一种外泌体来源的ecDNA的建库方法与流程

一种外泌体来源的ecdna的建库方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体来源ecdna的建库方法。


背景技术：

2.外泌体(exosome)是一种30-150nm大小、极低密度的细胞外纳米级囊状结构，由细胞经过“内吞-融合-外排”等一系列调控过程而形成。几乎所有细胞都会分泌外泌体，细胞分泌的外泌体携带了来源细胞的诸多生物学信息，因此，外泌体也被认为是重要的潜在生物标记物，可以及时的反映来源细胞的生理与病理状态。
3.ecdna是近期肿瘤学领域的研究热点，ecdna指的是从染色体上脱落以环状结构存在的dna。研究表明ecdna普遍存在于肿瘤细胞中，是原癌基因的载体，是肿瘤异质性的驱动力之一，会推动肿瘤的快速演化，并与肿瘤的发生、发展密切相关。
4.目前市场上多数为线性dna的建库技术与产品，没有专门用于环状dna建库的产品。现有的dna建库方法不适合用于ecdna的建库，存在以下缺点：1、ecdna提取纯化的纯度较差，存在线性dna污染；2、线性建库方法导致建库有效数据量低；3、建库周期长。因此，急需一种专门用于ecdna的环状dna建库方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提供一种外泌体来源ecdna的建库方法。主要解决现有技术中的dna建库方法不适合用于ecdna的建库，存在ecdna提取纯化的纯度差、建库有效数据量低、建库周期长的问题。
6.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
7.一种外泌体来源的ecdna的建库方法，该方法包括以下步骤：
8.(1)外泌体总dna制备；
9.(2)外泌体线性dna去除；
10.(3)外泌体ecdna滚环扩增；
11.(4)滚环扩增产物超声打断；
12.(5)打断产物末端修复及a尾添加、加接头；
13.(6)pcr扩增及产物纯化、测序及数据分析。
14.步骤(1)中外泌体总dna制备，主要选用市售的微量dna提取试剂盒。优选地，该试剂盒采用qiagen公司的qiaamp ucp dna micro kit(56204)。
15.作为优选实施方案，所述步骤(2)中采用核酸外切酶去除线性dna。进一步优选地，采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶的联合应用，联合应用可更加高效快速的消解线性dna。优选地，单链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的核酸外切酶i(mt0087)，双链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的λ核酸外切酶(mt0086)。在外泌体线性dna去除的反应体系中，所述核酸外切酶i的浓度为0.8-1.2u/μl，优选为1u/μl；所述λ核酸外切酶的浓度为0.4-0.6u/μl，优选为0.5u/μl。
16.作为优选实施方案，所述步骤(3)中采用phi29 2.0 dna聚合酶。该酶在保留了phi29 dna聚合酶的链置换、连续合成特性(》70kb)的基础上，提高了滚环扩增的反应温度，可以在42℃条件下持续的进行dna合成，极大的提高了滚环扩增的效率，在1-2h之内，即可完成扩增。优选地，phi29 2.0 dna聚合酶主要选用新海基因的phi29 2.0 dna polymerase(a3703a)。
17.作为优选实施方案，所述步骤(4)中超声打断的超声功率为8-12w，超声时间为4-6min。
18.作为优选实施方案，所述步骤(5)中末端修复及a尾添加的产物直接进行加接头连接；加接头连接产物采用磁珠法进行纯化。打断产物可在单管内快速实现dna片段末端补平以及5'端磷酸化和3'端加a尾反应，得到5'末端含磷酸基团且3'末端带有da突出的dna产物，且该产物无需纯化，可直接进行接头链接。优选地，产物末端修复及a尾添加试剂主要选用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的hiefffast-pace end repair/da-tailing module快速末端修复/a尾添加模块(12608es24)，可在四十分钟内完成dna的末端修复以及a尾的添加。接头连接试剂选用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的hiefffast-pace dna ligation module快速dna连接模块(12607es08)，接头试剂选用hieffcomplete adapter kit forset 1(12615es04)。
