控制马齿玉米转变成硬粒型玉米的关键基因

1.本发明属于玉米育种技术领域，具体地说，涉及一种控制马齿玉米转变成硬粒型玉 米的关键基因及其在改良和创制硬粒型玉米种质资源中的应用。


背景技术：

2.以利用杂种优势为核心的遗传种质改良始终是现代杂交玉米育种的基石。硬粒型 (flint)和马齿型(dent)玉米是育种学家和遗传学家以及大家都广为熟知的两种玉米 籽粒类型，是玉米育种的一个重要农艺性状，但这个性状由微效多基因控制，分子遗传 机制复杂。因此，在人类漫长的玉米栽培和遗传改良史上，硬粒和马齿玉米形成的分子 遗传机制还不清楚，控制硬粒、马齿形成的基因也还没被克隆。目前生产上只能通过传 统育种方法对硬粒、马齿玉米进行遗传改良和种质创新，费时费力，效率较低。长久以 来，一直缺乏能够直接应用于育种实践，快速、高效、低成本的改良硬粒、马齿玉米的 基因。
[0003][0004]
随着现代分子生物学的发展，多个玉米自交系的基因组先后被测序解析，包括经典 的马齿玉米b73、mo17和w22，热带玉米sk和k0326y以及4个重要欧洲硬粒玉米 f7、ep1、dk105和pe0075(schnable,p.s.,et al.(2009).the b73 maize genome: complexity,diversity,and dynamics.science,326(5956),1112-1115.hirsch,c.,et al., (2016).draft assembly of elite inbred line ph207 provides insights into genomic andtranscriptome diversity in maize.plant cell 28,2700
–
2714.springer,n.m.,et al.,(2018) the maize w22 genome provides a foundation for functional genomics and transposonbiology.nature genetics,50,1282
–
1288.yang,n.,et al.,(2019).genome assembly of atropical maize inbred line provides insights into structural variation and crop improvement. nature genetics,51,1052
–
1059.li,c.,et al.,(2020).long-read sequencing revealsgenomic structural variations that underlie creation of quality protein maize.naturecommunications 11,17.li 2020.haberer,g.,et al.,(2020).european maize genomeshighlight intraspecies variation in repeat and gene content.nature genetics,52,950
–
957.)。 这些高质量的基因组信息揭示了玉米遗传多样性的奥秘，为玉米遗传育种和玉米重要农 艺性状的遗传改良奠定基础。同时，近年来我们在玉米籽粒相关农艺性状的研究，包括 籽粒早期发育(yongcai,huang,et al.,(2019).maize vks1 regulates mitosis andcytokinesis during early endosperm development.the plant cell,31(6):1238-1256.)、玉 米硬粉质胚乳形成(wang,h.,et al.,(2020).carotenoids modulate kernel texture in maizeby influencing amyloplast envelope integrity.nature communications 11,5346.)、玉米胚乳 灌浆调控等方面取得的一系列突破和积累，为解析硬粒、马齿玉米形成的分子遗传机制 奠定基础。


技术实现要素：

[0005]
为了攻克玉米种质资源形成与演化规律、重要性状形成的分子基础等重大科学问 题，揭示复杂性状形成的分子遗传机制，快速创制玉米新种质和改良自交系，研发强优 势杂交种，进一步挖掘玉米增产潜力，我们从2016年开始，经过不懈努力、艰苦探索 和严密论证下，终于发现并克隆到一个控制玉米从马齿型转变成硬粒型玉米的关键基因 fln1，编码转录因子zmarf17，其突变失活会促进黄酮在种皮中的积累，降低生长素 含量，从而影响种皮发育，导致硬粒玉米的形成，可以使绝大多数玉米变为硬粒型玉米。 这不仅大大增加对硬粒、马齿这对重要性状形成的认识，并且使硬粒玉米的遗传改良及 种质资源创新变得更加高效、便捷。
[0006]
基于这一重要发现，本发明的第一个目的在于提供一种改良和创制硬粒型玉米种质 资源的方法，包括下述步骤：使玉米基因组中arf(auxin response factor，生长素响应 因子)转录因子zmarf17的编码基因功能丧失或下调，即，失活或者下调表达arf 转录因子)，导致马齿型玉米向硬粒型玉米转变、或者增强硬粒表型。
[0007]
上述arf转录因子zmarf17(简称fln1)的氨基酸序列可以为seq id no:1， ncbi登录号为zm00001d014013；该arf转录因子zmarf17的编码基因的核苷酸序 列为seq id no:2，本文中命名为fln1。
[0008]
seq id no:1和seq id no:2分别是马齿玉米b73中zmarf17蛋白的氨基酸序 列和编码基因序列。
[0009]
上述方法可以通过下述可选的方式实施：
[0010]
(1)敲除玉米基因组中arf转录因子的编码基因fln1比如seq id no:2；
[0011]
(2)下调玉米基因组中arf转录因子编码基因fln1比如seq id no:2的表达 水平；
[0012]
(3)用编码功能丧失或下调的arf转录因子基因突变体替代玉米基因组中arf 转录因子编码基因fln1比如seq id no:2，使得玉米中arf转录因子失活或者功能 衰减；或者
[0013]
(4)使arf转录因子编码基因与其三个同源基因同时发生突变，它们的突变体 导致原有功能失活或者下调，所述三个同源基因分别是核苷酸为seq id no:7的 zmarf2(ncbi登录号为zm00001d032683，zmarf2基因cds区)、核苷酸为seq idno:9的zmarf19(ncbi登录号为zm00001d014507，zmarf19基因cds区)和核苷 酸为seq id no:9的zmarf21(ncbi登录号为zm00001d000358，zmarf21基因cds 区)。
[0014]
