一种缺氧微环境响应溶瘤病毒株的构建及其应用

1.本发明属基因工程技术领域，涉及缺氧微环境响应溶瘤病毒株的构建方法及其应用，具体涉及一种基于副流感病毒piv5-l溶瘤病毒株的构建方法，尤其是涉及肿瘤微环境响应型溶瘤特性的副流感病毒piv5-l株的基因构建及其在应用于单独或联合使用的抗肿瘤疗效中的用途。


背景技术：

2.现有技术公开了副流感病毒5型(piv5)是一种不分节段的单股负链rna病毒，属副黏病毒科、腮腺炎病毒属。研究报道了piv5广泛存在于自然界，人和多种动物均可感染,piv5虽然感染人类，但不诱发人类疾病，其特异性中和抗体可于无临床症状的人血液中检测到。piv5基因组全长15246nt,符合副黏病毒六碱基原则，共包含了7段基因。各基因5’端均有基因起始区，3’端含有基因终止区，相邻基因之间还有长度不一的基因间隔区。基因间隔区分隔各个基因，使其以单独的mrna进行表达，并参与mrna的起始和转录。piv5病毒各个基因独立表达，外源基因的插入对病毒的转录不会产生很大影响。由于其便于反向遗传学操作、基因组稳定和不引起人类疾病等特征，piv5已被广泛用作流感病毒，mers-cov等病毒的疫苗载体。
3.据已有研究报道，piv5可在包括人类在内的多种属原代肾细胞(如仓鼠肾细胞bhk-21，非洲绿猴肾细胞vero等)增殖，其中以原代猴肾细胞最易感，piv5感染细胞后很少引起细胞病变。本研究团队从实验室保存的b淋巴细胞中分离出piv5-l毒株(genbank:mt160087)，经测序鉴定，基因组序列分析结果表明，piv5-l毒株与piv5-ags毒株(genbank:kx060176)序列最为相近，同源性达99％。为进一步了解piv5-l病毒株的致病性，用piv5-l感染除肾细胞以外的细胞，发现piv5-l能感染b淋巴瘤细胞且引起部分b淋巴瘤细胞皱缩裂解性病变。除此以外，研究还发现piv5-l能感染且杀伤黑色素瘤、结直肠癌等肿瘤细胞，但不感染huvec等正常人体细胞。
4.近些年来，溶瘤病毒疗法在肿瘤治疗领域引起广泛关注，溶瘤病毒可以选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终裂解肿瘤细胞，同时会大量释放肿瘤抗原，改善肿瘤微环境。肿瘤微环境是肿瘤组织与其周围组织形成的小生态环境，包括肿瘤细胞本身、肿瘤细胞周围的其他各种细胞，以及浸润其中的生物分子和周围理化环境。肿瘤细胞快速生长的特性导致肿瘤细胞恶性增殖速度快于血管的形成，引发肿瘤内部供血不足而导致一定程度或区域缺氧现象出现，最终形成局部缺氧微环境。
5.溶瘤病毒的现有研究多集中于寻找不同溶瘤病毒的适宜瘤种类型以及肿瘤免疫抑制微环境再激活相关的研究，而肿瘤缺氧微环境靶向性的溶瘤病毒尚未见报道，某些溶瘤病毒在缺氧环境中复制能力受限，所以缺氧微环境也是溶瘤病毒疗法中亟需解决的问题之一。
6.缺氧诱导因子(hypoxia inducible factors,hifs),作为一种对氧气敏感的转录因子超家族。hifs在哺乳动物和人体内广泛存在，在缺氧条件下,稳定表达并激活多种下游
and the oxygen-dependent degradation domain.j control release,2007.121(3):p.218-24.
15.5.koshikawa,n.and k.takenaga,hypoxia-regulated expression of attenuated diphtheria toxin a fused with hypoxia-inducible factor-1alpha oxygen-dependent degradation domain preferentially induces apoptosis of hypoxic cells in solid tumor.cancer res,2005.65(24):p.11622-30.
16.6.ray,a.and m.p.cleary,the potential role of leptin in tumor invasion and metastasis.cytokine growth factor rev,2017.38:p.80-97.
