一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒及方法

1.本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒及方法。


背景技术：

2.细菌污染严重影响人体健康，是公共卫生领域关注的重要问题。细菌广泛存在于自然界，如水、空气、尘埃、人和动物的排泄物中，其可通过飞沫，接触，饮用水和食物等途径进入人体，感染发病率较高，对人体健康产生较大的威胁。其中，食源性致病菌作为食品中生物性污染物对人类健康构成了重大威胁。据世界卫生组织估计，每年全世界约有6亿人因食物污染而导致中毒或者患病，42万人死于食物中毒，其中三分之一是五岁以下儿童。我国国家标准《食品中致病菌限量》中规定的食品必检的食源性病原菌包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌 o157:h7。这些标准和规范为保障食品安全和人群健康提供了保障，但是，预防食品污染是全球卫生保健系统和食品行业的一个永恒挑战，能够建立快速、灵敏和准确检测的致病菌检测方法并在此基础上及时作出应对措施具有重要的意义。
3.目前针对致病菌的检测方法主要有分离培养法、分子生物学检测方法、免疫学方法等，虽然这些方法能实现对食源性致病菌的检测，但仍存在各自的缺点，例如分离培养法为食源性检测的“金标准”，也是我国国家标准中推荐的方法，但实验周期耗时较长，且操作复杂，不能满足对样品快速检测的需求；其它检测方法，如分子生物学检测方法技术操作复杂、成本高以及需要专业的工作人员；酶联免疫法则需要利用生物酶，生物酶价格昂贵，并且其活性容易受到温度、ph等环境因素的影响。因此，迫切需要开发一种操作简单、易于实施、快速和灵敏度高的现场检测方法。
4.食源性致病菌检测的关键问题之一是实现大量样本的现场快速筛检。目视比色分析法是最好的现场快速信号筛检方法。胶体金材料因具有良好的生物相容性、大比表面积、光电特性、表面等离子共振效应。其摩尔吸光系数随着粒径的增加逐渐降低，紫外可见吸收峰蓝移，呈现肉眼可见的颜色变化。因此，胶体金被广泛用于现场目视比色传感检测中。但是，目视比色法信号单一，灵敏度低，无法实现定量检测。多信号分析方法是具有自校正和自验证的新型检测方法（fu, x., sun, j., ye, y., zhang, y., sun, x. (2022). a rapid and ultrasensitive dual detection platform based on cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant salmonella. biosensors and bioelectronics, 195, 113682.）。该检测系统可以通过一次反应产生两个及以上光、电、色信号，信号彼此之间可以校正，互为参考，可以弥补目视比色分析法的不足用于现场实践。异硫氰酸荧光素是一种重要的荧光染料分子，价格低廉，对光的消光系数高、荧光量子产率好，被广泛用于蛋白荧光标记。核酸适配体是利用体外指数富集的配体系统进化技术筛选的寡核苷酸片段能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合靶标，在医学、生物、环境和农林等检测分析领域具有很大的应用前景。
5.综上所述，为了实现食源性致病菌的现场筛检，开发一种快速，简单，准确度高，特异性强的检测方法和试剂盒，对食品微生物检验等领域具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种食源性致病菌光色多信号检测方法及试剂盒。
7.一种食源性致病菌快速光色多信号检测试剂盒，它包括：致病菌适配体溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液；
8.所述的食源性致病菌适配体溶液浓度为10
ꢀµ
m-30
ꢀµ
m；所述的胶体金粒径为13-40 nm，表面官能团为羧基；所述的异硫氰酸荧光素溶液浓度为2.5-20 μm；
9.所述的食源性致病菌包括：金黄色葡萄球菌、李斯特菌大肠杆菌；
10.所述的金黄色葡萄球菌适配体基因序列为5'sh-gca atg gta cgg tac ttc ctc ggc acg ttc tca gta gcg ctc gct ggt cat ccc aca gct acg tca aaa gtg cac gct act ttg cta a-3'。