上述方式中，方式(1)中arf转录因子编码基因的敲除、方式(2)中基因突 变体的替代、方式(3)中基因的突变都可以通过基因编辑技术实施，所述基因编辑采 用crispr-cas9系统、crispr-cas12系统、crispr-cpf1系统、crispr-cas相关 的转座系统integrate系统或者cast系统。
[0015]
在本文中，arf转录因子基因突变体表示为fln1-m；zmarf2基因表示为arf2
wt
， zmarf2基因突变体表示为arf2m或arf2
cr
；zmarf19基因表示为arf19
wt
，zmarf19基 因突变体表示为arf19m或arf19
cr
；zmarf21基因表示为arf21
wt
，zmarf21基因突变 体表示为arf21m或arf21
cr
，其中“cr”是基因编辑系统crispr-cas的缩写，意味 着通过基因编辑技术实现基因突变。
[0016]
其中，方式(2)可以选自下组：
[0017]
(2-1)对arf转录因子的编码基因fln1比如seq id no:2启动子区进行突变 导致
tacattcctactccgctttg；反向引物arf17
cr-r：cctgccctaccctcatac。pcr 产物为1798bp；测序引物为arf17
cr-测序：cgctcccgtgtctacta；target序列为 gtgctcgccaaggacgtgca。pcr检测可以用kod fx neo高保真酶(kfx-201t， toyobo)及其pcr程序。序列分析网址为：http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/；模板序列 为seq id no:12，作为fln1-m3或fln1-m4分子标记。
[0036]
5.检测arf2
cr
时，正向引物arf2
cr-f：acgaagaggaggaggagt；反向引物 arf2
cr-r：tcaggtgggctacaaaca。pcr产物为1349bp；测序引物为arf2
cr-测序： cgctcccgtgtctacta；target序列为gtgcttgccaaggacgtgca。pcr检测 用kod fx neo高保真酶(kfx-201t，toyobo)及pcr程序。序列分析网址为： http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/；模板序列为seq id no:13，作为arf2
cr
分子标记。
[0037]
6.检测arf19
cr
时，正向引物arf19
cr-f：ccccttgctttcttctcac；反向引物 arf19
cr-r：gccgccgtggacgccttc。pcr产物为1987bp；测序引物为arf19
cr-测序： gtgcctggacccgcagctgtgg；target序列为gtgctcgccaaggacgtgca。pcr 检测可以用kod fx neo高保真酶(kfx-201t，toyobo)及pcr程序。序列分析网 址为：http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/；模板序列为seq id no:14，作为arf19
cr
分子标 记。
[0038]
7.检测arf21
cr
时，正向引物arf21
cr-f：cccgaatccgtcgttaccc；反向引物 arf21
cr-r：gctttgagatgccgtcctt。pcr产物为1599bp；测序引物为arf21
cr-测序： caattcccgccgaaaccg；target序列为gtgctcgccaaggacgtgca。pcr检 测可以用kod fx neo高保真酶(kfx-201t，toyobo)及pcr程序。序列分析网址 为：http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/；模板序列为seq id no:15，作为arf21
cr
分子标记。
[0039]
本领域技术人员容易理解，上述突变基因检测方法可以使用试剂盒来进行dna 测序，借此判断玉米基因组中具有上述的基因突变体(突变位点)。因此，本发明的 另一方面还提供了一种用于实施上述突变基因检测方法的试剂盒，其包括用于检测 seq id nos:3-6、arf2
cr
、arf19
cr
和arf21
cr
的上述引物、或者dna/rna探针、或者 dna/rna探针的微阵列芯片。
[0040]
本发明的第二个目的在于提供一种多核苷酸，其选自：
[0041]
(a)上述的arf转录因子基因的突变体seq id nos:3-6中任意一个；
[0042]
(b)核苷酸序列与seq id nos:3-6中任意一个所示核苷酸序列的同源性≥ 80％、优选≥85％、≥90％、≥95％、更优地≥98％的多核苷酸；
[0043]
(c)与(a)或(b)中任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
[0044]
本发明的第三个方面在于提供上述多核苷酸的用途，其用于导入玉米中，替代 玉米基因组中arf转录因子编码基因，导致马齿型玉米向硬粒型玉米转变、或者增强 硬粒表型。
[0045]
本发明首次发现arf转录因子zmarf17(ncbi登录号zm00001d014013)具 有控制硬粒/马齿玉米形成的功能，其编码基因fln1的功能缺失、或者等位变异 fln1-m(选自seq id nos:3-6)导入玉米基因组后，可以使玉米籽粒变为硬粒型玉 米、或者增强硬粒表型。因此基因fln1的调控可以用于改良和创制硬粒型玉米种质资 源，大大加快了硬粒玉米遗传改良及种质资源创新的育种速度，避免周期漫长、前景不 明的大规模田间摸索过程，具有广泛的应用前景和巨大的经济价值。
附图说明
[0046]
图1显示了硬粒马齿自交系正反交表型照片。
[0047]
图2显示了马齿玉米b73和ems突变体(fln1-m1)成熟籽粒表型及变异统计结果。 其中a、e：b73；b、f：fln1-m1；c、g：b73 x fln1-m1；d、h：fln1-m1 x b73；i-k： 种植于上海的成熟籽粒顶部角度i，正反交成熟籽粒种子长j，正反交成熟籽粒种子宽k， 正反交成熟籽粒种子长宽比l；m-p：种植于三亚的成熟种子顶部角度m；正反交成熟 籽粒种子长n；正反交成熟籽粒种子宽o；正反交成熟籽粒种子长宽比p。取6个果穗， 每个果穗取不少于50个籽粒进行考种。**,p《0.01as determined by student’s t test。
[0048]
图3显示了不同发育时期fln1-m1突变体的籽粒表型和统计结果。其中a-d：种植 于上海松江农场的授粉后12、15、20、25、30天(dap)的b73种子a，fln1-m1种子 b，b73种子的纵切c，fln1-m1种子的纵切d；e-g：种植于上海的不同发育时期种子 长度e，种子宽f，种皮长度g；h-j：种植于三亚的不同发育时期种子长度h，种子宽 i，种皮长度j。取6个果穗，每个果穗取不少于50个籽粒进行考种。种皮长度测6个 果穗，每个果穗测定不少于6个籽粒。**,p《0.01as determined by student’s t test。