17.7.rivadeneira,d.b.,et al.,oncolytic viruses engineered to enforce leptin expression reprogram tumor-infiltrating t cell metabolism and promote tumor clearance.immunity,2019.51(3):p.548-560.e4.。


技术实现要素：

18.本发明的目的是基于现有技术的现状与基础，提供缺氧微环境响应溶瘤病毒株的构建方法及其应用，具体涉及一种基于副流感病毒piv5-l溶瘤病毒株的构建方法，尤其是涉及肿瘤微环境响应型溶瘤特性的副流感病毒piv5-l株的基因构建及其在应用于单独或联合使用的抗肿瘤疗效中的用途。
19.本发明通过建立反向遗传学操作系统，用于拯救副流感病毒5型l株(piv5-l)，并以此系统将piv5-l改造成具有响应缺氧微环境特异性的靶向杀伤肿瘤的溶瘤病毒。
20.本发明从人b淋巴细胞系中分离出一株未知的病毒株，通过二代测序及逆转录pcr方法对病毒基因组序列进行鉴定。经序列分析后发现其与piv5病毒的序列最为相近，虽与piv5-ags毒株(genbank:kx060176)同源性达99％,但存在一些序列不同，将其命名为piv5-l(genbank:mt160087)。
21.本发明将外源基因egfp嵌合入piv5-l病毒全长基因组cdna中，拯救了表达携带egfp荧光基因的piv5-l-egfp，通过连续传代，结果显示，携带外源基因egfp的重组病毒piv5-l-egfp在vero细胞上可稳定传代10代以上。
22.本发明将人源基因tnf-α(nm_000594.4)嵌合入piv5-l病毒全长基因组cdna中，成功获得了可表达tnf-α的改造毒株piv5-l-tnf-α，通过连续传代，携带外源基因tnf-α的重组病毒piv5-l-tnf-α在vero细胞上可稳定传代10代以上。
23.本发明将人源基因leptin(nm_000230.3)嵌合入piv5-l病毒全长基因组cdna中，成功获得了可表达leptin的piv5-l-leptin，通过连续传代，携带外源基因leptin的重组病毒piv5-l-leptin在vero细胞上可稳定传代10代以上。
24.本发明将hif-1α的氧依赖降解结构域odd(527aa-603aa)区域通过一段gggsgggsgggs连接序列与tnf-α或leptin偶联后嵌合入piv5-l病毒全长基因组cdna中，成功获得了在缺氧环境下选择性表达外源tnf-α或leptin的piv5-l-odd-tnf-α和piv5-l-odd-leptin。
25.本发明通过测序以及逆转录pcr验证重组病毒基因组中含有外源基因，并且通过免疫印迹，免疫荧光等实验证实外源基因在宿主细胞中能正常表达。
26.本发明分别通过cck-8法检测贴壁细胞活力，活细胞计数仪检测悬浮细胞活力，和
结合显微镜成像观察细胞病变状态，检测了不同溶瘤改造病毒株对不同类型肿瘤细胞及正常细胞的杀伤活性。
27.本发明利用c57bl/6小鼠进行b16黑色素瘤皮下成瘤实验，待肿瘤体积达到50mm3以后，将改造后的溶瘤病毒按2x106pfu/100μl/次的剂量注射入瘤内，隔天攻毒一次，共三次。通过检测小鼠肿瘤生长情况以及小鼠生存率来评估改造溶瘤病毒株的溶瘤效果。
28.本发明利用c57bl/6小鼠进行b16黑色素瘤皮下成瘤实验，待肿瘤体积达到50mm3以后，将改造后的溶瘤病毒按2x106pfu/100μl/次的剂量注射入瘤内，隔天攻毒一次，共三次。通过小鼠体内生物发光以及荧光成像技术检测溶瘤病毒经瘤内注射后在小鼠内定位情况，同时通过免疫组化染色判断主要脏器有无病毒感染，以此来评估溶瘤病毒疗法的安全性。
附图说明
29.图1.piv5-l在vero或mdck细胞中的生长曲线。
30.图2.piv5-l能感染多种b淋巴细胞。
31.图3.病毒全长cdna分6段pcr。
32.图4.病毒全长基因组载体pb-bsm的改造。
33.图5.通过in-fusion的方法将病毒基因组的6个片段依次连入pbs-bsm。
34.图6.酶切鉴定含病毒全长基因组的质粒pb-piv5-l-wt构建成功。
35.图7、图8.含有gfp基因的病毒基因组全长cdna克隆载体的构建。
36.图9.辅助质粒的构建。
37.图10.bhk-optt7稳定细胞系的构建。
38.图11.piv5-l-gfp的成功拯救。
39.图12.piv5-tnf-α、piv5-leptin、piv5-odd-tnf-α和piv5-odd-leptin的成功拯救。
40.图13.piv5-l-gfp p0上清能感染vero细胞且在其中复制。
41.图14.免疫荧光染色方法检测重组病毒p/v蛋白在vero细胞中的表达。
42.图15.rt-pcr检测重组piv5-l-gfp病毒基因组的完整性。
43.图16.rt-pcr检测重组溶瘤病毒基因组中存在外源基因。
44.图17.免疫印迹法检测重组溶瘤病毒中外源基因的表达。
45.图18.focus forming assay法检测piv5-l-gfp p0-p2三代的病毒滴度。
46.图19.不同改造株在分别在常氧和缺氧状态下对b16肿瘤细胞的杀伤力。
47.图20.不同改造株在分别在常氧和缺氧状态下对不同肿瘤细胞的杀伤力。