19.作为优选实施方案，所述步骤(6)中pcr扩增产物采用磁珠法进行纯化，获得构建的文库。文库扩增试剂选用kapa biosystems的kapa library amplification kit with primers(250x50μl reactions)(kk2621)进行。
20.作为优选实施方案，所述构建好的文库，经过illumina novaseq 6000测序仪测序，获得原始数据；使用q30值进行原始数据质控；使用cut adapt软件去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads；使用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上；然后，使用circle-map软件鉴定所有样品中的ecdna。
21.本发明提供的方法适用于不同体液来源的外泌体样本。作为优选实施方案，所述体液为血浆、尿液或脑脊液。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
23.1)现有的ecdna建库所需时间一般在2-3天的时间，本发明专利提供的方法可在一天内完成建库，建库的时间更短，操作更加简单，快捷。
24.2)因ecdna在总dna中的占比较低，如果不将总dna的线性dna去除干净，则会在后续的实验中占用较多的有效数据量，干扰ecdna的检测，本发明采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶联用的方法，可以更加高效快速的去除线性dna，从而最大限度的保证了ecdna的纯度。
25.3)本发明试剂采用phi29 2.0 dna聚合酶进行滚环扩增，传统的phi29 dna聚合酶是在30℃条件下工作的，而本发明采用的phi29 2.0 dna聚合酶可以在42℃条件下持续的进行dna合成，可有效缩短扩增时间，一般在1～2h内完成扩增，而传统的phi29 dna聚合酶的扩增则在一天以上。
附图说明
26.图1是本发明实施例1中本发明方案和常规方案的滚环扩增产物的电泳结果图。
27.图2是本发明实施例2中本发明建库方案和文献建库方案下机的有效数据量汇总示意图。
28.图3是本发明实施例2中本发明建库方案鉴定到的ecdna的汇总示意图。
29.图4是本发明实施例2中文献建库方案鉴定到的ecdna的汇总示意图。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
31.实施例1本发明方案采用的外切酶以及滚换扩增酶与常规方法采用的外切酶以及滚换扩增酶进行对比验证
32.(1)肿瘤细胞系22rv1外泌体制备以及外泌体总dna提取
33.收取细胞系22rv1无血清细胞培养上清240ml，超高速离心法制备外泌体，之后进行外泌体dna的提取，采用qiagen公司的qiaamp ucp dna micro kit(56204)，详细操作流程见试剂盒说明书。将制备所得的外泌体dna均分为6份，每份10μl，编号依次为e1，e2，e3，e4，e5，e6。其中e1，e2，e3采用本发明方案进行酶切以及滚环扩增，e4，e5，e6采用常规方法进行酶切以及滚环扩增。
34.(2)本发明方案的外泌体线性dna去除以及滚环扩增
35.(2.1)外泌体线性dna的去除
36.单链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的核酸外切酶i(mt0087)，双链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的λ核酸外切酶(mt0086)。
37.10x反应缓冲液配置：650mm glycine-koh ph9.4，60mm mgcl2，50mm 2-巯基乙醇，500μg/ml bsa的水溶液。
38.反应体系配置参见表1。
39.表1
40.组份体积(μl)核酸外切酶i(20u/μl)1λ核酸外切酶(5u/μl)210x反应缓冲液2外泌体总dna10无酶水5
41.表1中的反应体系进行的反应程序设置为：37℃，30min；75℃，10min。反应产物直接用于下一步的滚环扩增步骤。
42.(2.2)滚环扩增
43.滚环扩增步骤中使用新海基因公司的phi292.0 dna聚合酶(a3703a)。随机六聚体引物选用thermo scientific公司的试剂(so142)。dntps均选用thermo scientific公司的试剂，具体的产品信息如下：datp(r0141)，dctp(r0151)，dgtp(r0161)，dttp(r0171)。