[0049]
图4显示了突变体fln1-m1种皮和胚乳的细胞学变化情况。其中图a：b73种子顶 部种皮的透射电镜切片；b：fln1-m1种子顶部种皮的透射电镜切片；c：b73种子远胚 一侧的半薄切片；d：fln1-m1种子远胚一侧的半薄切片；e：b73种子近胚一侧的半薄 切片；f：fln1-m1种子近胚一侧的半薄切片；g：顶部种皮细胞长度；h：远胚一侧种 皮细胞长度；i：近胚一侧种皮细胞长度；j：整个种皮细胞数目；k：不同发育时期种 子顶部胚乳的半薄和透射电镜观察，显示不同的灌浆能力。en，胚乳；al，糊粉层；per， 种皮；s，淀粉体；p，蛋白体。**,p《0.01as determined by student’s t test。
[0050]
图5显示了基因fln1的bsa定位检测情况。图中a，b73和fln1-m1的f
2:3
定位群 体定位图；b，ed6在10条染色体上的分步；c，ed6拟合结果。
[0051]
图6显示了候选基因zmarf17的表达模式分析。图中a，bsa定位区间内zmarf17 的变异；b，zmarf17在不同发育时期种皮和胚乳中的表达量，三个生物学重复；c， western blot分析zmarf17在不同发育时期胚乳和种皮中的表达量；d，zmarf17在 12dap种子种的原位杂交分析；e，原位杂交的阴性对照；f，zmarf17启动子驱动的 gfp转基因玉米分析。fln1*，为fln1-m1；en，胚乳；em，胚；per，种皮；wt，野生 型。
[0052]
图7显示了zmarf17的组织表达模式分析。图中a，zmarf17在玉米不同组织中的 表达量(相对表达水平relative expression level)；b，zmarf17在不同发育时期b73和 fln1-m1种皮中的表达量(相对表达水平relative expression level)。三个生物学重复。 en，胚乳；em，胚；per，种皮。
[0053]
图8显示了zmarf17及其三个同源基因的crispr敲除突变体组合。图中显示了 arf2、arf17、arf19、arf21的单基因突变体表型，双突、三突不同组合的表型以及四突 的表型。红线表示缺失碱基的编辑类型。
[0054]
图9显示了突变体fln1-m1、arf17-2和arf17
cr
等位基因的检测结果。加粗部分是野 生型中突变位点的序列，点划线显示的是基因编辑的位点。
[0055]
图10显示了马齿玉米b73和ems诱变体fln1-m1种皮的rna-seq分析图谱。图中 a，b73和fln1-m1在12、20、30dpa种皮rna-seq的交集；b；b73和fln1-m1在12、 20、30dpa种皮
rna-seq交集的kegg分析；c，b73和fln1-m1在12、20、30dpa 种皮rna-seq苯丙烷代谢途径基因的表达量；d，苯丙烷代谢途径基因在不同季节种植 条件下的定量pcr验证。数据为三个生物学重复。
[0056]
图11显示了马齿玉米b73和和ems诱变体fln1-m1种皮的代谢组分析。用15、25 dap的种皮进行代谢组分析，两个时期的差异代谢物进行交集分析显示，差异代谢物特 异的富集在黄酮代谢途径。数据为三个生物学重复。
[0057]
图12显示了突变体fln1-m1籽粒种皮中的生长素含量变化情况。pc，胎座合点区； ped，花梗组织；en，胚乳；upper，种皮组织不包括基部组织；basal，种子基部组织 包括pc和ped。**,p《0.01as determined by student’s t test。
[0058]
图13显示了fln1和p1直接结合抑制其转录激活活性的分析谱图。图中a，bifc 分析；b，荧光素酶互补实验；c，co-ip实验；d，chs启动子的荧光素酶转录激活实 验；e，dfr启动子的荧光素酶转录激活实验；f，在烟草系统中的luc转录激活实验； g，emsa实验证明myb40可以直接结合chs启动子序列，并且fln1可以增强myb40 的结合功能；h，emsa实验证明myb40可以直接结合chs启动子序列，并且fln1 可以增强myb40的结合功能。**,p《0.01as determined by student’s t test.
[0059]
图14显示了野生型马齿玉米b73和其突变体fln1-m1在哈尔滨东北农业大学实验 基地种植的表型。
[0060]
图15显示了将基因fln1-m1导入杂交种郑单958的亲本郑58和昌7-2中创制硬粒 杂交种。图中a，将基因fln1-m1导入主栽品种郑单958的双亲亲本中植株的表型和改 良前没有明显的变化；b，用fln1-m1改良郑单958的双亲亲本后创制的杂交种硬粒型 表型明显增强；c，百粒重；d，含水量；e，穗轴长度；f，穗行数，g，行粒数。
具体实施方式
[0061]
硬粒、马齿型玉米是现代杂交玉米育种的重要种质资源，同时也是重要的农艺性状。 由于硬粒马齿型玉米受微效多基因控制，而且遗传机制复杂，控制其形成的qtl很难 克隆，目前还没有报道；同时硬粒玉米的形成机制也不清楚。因此通过常规育种方法进 行硬粒玉米的遗传改良及其遗传种质的拓展，不仅费时费力、效率低、而且进展非常缓 慢方向不明确。
[0062]
我们首次发现并克隆了一个控制硬粒/马齿玉米形成的关键基因，经序列分析，确认 其为arf转录因子zmarf17的编码基因fln1，ncbi登录号为zm00001d014013。将 fln1功能缺失的等位变异fln1-m(选自seq id nos:3-6即fln1-m1、fln1-m2、fln1-m3 和fln1-m4)导入常规自交系后，通过pcr和测序鉴定fln1-m的基因型，fln1-m纯合 后可以使玉米籽粒变为硬粒型玉米。进一步地，我们还发现zmarf17的三个同源基因 zmarf2、zmarf19和zmarf21不能导致硬粒表型，但是fln1及其同源基因zmarf2、 zmarf19、zmarf21同时用crispr敲除突变后硬粒表型更加明显。
[0063]
在本文中，有时为了描述简便，会将蛋白比如转录因子zmarf17蛋白质名称与其 编码基因(dna)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的 物质。例如，对于zmarf17(基因)，用于描述转录因子功能或类别时，指的是蛋白 质(seq id no:1)；在作为一种基因描述时，指的是编码该转录因子的基因(seq idno:2)，以此类推，