48.图21、图22.溶瘤改造株在c57bl/6小鼠黑色素瘤模型中的溶瘤效果。
49.图23、图24.溶瘤改造株在c57bl/6小鼠黑色素瘤模型中的安全性及靶向性。
具体实施方式
50.下面结合附图，对本发明进行具体描述。
51.实施例1:piv5-l病毒的分离和鉴定
52.piv5-l株源自于实验室保存的某株b淋巴细胞中(命名为bcbl-lk)，经3500rmp，4
℃离心15min后，收集b淋巴细胞培养上清，用easypure viral rna kit(transgen：er201-01)提取上清中rna，经rna-seq测序后与ncbi数据库进行比对分析结果显示，piv5-l毒株与piv5-ags毒株(genbank:kx060176)序列最为相近，同源性达99％。为了解新分离病毒的生长特性，分别用piv5的宿主细胞vero和mdck细胞进行piv5-l生长曲线的测定，如图1所示，piv5-l在感染后3.5d达到病毒生长平台期，最高病毒滴度可达约2
×
107pfu/ml。由于piv5-l在vero和mdck细胞上均无法用传统的病毒蚀斑方法进行病毒滴度的测定，因此本发明采用focus forming assay的方法进行病毒滴度的测定。此外，还用相同的moi分别感染多株b淋巴细胞系,收集感染后1d,3d的细胞，同时收集未感染组的细胞作为阴性对照，进行免疫印迹实验，用v5抗体(cst:13202s)检测细胞中是否表达piv5病毒的蛋白，结果显示，在感染了piv5-l的多株b淋巴细胞中均能检测到p蛋白和v蛋白的表达(图2)，表明分离出来的piv5-l具有感染力且能感染多种b淋巴细胞。
53.实施例2:piv5-l反向遗传学操作系统的建立
54.2.1piv5-l病毒基因组全长cdna和表达载体构建
55.建立piv5-l反向遗传学操作系统，需要构建可稳定表达t7rna聚合酶的bhk21细胞和四个载体：病毒基因组全长cdna克隆载体，蛋白np、p、l的表达载体。首先，从piv5-l的宿主细胞bcbl-lk中提取细胞total rna(tirol法)，逆转录为cdna(逆转录试剂盒：transcript first-strand cdna synthesis supermix，transgen：at301)
56.逆转录体系如下：
[0057][0058]
由于piv5-l基因组全长15246nt，我们采用分段克隆的方法对其进行基因组全长cdna的构建。本发明采用takara的primerstar高保真酶将全长分为6段pcr，6对引物序列如表1，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后(图3)，割胶回收。
[0059]
表1:病毒特异性引物序列
[0060][0061]
pcr体系：
[0062]
[0063][0064]
为了保证病毒基因组3’端的精确性，在3’端的下游引入了丁肝核酶序列，丁型肝炎病毒核酶(hdvrz)是hdv前体rna分子中一段能自我切割的rna序列,具有独特的二级结构,为hdv双滚环复制所必需，它存在分子间切割活性,在rna病毒拯救中被用于切割病毒序列与其它异源rna分子。
[0065]
本发明中此核酶序列由“擎科生物”合成：hdvrz-t7 terminal
[0066]
atcttggttttccccttggt
[0067]
ggccggcatggtcccagcctcctcgctggcgccggctgggc
[0068]
aacattccgaggggaccgtcccctcggtaatggcgaatgggac
[0069]
ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
[0070]
通过overlap pcr将上一步骤的f6片段同合成序列hdvrz-t7 terminal连接，overlap pcr引物如下：
[0071]
f6-f：tcgccagcaacaattactacctgacc
[0072]
piv5-f6-r：tatgaccatgacgcgtcaaaaaacccctcaagac
[0073]
overlap pcr条件：
[0074][0075]
获得f6-hdvrz-t7 terminal后，将以上6个片段：f1-f5，f6-hdvrz-t7terminal的胶回收产物，一部分用于后续连入pbs-bsm，一部分连入pmd20-tvector(takara:6019)，以利于稳定保存基因片段及后续改造。
[0076]
2.2病毒全长基因组载体pbluscriptiisk(+)的改造
[0077]
通过pcr的方法，将pbluscriptiisk(+)的多克隆位点区域改造为仅含bsshii，
snabi，miui三个酶切位点，命名为pbs-bsm，便于后续病毒基因组片段的引入。
[0078]
载体改造引物序列：
[0079]
pbs-f:5’gatctacgtaacgcgtcatggtcatagctgtttcctgtgtg 3’[0080]
pbs-r:5’ccaatacgtagcgcgctcactggccgtcgttttacaacgtc3’[0081]
pcr条件：
[0082][0083]