44.10
×
phi29缓冲液配置：500mm tris-hcl ph 7.5，100mm mgcl2，100mm(nh4)2so4，
40mm 2-巯基乙醇的水溶液。
45.反应体系配置参见表2。
46.表2
[0047][0048][0049]
表2中反应体系的反应程序设置：42℃，60min；65℃，10min。反应结束后的反应液直接用于下一步的电泳检测。
[0050]
(3)常规方法采用的dna去除以及滚环扩增方案
[0051]
常规方法使用的核酸外切酶为exonuclease v(recbcd)(neb：m0345l)，nbuffer4(10x)为neb试剂公司提供的与核酸外切酶联合使用的反应缓冲液。
[0052]
反应体系配置参见表3。
[0053]
表3
[0054]
组分体积(μl)外泌体总dna10nbuffer4(10x)2exonuclease v1无酶水7
[0055]
表3中反应体系的反应程序设置如下：
[0056]
a、37℃孵育30min；
[0057]
b、加入edta终浓度11mm，灭火终止反应(1.12ul的0.5m edta)；
[0058]
c、70℃加热30min灭活。
[0059]
上述反应产物，可直接用于下一步的滚环扩增步骤。
[0060]
常规的滚环扩增酶主要选用lucigen公司的phi29 dna酶(30221-1)。随机六聚体
引物选用thermo scientific公司的试剂(so142)。dntps均选用thermo scientific公司的试剂，具体的产品信息如下：datp(r0141)，dctp(r0151)，dgtp(r0161)，dttp(r0171)。反应体系配置参见表4。
[0061]
表4
[0062]
组份体积(μl)无酶水62.810x phi29 dna polymerase buffer10随机六聚体引物1dntp mix(2.5mm each)5去除线性dna的反应产物21.2
[0063]
表4中反应体系的反应程序设置为：30℃，24h；65℃孵育10min。反应结束后的反应产物直接用于下一步的电泳检测。
[0064]
(4)将本发明方案和常规方案的滚环扩增产物均进行电泳检测
[0065]
各取20μl本发明方案和常规方案中滚环扩增的产物反应液上样，0.7％的琼脂糖凝胶电泳，100v，40min；电泳结果如图1所示，其中e1，e2，e3为本发明方案的电泳结果，e4，e5，e6为常规方法的电泳结果。由图1可以看到：e1，e2，e3的扩增产物条带均一，相对于e4，e5，e6目标条带区域产物量更大，线性rna的残留更少。由此说明，本发明方案的体系操作时间更短，产物得率更高，纯度也更高。
[0066]
实施例2本发明ecdna建库方案与文献ecdna建库方案对比
[0067]
(1)肿瘤细胞系22rv1外泌体制备以及外泌体总dna提取
[0068]
收取细胞系22rv1无血清细胞培养上清240ml，超高速离心法制备外泌体，之后进行外泌体dna的提取，采用qiagen公司的qiaamp ucp dna micro kit(56204)，详细操作流程见试剂盒说明书。将制备所得的外泌体dna均分为6份，每份10μl，编号依次为s1，s2，s3，s4，s5，s6。其中s1，s2，s3采用本发明方案构建ecdna文库，s4，s5，s6采用文献(full-length sequencing of circular dna viruses and extrachromosomal circular dna using cider-seq，2020)提供方案构建dna文库。
[0069]
(2)本发明方案建库
[0070]
1)外泌体线性dna去除
[0071]
单链核酸外切酶选用北京百奥莱博科技有限公司的核酸外切酶i(mt0087)，双链核酸外切酶北京百奥莱博科技有限公司的λ核酸外切酶(mt0086)。
[0072]
10x反应缓冲液配置：650mm glycine-koh ph9.4，60mm mgcl2，50mm 2-巯基乙醇，500μg/ml bsa的水溶液。
[0073]
反应体系配置如下：
[0074]
组份体积(μl)核酸外切酶i(20u/μl)1λ核酸外切酶(5u/μl)210x反应缓冲液2外泌体总dna10无酶水5
[0075]
反应程序设置：37℃，30min；75℃，10min。反应结束后直接进行下一步的滚环扩增步骤。
[0076]
2)外泌体ecdna滚环扩增及产物纯化