(dap，授粉后天数)玉米b73和fln1-m1的种皮rna-seq数据进行深入分析，发现三 个发育时期的差异基因交集主要富集在苯丙烷代谢通路。我们对种皮中表达的苯丙烷代 谢通路基因进行rt-qpcr验证，结果表明，这些基因的表达在不同时期都有变化。其 中黄酮合成通路的关键酶chs(查耳酮合成酶基因，chalcone synthase gene)、dfr(二 氢芳香醇还原酶基因，dihydro flavonol reductase gene)和两个ugts(udp-糖基转移酶 基因，udp-glycosyltransferase genes)基因在这三个发育时期的fln1-m1种皮中都显著 上调。然后我们用15和25dap的种皮进行代谢组分析，发现这两个时期的差异代谢物 的交集特异的富集了黄酮及其衍生物。这些结果表明，苯丙烷代谢尤其是黄酮类代谢物 在b73和fln1-m1的种皮发育过程中起重要作用。
[0073]
已有研究表明，黄酮及黄酮衍生物与生长素极性运输抑制剂npa(n-1-萘基酞氨酸， n-1-naphthylphthalamic acid)的结构类似，对生长素运输有抑制作用。因此我们进一步 检测b73和fln1-m1种皮发育过程中生长素含量的变化。通过测定生长素含量，发现生 长素在fln1-m1整个种皮、上部种皮和种子基部组织中的含量都明显下降。生长素含量 的下降会抑制种皮细胞的生长。这些结果表明，fln1功能丧失后，会促进黄酮在种皮 中的积累、降低生长素含量，从而影响种皮发育，导致硬粒玉米的形成。
[0074]
fln1和myb40结合抑制其转录激活活性从而调控黄酮代谢通路
[0075]
为了搞清楚fln1是如何调控黄酮代谢通路的原因，我们通过bifc、luc互补实 验和pull-down实验发现，fln1可以和调控玉米黄酮代谢关键转录因子p1(pericarpcolor1)的同源基因myb40(zm00001d040621)互作。已有研究表明p1可以和黄酮合 成关键基因chs和dfr启动子结合，正调控这两个基因的表达从而调控黄酮代谢通路。 我们通过玉米叶片原生质体的luc转录激活实验和烟草叶片的转录激活实验证明， myb40可以激活chs和dfr启动子，而fln1不能激活这两个基因的表达；当fln1 和myb40共转后会抑制p1对chs和dfr启动子的激活活性。进一步用emsa实验 证明，myb40可以体外结合chs和dfr启动子，而加入fln1后可以增强myb40的 dna结合能力。这些结果表明，fln1通过和myb40直接结合抑制其对黄酮合成基因 的转录激活活性，从而负调控玉米种皮中的黄酮代谢通路，从而影响种皮的发育。
[0076]
突变fln1-m1硬粒玉米的遗传稳定性测验
[0077]
我们在上海中国科学院分子植物科学卓越创新中心松江农场、三亚大茅中棉所基 地、哈尔滨东北农业大学实验基地和山东潍坊进行了种植，不同年份不同地点fln1-m1 硬粒表型都非常稳定。表明该基因的遗传稳定性强，可以应用于大规模硬粒玉米的遗传 改良和种质资源创新。
[0078]
将fln1-m1导入主栽品种郑单958的双亲亲本中创制硬粒型杂交种
[0079]
为了检测基因fln1-m1突变体的应用潜力，我们将fln1-m1导入主栽品种郑单958 的亲本郑58和昌7-2中，然后杂交创制改良版的郑单958。改良后的两个亲本及杂交种 的株型、百粒重、穗轴长度、穗行数和行粒数没有出现明显的变化，但是籽粒都从马齿 型变为硬粒型，而且籽粒含水量明显下降。这些结果表明fln1-m1一个基因就可以将传 统的马齿型玉米改良为硬粒型玉米，并且可以降低籽粒的含水量，具有及其重要的应用 价值。
[0080]
本发明技术方案的优点主要表现在如下几个方面：
[0081]
一、fln1-m的功能非常强并且遗传稳定性好。将fln1-m杂交导入不同玉米自交 系
中，可以将其籽粒变为硬粒，理论对绝大部分自交系都有效，这将大大拓宽硬粒、 马齿的种质资源。而且fln1-m的遗传稳定性非常好，在东北、黄淮海和三亚表型都 非常稳定。
[0082]
二、使用fln1-m进行硬粒玉米改良的时间短。由于控制硬粒玉米形成的基因和 机制不清楚，常规的硬粒玉米遗传改良需要经过多年多点的大规模田间考察才能获 得稳定的材料。而用fln1-m进行硬粒玉米改良时，只要和其它自交系杂交，再自交 一代，通过我们开发的分子标记鉴定获得fln1-m纯合植株；其长出的果穗不论是自 交还是杂交其它玉米花粉，产生的种子全为硬粒型。而且导入过程中，最少只要保 留一个穗子进行杂交、自交就可以获得稳定的硬粒材料，可以大大节约工作量。
[0083]
三、用fln1-m进行硬粒玉米改良的操作简单，适合进行规模化作业。玉米的杂 交和自交技术相对简单，普通工人就可以掌握。我们开发了fln1-m的分子标记引物， 可以便捷的对fln1-m进行基因型鉴定。而所涉及的玉米叶片dna提取、pcr反应 和测序这些都是常规的分子实验，在普通实验室和测序公司就可以完成。
[0084]
四、用fln1-m进行硬粒玉米改良成本低。相比传统的玉米遗传改良，用fln1-m 进行硬粒玉米改良的效果强、稳定性好、缩短时间、减少工作量，从而大大节约成 本。除此之外，fln1-m基因型鉴定的分子实验也很常规，成本较低。
[0085]
五、用fln1-m可以用于创制硬粒杂交种玉米。我们将fln1-m基因型导入主栽玉 米品种的亲本中，在保持原有杂种优势的基础上可以迅速获得硬粒玉米的杂交种， 进行推广可以创造巨大的经济和社会效益。
[0086]
以下通过实施例对本发明的技术方案进行阐述和验证。应理解，以下实施例仅用于 说明本发明而非用于限定本发明的范围。
[0087]
实施例
[0088]
本文的实施例中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除 特别说明外，皆指质量百分含量。
[0089]
本文的实施例中，如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明，则该温度通 常指室温(15-30℃)。
[0090]
材料和方法
[0091]
玉米的自交、杂交、转基因操作、大田育种等按照常规的育种方式进行。
[0092]
实施例中的引物合成及基因测序皆由上海博尚生物技术有限公司完成。
[0093]
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、 培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，j.萨姆布鲁克，d.w.拉 塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单 试验确定具体实验条件。
[0094]
pcr扩增实验根据试剂供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通 过简单试验予以调整。
[0095]
实施例1：遗传材料创制
[0096]
我们用硬粒自交系和马齿的a619创制近等基因系遗传群体时，发现硬粒亲本做母 本，杂交a619花粉后，整个果穗的籽粒都为硬粒型；反之a619作母本，杂交硬粒亲 本的花粉，整个果穗的籽粒都为马齿型，参见图1。表明硬粒、马齿是由母本的基因型 决定。