将上述pcr产物割胶回收以后，用snabi进行酶切，酶切产物经过pcr-clean以后通过t4连接酶对酶切产物进行连接。连接产物转化感受态获得改造成功的载体，如图4所示，改造后的载体可被snabi、miui酶切，而不可被原有酶切位点kpni酶切。
[0084]
酶切体系
[0085][0086][0087]
t4连接酶连接体系
[0088][0089]
2.3将2.1的6个片段通过in-fusion的方法(图5)依次连入pbs-bsm
[0090]
第一步：载体pb-piv5-l-1的构建
[0091]
酶切pbs-bsm,获得线性化载体
[0092]
酶切体系：
[0093][0094]
pcr扩增片段f1、f2，f1的上游引物中引入t7启动子序列及与载体酶切位点snabi左侧同源的20bp碱基序列，f2的下游引入与载体酶切位点miui右侧同源的20bp碱基序列,片段扩增引物具体序列见表1。
[0095]
通过无缝克隆技术(同源重组法)连接f1,f2片段入载体
[0096]
按照pbs-bsm(vector)：f1：f2＝1:2:2的摩尔比配置in-fusion体系：
[0097]
pb-piv5-l-1的连接体系：
[0098][0099][0100]
连接后的体系，用stbl3感受态细胞进行转化，具体转化步骤如下：
[0101]
将上一步骤的20μl连接产物样品20μl加入到100μl stbl3感受态细胞中，轻轻混匀，将该混合物置于冰上30min。
[0102]
42℃水浴中热激90秒，然后迅速放回冰浴中，静置3～5min。
[0103]
加入lml不含抗生素的lb培养液，轻轻混匀，30℃震荡培养1h。
[0104]
将菌液13000rpm离心1min以沉淀菌体。吸去大部分培养液，剩余约50-100μl的培养液，重悬菌体。然后全部均匀涂布到含amp+抗生素的lb平板上，30℃培养箱中培养过夜。
[0105]
第二天(16h-20h)挑取平板上的单克隆进行菌落pcr,从pcr阳性克隆中选3-4个克隆送sanger测序鉴定。
[0106]
第二步：载体pb-piv5-l-2的构建
[0107]
酶切pb-piv5-l-1,获得线性化载体，酶切体系同上；pcr扩增f3、f4，无缝克隆连
接，步骤同上，形成载体pb-piv5-l-2。
[0108]
第三步：载体pb-piv5-l-wt的构建
[0109]
酶切pb-piv5-l-2,获得线性化载体，酶切体系同上；pcr扩增f5、f6，其中f6与hdvrz及t7 terminal序列通过overlap pcr连接在一起形成f6-hdvrz-t7 terminal，通过无缝克隆连接f5，f6-hdvrz-t7 terminal入pb-piv5-l-2，步骤同上，形成载体pb-piv5-l-wt，载体全长经测序再次验证后经xbai酶切鉴定,如图6所示，由于pb-piv5-l-wt上有两个xbai的酶切位点，可被xbai酶切成10504bp和7776bp两个片段。
[0110]
2.4含有gfp基因的病毒基因组全长cdna克隆载体的构建
[0111]
在hn基因和l基因之间插入外源基因，外源基因的基因转录起始和终止序列分别用v/p transcription initiation site：aggcccggacgggt和np transcription termination site：ttttaagaaaaaag。
[0112]
外源基因gfp的引入：用ncoi和avrii对上一步骤获得的pb-piv5-l-wt质粒进行双酶切，被切掉的小片段包括hn基因的第588位碱基到l基因的第2577位碱基之间的区域。然后将hn基因被切掉的部分，gfp基因以及l基因被切掉的部分分三段pcr，三个片段的示意图如图7所示，三个片段的pcr引物序列如表2。通过in-fusion技术将三个片段连回被切开的线性化载体中，获得pb-piv5-l-gfp质粒，同时，在gfp基因首尾分别引入了sali和noti酶切位点，利于后续任意外源基因的插入，pb-piv5-l-gfp质粒经sanger测序和酶切鉴定质粒构建成功，如图8所示，pb-piv5-l-gfp质粒经sali和noti双酶切后，在700bp附近可见一个等同于gfp基因大小的片段，而pb-piv5-l-wt质粒无法被sali和noti双酶切。
[0113]
表2：引物序列
[0114][0115]
2.5含有其它外源基因的病毒基因组全长cdna克隆载体的构建
[0116]
酶切质粒pb-piv5-l-gfp
[0117][0118][0119]
酶切结束后，0.8％琼脂糖凝胶分离18kb的大条带，割胶回收。
[0120]
构建重组质粒pbs-piv5-tnf-α,pbs-piv5-leptin，pbs-piv5-bh3，pbs-piv5-odd-tnf-α,pbs-piv5-odd-leptin，pbs-piv5-odd-bh3；
[0121][0122]
连接结束后，转化stbl3感受态，转化步骤同前。
[0123]
18-20h后，任意挑10个菌落做菌落pcr，菌落pcr阳性的克隆送sanger测序，测序应测通病毒全长基因组，构建成功的质粒大抽后放-20℃长期保存。
[0124]
质粒大抽步骤：将重组质粒在stbl3感受态细胞中进行转化，30℃培养18h后挑取单个克隆，30℃，220rpm活化10h,按1:500将活化后的菌液接种至新鲜lb培养基中(例：400μl:200ml)，30℃，220rpm，12-14h。可进行后续质粒大抽实验。
