2-环戊烯-1-酮2.0mmol、正辛烷5ml和酶500mg，震荡搅拌反应：反应完毕后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，洗液与滤液合并，加入水后用乙酸乙酯进行萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得到目标产物。反应条件及结果见表1。
[0029]
表1不同酶催化的极性反转/不对称共轭加成反应
[0030][0031]
生物转化实施例2：固定化青霉素g酰化酶的极性反转/不对称共轭加成反应在圆底烧瓶中加入亲核试剂n-苄基取代亚胺0.4mmol、亲电试剂α,β-不饱和醛/酮2.0mmol、正辛烷5ml和酶500mg，震荡搅拌反应：反应完毕后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，洗液与滤液合并，加入水后用乙酸乙酯进行萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得到目标产物。反应条件及结果见表2。
[0032]
反应条件及结果见表2。
[0033]
表2固定化青霉素g酰化酶的极性反转/不对称共轭加成反应
[0034][0035]
生物转化实施例3：固定化转氨酶cv2025的极性反转/不对称共轭加成反应在圆底烧瓶中加入亲核试剂n-苄基取代亚胺0.4mmol、亲电试剂α,β-不饱和醛/酮2.0mmol、正辛烷5ml和酶500mg，震荡搅拌反应：反应完毕后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，洗液与滤液合并，加入水后用乙酸乙酯进行萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得到目标产物。反应条件及结果见表3。
[0036]
表3固定化转氨酶cv2025的极性反转/不对称共轭加成反应
[0037][0038]
生物转化实施例4：固定化脂肪酶lipozyme rmim的极性反转/不对称共轭加成反应在圆底烧瓶中加入亲核试剂n-苄基取代亚胺0.4mmol、亲电试剂α,β-不饱和醛/酮2.0mmol、正辛烷5ml和酶500mg，震荡搅拌反应：反应完毕后，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，洗液与滤液合并，加入水后用乙酸乙酯进行萃取，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压蒸馏除去溶剂后得到粗产物，将粗产物用快速柱色谱法纯化，即得到目标产物。反应条件及结果见表4。
[0039]
表4固定化脂肪酶lipozyme rmim的极性反转/不对称共轭加成反应
[0040][0041]
最后说明的是，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

技术特征：
1.一种生物酶催化合成手性含氮化合物的应用。2.利用权利要求1所述生物酶催化极性反转/不对称共轭加成反应的方法，其特征在于：以生物酶为催化剂，将n-苄基取代亚胺作为亲核试剂与亲电试剂如α,β-不饱和醛/酮/羧酸/酯/酰胺/腈/硝基化合物等发生反应，反应温度20～60℃，亲核试剂与亲电试剂投料比为1～10：1～2。3.根据权利要求2所述生物酶作为催化剂的方法，其特征在于：所述生物酶可以为来源于巨大芽孢杆菌的青霉素g酰化酶、来源于rhizomucor miehei的脂肪酶rmim、来源于chromobacterium violaceum的ω-转氨酶cv2025。4.根据权利要求3所述的生物酶是以下蛋白质(a)或者(b)；(a):一种包含序列表中seq id:1、seq id:2、seq id:3的氨基酸残基序列的蛋白质；(b):一种包含序列表中seq id:1、seq id:2、seq id:3的氨基酸残基序列经过取代和/或缺失和/或添加至少一个或多个氨基酸残基而获得的具有催化极性反转/不对称共轭加成反应活性的蛋白质。5.权利要求4中所述的生物酶的编码基因，其特征在于，所述的生物酶的编码基因具有下述核苷酸序列(a)或(b)；(a):序列表中seq id:4、seq id:5、seq id:6所述的核苷酸序列；(b):编码序列表中seq id:4、seq id:5、seq id:6序列的多核苷酸序列。6.含有权利要求4或5所述的生物酶编码基因的重组表达载体。7.含有权利要求4或5所述的生物酶编码基因的转基因细胞系。8.含有权利要求4或5所述的生物酶编码基因的宿主菌。9.根据权利要求2或3所述利用生物酶法合成手性含氮化合物催化剂的方法，其特征在于：所述亲核试剂n-苄基取代亚胺(a)与亲电试剂α,β-不饱和醛/酮(b)；ar为不同取代的苯环，杂环；r1为烷烃，芳香烃等；r2为h，cf3，ch3等

技术总结
本发明涉及一种生物酶作为极性反转/不对称共轭加成反应催化剂的应用，具有底物适应性广、催化效率高、选择性好、操作简单、反应条件温和、能够回收利用等优点；本发明还提供了利用生物酶催化极性反转/不对称共轭加成反应的方法，催化效率高，选择性好。选择性好。


技术研发人员：郑国钧 王黛茜 李谷东
受保护的技术使用者：北京化工大学
技术研发日：2022.03.07
技术公布日：2023/9/20