[0077]
外泌体ecdna滚环扩增主要选用新海基因公司的phi29 2.0 dna聚合酶(a3703a)。随机六聚体引物选用thermo scientific公司的试剂(so142)。dntps均选用thermo scientific公司的试剂，具体的产品信息如下：datp(r0141)，dctp(r0151)，dgtp(r0161)，dttp(r0171)。
[0078]
10
×
phi29缓冲液配置：500mm tris-hcl ph 7.5，100mm mgcl2，100mm(nh4)2so4，40mm 2-巯基乙醇的水溶液。
[0079]
反应体系配置如下：
[0080]
组份体积(μl)10
×
phi29缓冲液10phi29 2.0 dna聚合酶2随机六聚体引物1datp1dctp1dgtp1dttp1去除线性dna的反应产物20无酶水63
[0081]
反应程序设置：42℃，60min；65℃，10min。
[0082]
滚环扩增产物纯化：
[0083]
向扩增反应结束后的反应液中加入beckman ampure xp磁珠(beckman，a63880)180μl，震荡混匀，室温静置孵育5min；之后磁吸5min，弃上清；用80％的乙醇200μl洗涤两次；室温干燥5min，加入50μl无酶水重悬磁珠；室温静置孵育2min，磁吸，取上清。
[0084]
3)外泌体ecdna滚环扩增纯化产物超声打断
[0085]
将上一步所得上清液，使用10w的超声功率，超声时间5min。
[0086]
4)打断产物末端修复及a尾添加
[0087]
产物末端修复及a尾添加试剂主要选用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的hiefffast-pace end repair/da-tailing module快速末端修复/a尾添加模块(12608es24)。
[0088]
反应体系配置如下：
[0089]
组份体积(μl)打断产物50end repair/da-tailing buffer(试剂盒组分)6end repair/da-tailing enzyme(试剂盒组分)4
[0090]
反应程序设置：30℃，20min；72℃，20min。
[0091]
5)加接头及产物纯化
[0092]
接头连接试剂选用翌圣生物科技(上海)股份有限公司的hiefffast-pace dna ligation module快速dna连接模块(12607es08)，接头试剂选用hieffcomplete adapter kit forset 1(12615es04)。
[0093]
反应体系配置如下：
[0094]
组份体积(μl)da-tailed dna(试剂盒组分)55
×
fast-pace ligation buffer(试剂盒组分)20fast-pace t4 dna ligase(试剂盒组分)5dna adapter(试剂盒组分)1末端修复产物60无酶水9
[0095]
反应程序设置：20℃，15min。
[0096]
产物纯化：向扩增产物中加入beckman ampure xp磁珠(beckman，a63880)110μl，震荡混匀，室温静置孵育5min；之后磁吸5min，弃上清；用80％的乙醇200μl洗涤两次；室温干燥5min，加入20μl无酶水重悬磁珠；室温静置孵育2min，磁吸，取上清；
[0097]
5)pcr扩增及产物纯化
[0098]
文库扩增试剂选用kapa biosystems的kapa library amplification kit with primers(250x50μl reactions)(kk2621)进行，文库的纯化采用磁珠法进行。
[0099][0100]
反应程序设置如下：
[0101][0102]
pcr扩增产物纯化：
[0103]
向扩增产物中加入beckman ampure xp磁珠(beckman，a63880)90μl，震荡混匀，室温静置孵育5min；之后磁吸5min，弃上清；用80％的乙醇200μl洗涤两次；室温干燥5min，加入20μl无酶水重悬磁珠；室温静置孵育2min，磁吸，取上清，即得构建好的外泌体文库。将构建好的文库，经过illumina novaseq 6000测序仪测序，获得原始数据。实验操做流程大概在7h左右。
[0104]
(3)对比文献方案建库
[0105]
对比文献为2020年发表在nature protocols杂志的full-length sequencing of circular dna viruses and extrachromosomal circular dna using cider-seq，按照文献要求购买相关的试剂，将步骤a制备的22rv1外泌体总dna取10μl进行后续的操作，详细文库构建以及测序流程见文献。实验操做流程大概在45h左右。