[0125]
2.6辅助质粒构建
[0126]
辅助质粒以ptm1(ptm1载体来源于ptm1-vp30,addgene:69119)为载体，分别插入np,p,l三个基因。
[0127]
ptm1-np和ptm1-p的构建：先通过ecori和sali双酶切将质粒ptm1-vp30线性化，基因np和p以pb-piv5-l-wt为模板进行pcr，pcr产物割胶回收后经ecori,sali酶切，然后同酶切后的ptm1-vp30经t4连接酶法连接(酶切产物均经pcr-clean方式纯化)，连接产物转化stbl3，阳性克隆经测序验证(步骤同前)。
[0128]
[0129][0130]
ptm1-l的构建：通过ncoi和sali双酶切将质粒ptm1-vp30线性化，基因l以pb-piv5-l-wt为模板进行pcr，由于l基因较大，分两段扩增l基因，扩增引物如下：
[0131][0132]
pcr经割胶回收后同线性化的质粒经过in-fusion方法连接，连接体系同前。
[0133]
2.7 bhk-optt7稳定细胞系的构建
[0134]
采用plenti-cmv-gfp-hygro慢病毒转导系统构建稳定表达t7rna聚合酶的bhk-optt7稳定细胞系，具体构建过程如下：
[0135]
1)构建慢病毒包装质粒plvx-optt7rnap-hygro
[0136]
首先用xbai和sali对质粒plenti-cmv-gfp-hygro进行双酶切，以去掉其gfp基因，然后同经pcr扩增的optt7rnap基因序列通过in-fusion连接，optt7rnap为经过真核密码子优化的t7 rna聚合酶基因，该基因从质粒pcaggs-optt7扩增而来(购自addgene：65974)。
[0137]
optt7rnap扩增引物：
[0138]
f：ctccatagaagacaccgactctagaatgggcggggagggcctt
[0139]
r：tccgatttcgcatttgcctgagtcgacaatcaacctctggattacaa
[0140]
质粒经测序验证构建成功后，放-20℃保存,用于后续慢病毒包装。
[0141]
2)慢病毒的包装
[0142]
转染前20个小时，将生长状态良好，无支原体污染的293t细胞按0.75个million/well/ml在12孔板中铺板。
[0143]
转染体系：
[0144]
plvx-optt7rnap400ngpspa400ngvsvg200ngfugene hd4μlopti-mem补至总体积75μl
[0145]
室温孵育15min。
[0146]
从原培养基中吸弃300μl培养基,然后逐滴缓慢加入转染液，混匀。
[0147]
转染后48小时，收培养液上清，3500rpm,10min,50μl/支分装上清，放-80℃备用。
[0148]
3)慢病毒的转导
[0149]
转导前一天将细胞铺至12孔板，待长至约70％汇合度，加入100μl病毒至含有6ug/ml polybrene的培养基中，30℃，1000g离心30min，37℃c再放置1小时后，弃掉含病毒的培养基，换为新鲜培养基。病毒转导后24小时，加入750ug/ml的hygromycin b进行筛选。
[0150]
4)bhk-optt7细胞系的验证
[0151]
为了验证bhk-optt7细胞系能否发挥t7rna聚合酶活性，首先验证了经t7启动子驱动的ptm1-p和ptm1-np-2flag-c是否表达，将质粒pcaggs-optt7与ptm1-p或ptm1-np-2flag-c共转染293t细胞，24h后，收细胞做western检测，如图9所示，在有pcaggs-optt7共转染的细胞中，ptm1-p和ptm1-np-2flag-c质粒均能表达。
[0152]
随后将上述已经证实可以在t7rna聚合酶驱动下表达的质粒ptm1-np-2flag-c单独转染进bhk-optt7细胞，转染后24h收蛋白做western检测，结果如图10所示，ptm1-np-2flag-c质粒能在bhk-optt7细胞系中表达。以上实验证实，构建的bhk-optt7细胞系能表达t7rna聚合酶且发挥其聚合酶活性。
[0153]
2.8 piv5-l的拯救
[0154]
1)piv5-l拯救步骤(以rpiv5-l-gfp为例)
[0155]
提前一天将bhk-optt7细胞按4x105/well在6孔板中铺板,大约70％汇合度时，转染，转染前换新鲜6％fbs dmem,无抗培养基，转染体系如下：
[0156]
pb-piv5-l-gfp3ugptm1-np-2flag-c1ugptm1-p0.2ugptm1-l1.5ugfugene hd(1:4)23μlopti-mem200μl total
[0157]
混匀，室温静置15min后，将转染体系逐滴加入6孔板中，然后放回37℃细胞培养箱培养，每天观察，转染后第3d，如图11所示，rpiv5-l-gfp组可见微弱荧光团出现，转染后第4d、第5d,荧光团数量逐渐增强，亮度逐渐增强，白光下可见多个细胞核被同一层细胞膜包裹的多核巨细胞，即合胞体。合胞体(syncytia)是病毒感染的一种现象。有的病毒感染了宿主细胞后，会促使宿主细胞和周围的同类的细胞融合，并最终形成多核巨细胞。由于rpiv5-tnf-α,rpiv5-leptin，rpiv5-odd-tnf-α,rpiv5-odd-leptin等病毒中不含gfp基因，表明只能通过观察合胞体来判断是否有病毒产生，如图12所示，均可见合胞体产生。