[0097]
实施例2：ems突变体的表型
[0098]
ems诱变
[0099]
(1)雌穗准备：通常每次诱变50-100株玉米，提前一天下午修剪雌穗使第二天吐 丝整齐，到ems涂抹的时候，吐丝约1-2cm左右。
[0100]
(2)ems化学诱变剂准备(在通风橱中添加)：将40μl ems试剂加到40ml矿 物油中，用于处理约40株吐丝较好的玉米雌穗(提前计划所需处理株数，按比例准备 试剂量)。
[0101]
(3)准备ems/花粉溶液：早上先套雄花大袋收集花粉(散粉半小时以上)，期间 准备ems化学诱变剂(步骤2中配制)，之后用细网兜过滤收集花粉。40ml ems诱 变剂溶液，加5-8ml的花粉，获得ems/花粉溶液。45min诱变处理，期间不断摇晃或 中度震荡使花粉均匀分散至ems诱变剂中。
[0102]
(4)ems处理好的花粉授(涂抹)雌穗：用毛笔蘸ems/花粉溶液，涂抹于吐丝 较好的玉米雌穗，雌穗涂完后立即套好袋子，避免其他花粉污染。做完ems诱变后， 往身上喷停止剂。停止剂为10％的硫代硫酸钠(含1％tween20)，可快速使ems失活 成低/无害物质。
[0103]
通过上述ems诱变，我们筛选到硬粒表型最明显而且很稳定的b73背景的突变体， 命名为fln1-m1。b73为典型的马齿型玉米，顶部凹陷，凹陷角度小(见图2中a、e、i)；fln1-m1为硬粒型，籽粒顶部凸起，角度变大(图2中b、f、i)；b73做母本杂 交fln1-m1的花粉，籽粒表型与b73类似，为马齿(图2中c、g、i)；fln1-m1做母 本杂交b73的花粉，籽粒表型与fln1-m1类似，为硬粒型(图2中d、h、i)。表明硬 粒表型符合母体基因型控制的遗传学规律。同时正反交硬粒的种子长度比马齿的明显变 短，种子宽度变化不大，长宽比减小(图2中g-l)。在三亚种植时正反交的表型和考 种数据(图2中m-p)和上海种植的一致(图2中i-l)。
[0104]
实施例3：突变体fln1-m1种皮发育和细胞生物学表型研究
[0105]
我们对该突变体fln1-m1进行发育生物学的研究，发现和b73相比，fln1-m1在授 粉后不同发育时期种子长度都明显变短、种子宽度基本不变、种皮长度明显变短，并且 在三亚种植不同发育期的表型和上海种植的表型一致(见图3)。
[0106]
细胞学研究发现，fln1-m1种子顶部种皮细胞长度比b73明显变短(图4中a、b、 g)，同时fln1-m1种子两侧的种皮细胞长度比b73也明显变短(图4中c-d、h、i)， 而且种皮细胞数目明显减少(图4中j)。这些数据表明，fln1-m1种皮细胞长度变短， 细胞数目变少，导致种皮长度变短，种子变小。种皮发育的变化会影响胚乳的灌浆。
[0107]
我们发现从20dap开始，b73种子顶部胚乳细胞的灌浆明显不如fln1-m1的充足； 到30dap籽粒脱水期，b73顶部胚乳细胞中的淀粉体和蛋白体开始脱水聚集在一起， 从而产生空腔；将顶部种皮细胞向内拉，产生凹陷而导致马齿型玉米；而fln1-m1的顶 部胚乳细胞灌浆比较充实，到30dap时胚乳细胞依然没有脱水，淀粉体、蛋白体填充 比较充实，这样顶部种皮不易向内凹陷，从而形成硬粒表型(图4中k)。通过发育和 细胞生物学的研究表明，fln1-m1种皮扩张变慢，有利于顶部胚乳细胞灌浆，从而形成 硬粒。
[0108]
实施例4：bsa测序克隆控制硬粒玉米形成的关键基因fln1
[0109]
我们将fln1-m1和b73杂交创制f1，再将f1自交获得f2，将大于500粒的f2种 子种植，每个单株都编号自交，收获后统计籽粒表型，发现单个果穗的粒型都一致，果 穗上粒型没有分离。但是分离出硬粒型和马齿型果穗，分离比符合3:1(参见图5中a)。
[0110]
选出极端马齿表型的果穗和极端硬粒表型的果穗，再将其编号对应的叶片提取dna 进行bsa混池测序分析。dna提取、建库、测序及生信分析委托上海欧意生物医学科 技
有限公司完成。bsa测序结果显示在5号染色体出现唯一的峰(图5中b-d)，进一 步分析发现定位区间有一个arf转录因子zmarf17基因zm00001d014013，编码区一 个g到a(c to t)的突变(fln1-m1)，使trp
332
变为一个终止密码子stop gain，导致 蛋白翻译提前终止(图6中a)。
[0111]
基因表达模式表明，相对于根、茎、叶、胚乳、胚和种皮，zmarf17在不同发育时 期的种皮组织中优势高表达(图7中a)；而且在fln1-m1突变体种皮的表达量明显下 降(图6中b；图7中b)；western blot实验也表明zmarf17蛋白在种皮中富集同时 在fln1-m1种皮中几乎检测不到(图6中c)。同时，原位杂交实验以及zmarf17启动 子驱动gfp的转基因玉米的荧光实验也表明zmarf17主要在种皮中高表达(图6中 d-f)。因此，我们将zmarf17作为候选基因，进行后续研究。
[0112]
实施例5：遗传验证zmarf17是否是控制硬粒玉米形成的关键基因fln1
[0113]
由于zmarf17有另外三个同源基因：zmarf2，zmarf19，zmarf21。为了防止功能冗 余性，我们利用crispr同时敲除这四个基因，然后再分离出这四个基因的单突、双突、 三突和四突。
[0114]
以同源基因arf2的crispr敲除为例，crispr敲除使zm00001d032683，zmarf2 cds区(即seq id no:7)中第478位碱基g缺失导致翻译提前终止。包括如下步骤：
[0115]
5.1crispr载体构建和转化
[0116]
(1)使用在线网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr2/进行敲除靶标序列设计，并使用 http://www.rgenome.net/cas-offinder/进行特异性验证。选取这四个基因的同源序列： gtgcttgccaaggacgtgca作为靶标序列。
[0117]
(2)用引物u6pro-f(tcgagctcggtacccgggaagtcgtaaaatagtg)+ arf17-r(ttgctatttctagctctaaaactgcacgtccttggcgagcac)和引物 grna-f(gttttagagctagaaatagcaa)+u6ter-r (gcttgcatgcctgcaggcgagggctaaatcgt)分别进行pcr，将靶标序列引入 u6启动子和u6终止子之间构建grna表达系统；
[0118]
(3)将两个片段分别回收后，用smai和psti位点将grna表达系统同源重组到 cas9载体中；
[0119]
(4)载体经过测序验证后转化农杆菌eha105菌株；
[0120]
(5)将该载体用农杆菌介导法转化玉米high ii b x a lines幼胚，获得crispr转 基因玉米。
[0121]