[0106]
(4)测序数据分析
[0107]
将本发明专利实验所得数据与文献采用方案所得数据首先使用q30值进行原始数据质控。使用cut adapt软件去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads。使用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上。然后，使用circle-map软件鉴定所有样品中的ecdna。
[0108]
(5)检测结果如下：
[0109]
1)下机数据量以及q30值质控结果如表5所示，本发明提供方案s1-3下机的总数据量在138m到-160m之间，q30质控合格率的在92％-95％之间，文献提供方案s4-6下机的总数据量在90m到-120m之间，q30质控合格的碱基数目也在92％-95％之间，鉴定到的有效数据量如图2所示，s1-3最终的有效数据量在150m左右，s4-6最终的有效数据量在105m左右。
[0110]
结果显示，本发明提供方案可获得更多的有效数据。
[0111]
表5两种方案下机数据量以及q30结果汇总
[0112]
样本名称total readstotal basesq30reads passed filterss1157.040442m19.905798g94.07％157.040442
s2138.924028m18.060700g93.97％138.924028s3158.865016m19.137718g92.37％158.865016s4115.718288m16.448471g92.09％115.718288s5105.751522m15.325580g93.43％105.751522s691.502416m13.284899g94.77％91.502416
[0113]
3)两种方法鉴定到的ecdna的种类分别如图3与图4所示，本发明建库方案三次重复鉴定到的ecdna的数目如s1、s2、s3所示，总计鉴定到的ecdna共计16110条，重复鉴定到的ecdna总计11836条。文献方案三次重复鉴定到的ecdna的数目如s4、s5、s6所示，总计鉴定到的ecdna共计11295条，重复鉴定到的ecdna总计8597条。
[0114]
结果显示，本发明专利提供的ecdna建库方案显著优于文献提供方案鉴定到的ecdna的数目。
[0115]
实施例3本发明ecdna建库方案使用不同样本来源类型的外泌体dna进行测试
[0116]
(1)外泌体制备及外泌体dna制备
[0117]
取3例肝癌患者血浆各4ml，编号依次为n1、n2、n3；3例前列腺癌患者尿液各30ml，编号依次为n4、n5、n6；3例胶质瘤患者脑脊液样本各10ml，编号依次为n7、n8、n9。均采用超高速离心法制备外泌体。制备所得外泌体样本均采用如实施例2所示流程进行dna的制备。
[0118]
(2)外泌体ecdna建库
[0119]
具体操作流程如实施例2所示。
[0120]
(3)外泌体ecdna下机数据质控结果
[0121]
将ecdna的下机数据按照实施例2所示方法进行分析，所得的下机数据量及qc30的结果汇总如表6所示。所有样本的qc30均在90％以上，肝癌血浆外泌体样本下机的数据，过滤后大概在110m到130m之间；前列腺癌患者尿液外泌体样本下机的数据，过滤后大概在105m到125m之间；胶质瘤患者脑脊液外泌体样本下机的数据，过滤后大概在120m到150m之间。
[0122]
表6
[0123]
样本名称total readstotal basesq30reads passed filtersn1137.559278m20.633892g90.93％126.666150mn2119.536072m17.930411g91.99％111.726820mn3138.553734m20.78306g92.07％128.929150mn4124.730394m18.709559g94.04％121.762662mn5109.702520m16.455378g93.78％106.991768mn6123.603190m18.540479g94.20％120.825272mn7125.313792m18.797069g90.99％120.988476mn8135.268224m20.290234g91.23％130.709374mn9148.968000m22.3452g92.43％143.343124m