[0158]
转染后5d,收上清，3500rpm(1800g),4℃，离心15min,将上清按照500μl/支分装后，命名为p0，放-80℃保存。
[0159]
2)病毒拯救验证
[0160]
a、验证上一步骤收集的病毒上清p0中是否含有病毒
[0161]
取上一步骤收集的病毒上清500μl感染vero细胞(vero细胞提前一天按照0.2x106/well,24-well plate铺板)，37℃，2h后换500μl新鲜6％fbs dmem，含三抗的培养基。感染后，每天观察vero细胞培养基有无变黄，细胞有无病变以及荧光产生。如图13所示，感染后1d、2d、3d,绿色荧光逐渐增强，反映病毒在vero细胞中复制(左边绿色为gfp通道，右
侧为与明场merge后)，表明收集的p0上清中有病毒且病毒能够正常复制。
[0162]
感染后5d，3500rpm,4℃离心15min收上清，200μl/支分装，放-80℃保存，命名为p1。
[0163]
b、病毒特异性抗体免疫荧光染色
[0164]
对于rpiv5-odd-tnf-α,rpiv5-odd-leptin,采用免疫荧光染色方法判断拯救的重组病毒能否感染vero细胞，如图14所示，以上三个重组病毒感染vero后均可被v5抗体检测出(红光)，代表病毒v/p基因的表达。免疫荧光染色步骤如下：vero细胞经pbs洗三次后，用4％fpa室温固定15min，pbs洗三次后开始免疫荧光染色。孵育一抗，v5抗体(cst:anti-v5)按照1:500稀释至blocking buffer中(blocking buffer：含0.02％tixton-100，1％fbs的pbs)，每孔加入150μl稀释后的抗体室温孵育2h。blocking buffer洗三次后，孵二抗，将goat-anti rabbit 594按照1:1000稀释至blocking buffer中，每孔加入150μl稀释后的抗体室温孵育1h。blocking buffer洗三次后，每孔加入150μl按1:1000稀释于pbs中的dapi，室温避光5min，pbs洗三次，荧光显微镜拍照。
[0165]
c、rt-pcr法检测病毒上清p1中病毒基因组的完整性
[0166]
采用试剂盒transgen：er201-01提取上清中的病毒基因组rna，具体步骤如下：
[0167]
加入20μl proteinase k于一个无菌的1.5mlep管中。加入200μl bb5,涡旋混合15s。在ep管中加入200μl病毒上清，涡旋混合15s，56℃孵育15min。加入250μl无水乙醇(此时可能会出现絮状沉淀)，涡旋混合15s，室温放置5min。将溶液和沉淀一起加入离心柱中，12000g离心1min,弃掉流出液。加入500μlwb5,12000g离心1min,弃掉流出液。重复一次本步骤。室温12000g离心1min，彻底去除残留的乙醇。将离心柱转入一个新1.5mlrnase-free的ep管中，并向离心柱中央加20μl rnase-free ddh2o，室温静置1min。室温12000g离心1min，洗脱rna。将rna置于-80℃保存或者立即进行逆转录。采用翊圣生物的ii 1st strand cdna synthesis supermix for qpcr试剂盒(yeasen:11123es60)进行逆转录，具体操作步骤如下：
[0168]
在rnase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2min以去除残留基因组dna。
[0169][0170][0171]
在上述反应管中直接加入10μlii supermix plus，用移液器轻轻吹打混匀。按照25℃ 5min；42℃ 30min；85℃ 5min的程序进行孵育。
[0172]
逆转录产物可立即用于pcr反应或者放-20℃短期保存。
[0173]
以逆转录的cdna为模板,共10对引物检测病毒基因组完整性，均采用两步法pcr程序，引物序列如表3，检测结果如图15所示，10段均能检测出，证明重组病毒的基因组无缺失现象。
[0174][0175]
表3：10对引物序列
[0176]
[0177][0178]
对于含有外源基因的三株重组病毒，本发明用针对外源基因的引物检测上清中病毒基因组rna中是否含有外源基因，如图16所示，均能检测出对应的外源基因存在于病毒基因组中。
[0179]
d、免疫印迹法(wb)检测感染重组病毒的vero细胞中外源基因的表达
[0180]
rt-pcr法只能判定病毒基因组中含有外源基因的序列，但外源基因是否表达，需要从蛋白水平验证，如图17所示，病毒感染后，分别在常氧和缺氧培养箱培养细胞，48h后收样检测外源蛋白的表达，结果显示外源蛋白odd-tnf-α,odd-leptin在缺氧环境下表达水平更高。
[0181]
免疫印迹的具体步骤如下：
[0182]
取400μl p1病毒/孔感染铺于6孔板中的vero细胞，每种病毒感染两个孔，两个孔分布于两个6孔板上，感染步骤同前。感染2h后换液后，将其中一个6孔板放入含1％o2,5％co2的缺氧培养箱培养，另一个板继续放原培养箱(即含21％o2,5％co2)培养。