5.2用ctab法提取玉米dna用于后续鉴定
[0122]
(1)取玉米叶片放于2ml管中，加入钢柱，液氮处理后进行研磨(60hz，60s)。
[0123]
(2)研磨后，加入0.6ml ctab提取缓冲液，混匀。
[0124]
(3)放入65℃烘箱60min，期间每10-15min混匀一下。
[0125]
(4)取出置于室温5-10min，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)至离心管，密 封后摇晃5min。
[0126]
(5)室温13000rpm转速下离心15min，吸取上清至新1.5ml离心管中。
[0127]
(6)加等体积异丙醇，来回颠倒混匀，放置负20度20min。
[0128]
(7)室温12000rpm转速下离心1min，倒掉上清。用1ml的75％乙醇洗dna 沉淀1至2次，每次12000rpm转速下离心1min后，将乙醇倒出。
[0129]
(8)短暂离心，吸出多于液体，在室温中晾干dna沉淀。
[0130]
(9)加入0.3ml h2o溶解dna沉淀。
[0131]
5.3检测玉米基因中arf2
cr
突变时，正向引物arf2
cr-f：acgaagaggaggaggagt； 反向引物arf2
cr-r：tcaggtgggctacaaaca。pcr产物为1349bp；测序引物为arf2
cr
‑ꢀ
测序：cgctcccgtgtctacta；target序列为gtgcttgccaaggacgtgca。pcr 检测用kod fx neo高保真酶(kfx-201t，toyobo)及pcr程序。序列分析网址为： http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/；模板序列为seq id no:13。
[0132]
按照上述方法，通过crispr基因编辑技术构建出zmarf17、zmarf19和zmarf21 的突变体，并进行玉米突变体基因鉴定。其中zmarf17
cr
方式包括crispr敲除使b73 参考基因组zmarf17(zm00001d014013的cds区，seq id no:2)第487位碱基g 缺失导致提前终止(fln1-m3)；使cds区第486和487位两个碱基cg缺失导致提前 终止(fln1-m4)。zmarf19
cr
方式为crispr敲除使zm00001d014507，zmarf19 cds区 (即seq id no:8)第475位碱基g缺失导致翻译提前终止。zmarf21
cr
方式为crispr 敲除使zm00001d000358，zmarf21 cds区(即seq id no:9)第496位碱基g缺失 导致翻译提前终止。
[0133]
对不同野生型(wt)突变体(cr)组合的玉米实验材料准确鉴定基因型，然后再 严格自交，考察玉米籽粒表型。发现在所有组合中只要有zmarf17的功能丧失突变就可 以导致硬粒表型；而且其他三个基因zmarf2、zmarf19和zmarf21的功能丧失突变，不 论单突、双突或三突都不能导致硬粒玉米的形成。因此，zmarf17是调控硬玉米形成的 关键基因fln1。
[0134]
另外还发现，这四个同源基因zmarf2/zmarf17/zmarf19/zmarf21同时突变后，硬粒 表型更明显(参见图8)。同时我们还鉴定到ems诱变体fln1m的另外一个突变位点 arf17-2(fln1-m2)，由于c到t的突变导致第156个氨基酸gln变为终止密码子。用fln1-m1分别和arf17-2(fln1-m2)、arf17
cr
(zmarf2的crispr敲除材料)进行等位测 试，发现这个基因内部杂合的不同突变位点可以导致硬粒玉米(见图9)。进一步表明 zmarf17是控制硬粒玉米形成的关键基因fln1。
[0135]
实施例6：调研玉米籽粒种皮中基因表达的变化
[0136]
我们对种皮rna-seq数据进行了深入分析，发现三个发育时期的差异基因交集主要 富集在苯丙烷代谢通路(图10中a、b)。我们对种皮中表达的苯丙烷代谢通路基因进 行rt-qpcr验证。包括如下步骤：
[0137]
6.1rna的提取:
[0138]
(1)取不同发育时期b73和fln1-m1的种皮组织，液氮速冻，磨样机充分磨粉， 并迅速转移至-80℃超低温冰箱保存。
[0139]
(2)取约50mg样品放于2ml管中，加入400μl的rna提取sds缓冲液，充 分震荡，放于冰上。sds缓冲液见下表：
[0140][0141]
(3)加入400μl的酚-氯仿(酚饱和于naac/hac中，1:1混合，酚ph为4.2，放 置于4℃，分层后用下层)，剧烈震荡30s，放置于冰上5min，期间震荡，12000rpm 转速下4℃离心10min，吸取350μl上清至新的1.5ml离心管中。
[0142]
(4)向上清液管中加1ml的trizol提取液，充分震荡，冰上放置5min；再向混 合液中加200μl的氯仿，充分震荡，冰上放置5min，12000rpm转速下4℃离心10min， 吸取上清液(切勿吸到中间层和下面有机相)500μl到新的离心管中。
[0143]
(5)向上清中加500μl的异丙醇，充分震荡，放置冰上10min，12000rpm转速 下4℃离心10min后，弃上清。
[0144]
(6)加1ml的70％乙醇溶液，轻弹使沉淀漂浮，冰上放置1min后，12000rpm 转速下4℃离心5min，弃上清。
[0145]
(7)离心机短暂离心，用小枪头吸取多于液体。室温晾干rna沉淀2min左右， 加100μl的ddh2o溶解沉淀。
[0146]
(8)利用qiagen的rneasy plus mini kit试剂盒，按照试剂盒标准方法将上述初 提rna过柱进行纯化处理，其中涉及使用dnasei进行dna的去除，最后用30μl无 rna酶的h2o进行溶解。
[0147]
6.2rna-seq分析
[0148]
rna-seq分析过程中的建库、测序及后续的生信分析委托上海欧意生物医学科技有 限公司完成。
[0149]
6.3rna-seq结果的定量rt-pcr鉴定
[0150]
(1)rna的反转录：采用pomega公司的反转录试剂盒(improm-ii
tm reversetranscription system)进行rna的反转录，按照试剂盒中标准方法进行。
[0151]
(2)通过ncbi设计特异性引物，并进行特异性分析，以actin为内参基因。
[0152]
(3)按照takara的sybr green试剂盒标准方法进行定量分析。每个样品进行三 个技术重复，将上述反转录后的cdna样品统一稀释8倍，用20μl的反应体系进行定 量分析。用sybr green mix，按照20μl的反应体系，加入mix 10μl，引物各0.5μl， 稀释后的cdna 3μl，ddh2o 6μl进行。
[0153]
(4)通过bio-rad荧光定量分析仪cfx，采用两步pcr扩增法检测基因表达量， 反应条件：预变性95℃，30s；扩增：95℃，5s，60℃，35s，40个循环；终止：95℃， 15s；60℃，60s；95℃，15s。