[0124]
(4)外泌体ecdna下机数据分析
[0125]
将ecdna质控后的结果按照实施例2所示流程进行分析，分析鉴定到的ecdna的数据如表7所示，肝癌血浆外泌体样本鉴定到ecdna数目的大概在12000到14000之间；前列腺癌患者尿液外泌体样本鉴定到ecdna数目的大概在8000到10000之间；胶质瘤患者脑脊液外
泌体样本鉴定到ecdna数目的大概在9000到12000之间。
[0126]
表7
[0127]
样本名称n1n2n3n4n5n6n7n8n9ecdna数目12651135291285995589187879511045980111318
[0128]
综上所述，本发明提供的ecdna建库方案明显优于现有的建库方案，建库的时间明显缩短，而且获取的有效数据量更多；同时，该建库方案也可适用于不同样本类型的检测。
[0129]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

技术特征：
1.一种外泌体来源的ecdna的建库方法，该方法包括以下步骤：(1)外泌体总dna制备；(2)外泌体线性dna去除；(3)外泌体ecdna滚环扩增；(4)滚环扩增产物超声打断；(5)打断产物末端修复及a尾添加、加接头；(6)pcr扩增及产物纯化、测序及数据分析。2.如权利要求1所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用核酸外切酶去除线性dna。3.如权利要求2所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述核酸外切酶采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶两种酶的联合。4.如权利要求3所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述单链核酸外切酶采用核酸外切酶i，所述双链核酸外切酶采用λ核酸外切酶；所述核酸外切酶i在反应体系中的浓度为0.8-1.2u/μl；所述λ核酸外切酶在反应体系中的浓度为0.4-0.6u/μl。5.如权利要求1所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用phi292.0 dna聚合酶。6.如权利要求1所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述步骤(4)中超声打断的超声功率为8-12w，超声时间为4-6min。7.如权利要求1所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述步骤(5)中末端修复及a尾添加的产物直接进行加接头连接，加接头连接产物采用磁珠法进行纯化。8.如权利要求1所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述步骤(6)中pcr扩增产物采用磁珠法进行纯化，获得构建的文库。9.如权利要求8所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述构建好的文库，经过illuminanovaseq 6000测序仪测序，获得原始数据；使用q30值进行原始数据质控；使用cut adapt软件去接头，去低质量reads，获得高质量clean reads；使用bwa软件将clean reads比对到参考基因组上；然后，使用circle-map软件鉴定所有样品中的ecdna。10.如权利要求1所述的外泌体来源的ecdna的建库方法，其特征在于：所述方法适用于不同体液来源的外泌体样本，所述体液为血浆、尿液或脑脊液。

技术总结
本发明公开了一种外泌体来源的ecDNA的建库方法。该建库方法包括：外泌体总DNA制备；外泌体线性DNA去除；外泌体ecDNA滚环扩增；滚环扩增产物超声打断；打断产物末端修复及A尾添加、加接头；PCR扩增及产物纯化、测序及数据分析。本发明采用单链核酸外切酶与双链核酸外切酶联用可以更加高效快速的去除线性DNA，从而最大限度的保证了ecDNA的纯度。另外本发明采用phi292.0DNA聚合酶进行滚环扩增，该聚合酶可以在42℃条件下持续的进行DNA合成，可有效缩短扩增时间，一般在1～2h内即可完成扩增。一般在1～2h内即可完成扩增。一般在1～2h内即可完成扩增。


技术研发人员：王晓楠 马跃 赵小玉 蔡瑶 张亚楠
受保护的技术使用者：上海思路迪生物医学科技有限公司
技术研发日：2022.03.08
技术公布日：2023/9/20