[0183]
48小时后，从培养箱中取出6孔板，迅速弃掉上清，用pbs洗两次后，每孔加入1ml pbs，用细胞刮将细胞刮下后，连同pbs收集至1.5mlep管中，1500g离心5min，吸弃上清。
[0184]
加入50μl ripa蛋白裂解液(1％np-40,2mm edta，150mm nacl,50mm tris,1mm pmsf,1g/ml aprotinin,1g/ml leupeptin and 1g/ml pepstatin)至ep管，重悬细胞，冰上裂解30min，期间每5min涡旋震荡一次，使其充分裂解后，4℃14500rpm离心5min，转移上清至新的预冷1.5ml ep管，冰上放置，取1μl用于检测蛋白浓度。
[0185]
每个样品取200ug的总蛋白，加入含ddt的6
×
sds loading buffer，100度金属浴加热10min使蛋白变性。
[0186]
将变性后的样品加入10％sds-page胶上样孔中进行凝胶电泳，恒压80v，40min；100v，约90min，直至溴酚蓝指示带跑到分离胶底部，停止电泳。
[0187]
将nc膜(6cm x 9cm)放在1
×
膜平衡液中浸润30s，取出转膜片夹，按照正极-干海绵垫-nc膜-凝胶-干海绵垫-负极的顺序安装转膜片夹。
[0188]
使用eblottm l1快速湿转仪，按设定程序转膜10min。
[0189]
封闭：将转膜结束后的nc膜放进5％脱脂牛奶(用pbs配制)中室温孵育0.5-1h后，用1
×
tbst洗膜3次，5min/次。
[0190]
孵育一抗：按照1:1000稀释比使用1
×
tbs缓冲液配置鼠源tnf-α(ag11413)及鼠源flag(m2)一抗，将nc膜置于配置好的抗体中，4℃摇床孵育过夜。洗膜：1
×
tbst洗3次，5min/次。
[0191]
孵育二抗：使用山羊抗兔荧光二抗800(pbs稀释1:10000)室温避光孵育1h后，用1
×
tbst洗3次，5min/次。
[0192]
最后使用odyssey双色红外激光成像系统进行成像和分析。
[0193]
2.9用focus forming assay测病毒滴度
[0194]
为了后续的量化实验，对病毒进行定量，本发明采用focus forming assay法进行病毒滴度的测定，图18为piv5-l-gfp不同代次的滴度测定结果图。具体步骤如下：
[0195]
铺板：提前2d在96孔板中将vero细胞以2x104/孔铺板，两天后汇合度达到100％时做感染。
[0196]
感染：先在无菌96孔u形板中加入180μl 2％fbs的dmem培养基，然后在第一排的孔中加入20μlvirions/孔,设两个副孔，混匀。然后进行倍比稀释,用排枪依次取20μl前一排的病毒稀释液到下一排，稀释至10-6
。
[0197]
在生物安全柜中甩掉96孔细胞培养板中的细胞培养液，从u形板中每排取100μl病毒稀释液加入细胞培养板中，标记上病毒稀释倍数。
[0198]
将细胞培养板放37℃细胞培养箱，2h后加每孔加125μl甲基纤维素(2xdmem，2％fbs)覆盖，甲基纤维素应提前放37℃预热。
[0199]
染色：感染后3d,加100μl 2％pfa/孔，室温固定40min，用含有0.02％txiton-100，1％fbs的pbs(blocking buffer)洗三次，150μl/孔/次。每次甩板尽量将blocking buffer残留液甩干，但不能使细胞干掉。
[0200]
孵育一抗：用blocking buffer按1:1000稀释一抗(anti-v5)，然后每孔加入40μl稀释后的一抗，室温孵育2h以上或者4℃过夜。甩掉一抗，blocking buffer洗三次，150μl/孔/次。
[0201]
孵育二抗：用blocking buffer按1:2500稀释二抗(goat anti rabbit hrp)，然后每孔加入50μl稀释后的二抗，室温孵育2h以上。甩掉二抗，blocking buffer洗三次，150μl/孔/次。
[0202]
加hrp底物trueblue,30μl/孔，室温放置20-40min，可见蓝色斑点出现，(当板子背景变蓝时，立即终止显色)。
[0203]
终止显色：用ddh2o水洗三次后，晾干，在显微镜下数每个孔中的斑点个数，尽量在24h内完成数点。避光保存板子。
[0204]
计算病毒滴度：以可数出点的孔为准，一般为20-50个斑点以内的孔。将这个孔几个副孔的平均值*这个孔稀释的倍数*10＝pfu/ml。
[0205]
实施例3:不同改造溶瘤病毒株的溶瘤效果
[0206]
3.1 cck8法检测piv5-odd-tnf-α,piv5-odd-leptin的杀细胞效果
[0207]