[0154]
(5)采用excell 2010和
△△
ct法对定量数据进行分析
[0155]
6.4定量rt-pcr引物见下表
[0156]
[0157]
[0158][0159]
rt-qpcr结果表明，这些基因的表达在不同时期都有变化。其中黄酮合成通路的关 键酶：chs(chalcone synthase gene)、dfr(dihydro flavonol reductase gene)和两个 ugts(udp-glycosyltransferase genes)基因在这三个发育时期的fln1种皮中都显著上调 (图10中d)。
[0160]
实施例7：调研玉米籽粒种皮中黄酮
[0161]
然后我们委托嘉兴迈维代谢生物科技有限公司用15和25dap的种皮进行代谢组分 析，发现这两个时期的差异代谢物的交集特异的富集了黄酮及其衍生物(图11)。这些 结果表明，苯丙烷代谢尤其是黄酮类分子在b73和fln1的种皮发育过程中起重要作用。
[0162]
实施例8：检测玉米籽粒种皮中的生长素含量
[0163]
称取50mg种皮鲜样，加入1ml 80％甲醇，抽提4h；15000rpm离心10min，取上 清到新离心管，-20℃冰箱过夜；15000rpm离心10min，取上清到新离心管，-20℃冰箱 过夜；15000rpm离心10min，取100μl上清到上样管中，用四极杆复合离子阱串联质 谱仪进行检测。
[0164]
实验发现，iaa(生长素)在fln1-m1整个种皮、上部种皮和种子基部组织中的含 量都明显下降(图12中f)。生长素含量的下降会抑制种皮细胞的生长。这些结果表 明，fln1功能丧失后，会促进黄酮在种皮中的积累、降低生长素含量，从而影响种皮 发育，导致硬粒玉米的形成。
[0165]
实施例9：与fln1互作的蛋白研究
[0166]
9.1双分子荧光互补(bifc)检测：
[0167]
9.1.1载体构建：将zmarf17和zmmyb40的全长cds扩增后分别插入 psat4-neyfp和psat4-ceyfp质粒。
[0168]
9.1.2玉米原生质体被分离和转化：b73幼苗在28℃黑暗培养7天，然后将叶片切 成1毫米大小，在酶解缓冲液(1.5％cellulase r10,0.5％macerozyme r10,0.4m mannitol, 20mm kcl,20mm mes ph 5.7,10mm cacl2,0.1％bsa,5mmβ-mercaptoethanol)中 22℃反应3小时后。原生质体用w5缓冲液(154mm nacl,125mm cacl2,5mm kcl,5 mm glucose,0.03％mes,ph 5.7)终止反应，清洗收集原生质体。然后加入mmg(0.4 m mannitol,15mm mgcl2,0.1％mes,ph 5.7)调节原生质体浓度。每100μl原生质体 缓冲液中加入10μg质粒和110μl peg(45％peg4000,0.2m mannitol,100mm cacl2) 进行转化。室温中反应15min后，加入440μl w5缓冲液终止。取去上清液后，加入 1ml wi(20mm kcl,0.6m mannitol,4mm mes ph5.7)孵育原生质体16h。
[0169]
9.1.3原生质体在激光共聚焦扫描显微镜lsm880捕捉yfp信号。
[0170]
9.2荧光素酶互补成像(lci)试验
[0171]
9.2.1载体构建：将zmarf17 cds克隆到jw771(nluc)中，将zmmyb40的cds 克隆到jw772(cluc)中。每个orf分别融合到luc的羧基端一半(cluc-x)和n端一 半(x-nluc)的序
(invitrogen，目录编号wp20005)处理膜，然后用tanon-5200体系检测免疫反应条带。
[0192]
9.6载体构建引物列表：
[0193][0194][0195]
我们通过bifc(双分子荧光互补)、luc互补实验(荧光素酶互补实验)和pull-down 实验(蛋白质体外结合实验，拉下实验)发现，fln1(即zmarf17)可以和调控玉米 黄酮代谢的关键转录因子p1(pericarp color1)的同源基因myb40互作(图13中a-c)。 我们通过玉米叶片原生质体的luc转录激活实验和烟草叶片的转录激活实验证明， myb40可以激活chs和dfr启动子，而fln1不能激活这两个基因的表达；当fln1 和myb40共转后会抑制myb40对chs和dfr启动子的激活活性(图13中d-f)。 进一步用emsa实验证明，myb40可以体外结合chs和dfr启动子，而加入fln1 后可以增强myb40的dna结合能力(图13中g)。这些结果表明，fln1通过与myb40 直接结合抑制其对黄酮合成基因的转录激活活性，从而负调控玉米种皮中的
黄酮代谢通 路，从而影响种皮的发育。
[0196]
实施例10：考察fln1m硬粒玉米在不同生态条件下的表现
[0197]
从2018年起，我们在上海中科院分子植物科学卓越创新中心松江农场、三亚大茅 中棉所基地和哈尔滨东北农业大学实验基地(图14)分别种植野生型马齿玉米b73和 其突变体fln1-m。经过4年考察发现，不同年份不同地点fln1-m硬粒表型都非常稳定。 表明该基因fln1-m的遗传稳定性强，可以应用于大规模硬粒玉米的遗传改良和种质资源 创新。
[0198]
实施例11：fln1m硬粒玉米杂交实验
[0199]
为了检测基因fln1突变体的应用潜力，我们将fln1-m1导入主栽品种郑单958的亲 本郑58和昌7-2中，然后杂交创制改良版的郑单958(图15)。改良后的两个亲本及 杂交种的株型、百粒重、穗轴长度、穗行数和行粒数没有出现明显的变化，但是籽粒都 从马齿型变为硬粒型，而且籽粒含水量明显下降。这些结果表明fln1-m1一个基因就可 以将传统的马齿型玉米改良为硬粒型玉米，并且可以降低籽粒的含水量，具有及其重要 的应用价值。硬粒型玉米是杂交育种中的一类重要种质资源利用基因fln1-m将大大促进 硬粒玉米的遗传改良及种质资源创新，具有非常广阔的应用前景和巨大的经济价值。
[0200]
虽然上述实施例仅以玉米为例对于转录因子zmarf17的功能进行了验证，但本领 域的技术人员应理解，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员可以在此基础上做出 各种改动或者修改，比如应用于其他谷物改良或者新品种创建，由此所做的各种变形或 者修改的等价形式，同样应属于本发明的范围。

技术特征：