本发明检测了黑色素瘤，结直肠癌，淋巴瘤三种瘤种类型的鼠源或者人源细胞。提前一天按3x104/孔将肿瘤细胞铺板至96孔板中，24小时后，待细胞长至70％以上的汇合度，按照moi＝0.1，1，10加入溶瘤病毒株至不同的肿瘤细胞中，每种moi设有三个副孔。感染步骤同前，感染后，将同一种细胞系分别放常氧和缺氧培养，培养48h后，甩掉原培养基，按照1:10的体积比将cck8原液稀释至无血无抗的dmem中，每孔加入100μl稀释后的cck8溶液。37℃孵育30min-1h后，450nm波长检测吸光度值，根据公式计算细胞活力。结果如图19所示,cck8实验结果显示在常氧下所有的重组病毒株对小鼠黑色素瘤细胞b16杀伤效果无明显差异；而当缺氧处理时，piv5-tnf-α,piv5-leptin的杀细胞效果减弱，piv5-odd-tnf-α,piv5-odd-leptin的杀细胞效果不变甚至略微增强。说明odd区域的连入能稳定外源蛋白在缺氧环境下的表达，从而增强rpiv5s的杀细胞效果。本发明还检测了piv5-odd-tnf-α和piv5-odd-leptin以及两者联用其他肿瘤细胞中的细胞毒性。如图20所示，无论是rpiv5-odd-tnf-α还是piv5-odd-leptin，在hct116、rko或sw480中，即使在缺氧条件下也不能诱导细胞毒性；而当piv5-odd-tnf-α/piv5-odd-leptin联合感染，在moi＝10时可杀死约30％的htc116。在缺氧状态下，piv5-odd-leptin可以靶向hela，显著抑制hela的活力。另外，piv5-odd-tnf-α/piv5-odd-leptin联合感染可在一定程度上抑制siha在缺氧状态下的活力。对于小鼠结直肠癌细胞mc38，在常氧下，对piv5改造株均敏感，在缺氧下，仅对piv5-odd-tnf-α和piv5-odd-leptin敏感。结果显示，改造的溶瘤毒株针对不同的肿瘤类型具有不同程度的选择性，且具有缺氧微环境敏感性。
[0208]
3.2改造溶瘤病毒株对b16黑色素瘤模型的治疗效果
[0209]
为了研究重组溶瘤病毒的抗肿瘤作用，本发明建立了b16黑色素瘤皮下成瘤模型，当肿瘤体积大于50mm3时，采用瘤内注射溶瘤病毒的方式对荷瘤小鼠进行治疗。将改造后的溶瘤病毒按2x106pfu/100μl/次的剂量注射入瘤内，隔天攻毒一次，共三次。设置了重组病毒piv5-odd-tnf-α,piv5-odd-leptin，单独处理组，以及piv5-odd-tnf-α/piv5-odd-leptin联合组共3组实验组，并设有dmem处理组及piv5-l-gfp组作为对照组。如图21所示，在瘤内注射病毒后，相比于对照组，实验组的肿瘤生长均受到了一定程度的抑制，其中piv5-odd-tnf-α+piv5-odd-leptin联合组最为明显，有两只小鼠的肿瘤完全消失，小鼠60天生存率达到40％。he染色发现，实验组的肿瘤细胞/间质细胞之比减低，其中piv5-odd-tnf-α+piv5-odd-leptin联合组减低最明显(图22)。此外，本发明还检测了经瘤内注射后溶
瘤病毒的定位情况，在注射病毒后的第7天，通过ivis光谱成像系统检测piv5-l-gfp的gfp定位，发现仅在肿瘤部位可见gfp荧光(图23a)；在注射病毒后的第15天，通过免疫组化染色检测主要脏器中p/v蛋白的表达情况，仅在肿瘤组织中能检测到p/v的表达(图23b)，证明经瘤内注射rpiv5s时，病毒可以有效地靶向肿瘤部位。同时，通过免疫组化和免疫印迹实验检测出肿瘤组织中外源性蛋白和病毒p/v蛋白的表达(图23c,23d)。此外，通过肿瘤组织的免疫荧光染色，结果显示piv5-odd-leptin治疗组的leptin比piv5-leptin更容易被招募到hif2α表达区(图24)，说明odd区域的偶联使外源蛋白在缺氧环境中更稳定。
[0210]
综上所述，实验数据表明，经瘤内注射治疗小鼠时，piv5改造株仅在肿瘤组织中表达外源性蛋白而不扩散到其他脏器，odd区域的偶联使外源蛋白具有缺氧微环境靶向性。

技术特征：
1.一种缺氧微环境响应溶瘤病毒株的构建方法，其特征在于，所述的溶瘤病毒株是基于副流感病毒piv5-l溶瘤病毒株，所述方法包括：piv5-l病毒株的分离和鉴定，携带外源基因和响应缺氧微环境溶瘤特性的基因改造。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括分别携带表达tnf-α和leptin外源基因溶瘤病毒株piv5-tnf-α和piv5-leptin的构建。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括分别携带对缺氧应激响应表达odd-tnf-α和odd-leptin外源基因溶瘤病毒株piv5-odd-tnf-α和piv5-odd-leptin的构建。4.如权利要求2和3所述的方法，其特征在于，构建的溶瘤病改造毒株对不同类型肿瘤细胞及正常细胞具杀伤活性。5.如权利要求2和3所述的方法构建的溶瘤病改造毒株在用于制备抗肿瘤治疗制品中的用途。6.如5所述的用途，其特征在于，构建的溶瘤病改造毒株单独或联合使用。

技术总结
本发明属基因工程技术领域，涉及缺氧微环境响应溶瘤病毒株的构建方法及其应用，具体涉及一种基于副流感病毒PIV5-L溶瘤病毒株的构建方法，本发明中对一种源自人B细胞的新型副流感病毒株PIV5-L进行携带表达外源基因TNF-α和Leptin及其靶向肿瘤缺氧微环境的溶瘤特性的基因改造，包括：PIV5-L病毒株的分离和鉴定，携带外源基因和响应缺氧微环境溶瘤特性的基因改造及其单独或联合使用的抗肿瘤疗效。本发明还包括上述改造溶瘤病毒株用于对不同类型肿瘤的治疗应用。型肿瘤的治疗应用。


技术研发人员：蔡启良 刘晓庆 郑丽兰 都树娟 朱彩霞 王玉燕
受保护的技术使用者：复旦大学
技术研发日：2022.03.10
技术公布日：2023/9/20