1.一种改良和创制硬粒型玉米种质资源的方法，包括下述步骤：使玉米基因组中arf转录因子zmarf17的编码基因功能丧失或表达下调，导致马齿型玉米向硬粒型玉米转变、或者增强硬粒表型。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，arf转录因子zmarf17的氨基酸序列为seq id no:1，ncbi登录号为zm00001d014013；该arf转录因子zmarf17的编码基因的核苷酸序列为seq id no:2。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，通过下述方式实施：(1)敲除玉米基因组中arf转录因子的编码基因；(2)下调玉米基因组中arf转录因子编码基因的表达水平；(3)用编码功能丧失或下调的arf转录因子基因突变体替代玉米基因组中arf转录因子编码基因；或者(4)使arf转录因子编码基因与其三个同源基因同时发生突变，它们的突变体导致原有功能失活或者表达下调，所述三个同源基因分别是核苷酸为seq id no:7的zmarf2、核苷酸为seq id no:8的zmarf19和核苷酸为seq id no:9的zmarf21。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，方式(2)选自下组：(2-1)对arf转录因子的编码基因启动子区进行突变导致arf转录因子编码基因的表达水平下调；(2-2)对arf转录因子的编码基因上游调控因子进行突变导致arf转录因子编码基因的表达水平下调；或者(2-3)在玉米中导入arf转录因子的互作蛋白来改变arf转录因子编码基因的功能。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，(2-3)中所述arf转录因子的互作蛋白是调控玉米黄酮代谢的转录因子myb40，zm00001d040621。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，arf转录因子的编码基因是seq id no:2，方式(3)和方式(4)中arf转录因子基因的突变体选自下组：核苷酸seq id no:3，表示为fln1-m1，其突变方式是seq id no:2中第995位g to a的突变导致trp
332
变为终止密码子；核苷酸seq id no:4，表示为fln1-m2，其突变方式是seq id no:2中第466位c to t的突变导致gln
156
变为终止密码子；核苷酸seq id no:5，表示为fln1-m3，其突变方式是seq id no:2中第487位碱基g缺失导致提前终止；核苷酸seq id no:6，表示为fln1-m4，其突变方式是seq id no:2中第486和487位两个碱基cg缺失导致提前终止。7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，方式(4)中三个同源基因的突变体选自下组：arf2
cr
，其突变方式是seq id no:7中第478位碱基g缺失导致翻译提前终止；arf19
cr
，其突变方式是seq id no:8中第475位碱基g缺失导致翻译提前终止；arf21
cr
，其突变方式是seq id no:9中第496位碱基g缺失导致翻译提前终止。8.一种多核苷酸，其选自：(a)如权利要求6中所述的arf转录因子基因突变体seq id nos:3-6中任意一个；(b)核苷酸序列与seq id nos:3-6中任意一个所示核苷酸序列的同源性≥80％、优选
≥85％、≥90％、≥95％、更优地≥98％的多核苷酸；(c)与(a)或(b)中任一项所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。9.如权利要求8中所述多核苷酸的用途，其特征在于，用于导入玉米中，替代玉米基因组中arf转录因子编码基因。10.一种检测玉米基因组中如权利要求6和7中所述的基因的突变体seq id nos:3-6、arf2
cr
、arf19
cr
和arf21
cr
的方法，包括下述步骤：检测seq id no:3时，正向引物fln1-f：aagggtcctggtgggtacat，反向引物fln1-r：tgctttagcgtgggactgac，pcr产物为638bp，测序引物为fln1-f，pcr检测用pcr mix及程序进行，扩增序列为seq id no:10；检测seq id no:4时，正向引物arf17-2-f：gtccttcaagaacgccgaca，反向引物arf17-2-r：cgctcccgtgtctactacttcc，pcr产物为657bp；测序引物为arf17-2-f，pcr检测用pcr mix及程序进行，扩增序列为seq id no:11；检测seq id no:5或者seq id no:6时，正向引物arf17
cr-f：tacattcctactccgctttg，反向引物arf17
cr-r：cctgccctaccctcatac，pcr产物为1798bp，测序引物为arf17
cr-测序：cgctcccgtgtctacta，target序列为gtgctcgccaaggacgtgca，模板序列为seq id no:12；检测arf2
cr
时，正向引物arf2
cr-f：acgaagaggaggaggagt，反向引物arf2
cr-r：tcaggtgggctacaaaca，pcr产物为1349bp；测序引物为arf2
cr-测序：cgctcccgtgtctacta，target序列为gtgcttgccaaggacgtgca，模板序列为seq id no:13；检测arf19
cr
时，正向引物arf19
cr-f：ccccttgctttcttctcac，反向引物arf19
cr-r：gccgccgtggacgccttc，pcr产物为1987bp；测序引物为arf19
cr-测序：gtgcctggacccgcagctgtgg，target序列为gtgctcgccaaggacgtgca；模板序列为seq id no:14；检测arf21
cr
时，正向引物arf21
cr-f：cccgaatccgtcgttaccc，反向引物arf21
cr-r：gctttgagatgccgtcctt，pcr产物为1599bp；测序引物为arf21
cr-测序：caattcccgccgaaaccg，target序列为gtgctcgccaaggacgtgca；模板序列为seq id no:15。11.一种实施如权利要求10所述方法的试剂盒，其特征在于，其包括用于检测seq id nos:3-6、arf2
cr
、arf19
cr
或arf21
cr
的相应引物、或者dna/rna探针、或者dna/rna探针的微阵列芯片。

技术总结
本发明公开了一种改良和创制硬粒型玉米种质资源的方法，包括下述步骤：使玉米基因组中ARF转录因子ZmARF17的编码基因功能丧失或表达下调，导致马齿型玉米向硬粒型玉米转变或者增强硬粒表型。者增强硬粒表型。


技术研发人员：巫永睿 王海海 黄永财
受保护的技术使用者：中国科学院分子植物科学卓越创新中心
技术研发日：2022.03.11
技术公布日：2023/9/20