11.所述的胶体金溶液是采用氯金酸和柠檬酸三钠反应制备的。
12.所的反应为将1 mm的氯金酸加热至沸腾，在剧烈搅拌的状态下快速加入4 mmol/l柠檬酸三钠，反应20 min。
13.所述的适配体溶液浓度为20 μm；异硫氰酸荧光素fitc的优选浓度为15 μm；所述的胶体金为粒径为13 nm。
14.所述的试剂盒还包括阴性质控品磷酸缓冲液，阳性质控品灭活金黄色葡萄球菌悬液。
15.一种食源性致病菌快速比色/荧光检测方法，它包括：采用权利要求1所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒；
16.1）待检样品加入缓冲液充分混匀后，将浸提液转入离心管中；
17.所述的缓冲溶液体积为5-10 ml，优选的体积为5 g样品加缓冲液10 ml；
18.2） 加入食源性致病菌适配体溶液，漩涡混匀后在37 ℃下孵育15-90 min，离心分离，用移液器吸出上清；
19.3）取上清溶液加入到胶体金溶液中，在温度为-20～-80 o
c冷冻10-60 min，在温度25-70 o
c下融解后，目视观察或用紫外可见光谱仪测定胶体金溶液在400-800 nm处扫描光谱；
20.4）将溶解后的胶体金溶液进行离心以去除聚集的纳米粒子，加入荧光素溶液孵育，使用荧光光度计测量荧光，确定食源性致病菌的含量。
21.步骤3）所述的冷冻温度为-80 o
c，时间为10 min，融解温度为70 o
c。
22.步骤2）所述的孵育时间为60 min。
23.本发明提供了一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒及方法，它包括：食源性致病菌适配体溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液，阴性质控品，阳性质控品。它通过简单的离心实现了食源性致病菌的特异性识别，利用食源性致病菌适配体诱导胶体金冻融后发生聚集变化，根据胶体的聚集颜色变化和异硫氰酸荧光素影响，对金黄色葡萄球菌进行定量检测，定量检测时变异系数小，方法灵敏度高，线性范围广，成本较低，操作简单，易于实施，检测时间短，比色信号检测限为5 cfu/ml，荧光定量检测限为2 cfu/ml，双信号不
仅实现了现场可视化，还提高了检测准确度。
附图说明
24.图1 金纳米粒子的透射电镜图；
25.图2 （a）胶体金的紫外光谱；(b) 异硫氰酸荧光素（fitc）的荧光发射光谱；
26.图3 （a）不同粒径胶体金的吸收光谱；（b）冻融对不同粒径胶体金与适配体混合液光谱的影响； (c) 胶体金冻融后吸光度归一化值；
27.图4 （a, b）胶体金万古霉素混合指示液冷冻时间的优化；
28.图5 （a-c）胶体金万古霉素混合指示液溶解温度的优化;
29.图6 （a） 金黄色葡萄球菌适配体与金黄色葡萄球菌孵育时间优化；（b）金黄色葡萄球菌适配体浓度优化；（c）荧光素浓度的优化；
30.图7 金黄色葡萄球菌检测的标准曲线，线性回归方程和相关系数；
31.图8 金黄色葡萄球菌检测的选择性；
具体实施方式
32.实施例1金纳米粒子（胶体金）的制备
33.先将合成所需要的玻璃器皿用王水（硝酸：盐酸=1:3）浸泡30 min，用超纯水冲洗三遍，氮气吹干，将100 ml浓度为1 mm的氯金酸加热至沸腾，在搅拌的状态下快速加入4 mm柠檬酸三钠，20 min后，溶液由淡黄色变为酒红色，得到金纳米粒子，冷却至室温后，在4 ℃黑暗条件下保存。金纳米粒子的紫外光谱见图2(a)。
34.实施例2 磷酸缓冲液的配置（用于细菌的稀释和阴性对照）
35.缓冲液：取nacl 8.0 g、kcl 0.2 g、na2hpo
4 1.44 g和kh2po
4 0.24 g溶于800 ml蒸馏水中，用naoh调节ph 7.4，定容至1000 ml。
36.实施例3 异硫氰酸荧光素（fitc）溶液的配制
37.准确称取0.0019 g fitc，室温下溶于去离子水中，稀释形成2.5 μm-20 μm的fitc溶液。fitc的荧光发射光谱见图2(b)。
38.实施例4金黄色葡萄球菌适配体溶液的配制
39.将适配体 （5’sh-gca atg gta cgg tac ttc ctc ggc acg ttc tca gta gcg ctc gct ggt cat ccc aca gct acg tca aaa gtg cac gct act ttg cta a-3’）干粉溶于无酶水（没有dna或rna酶的水）中，形成10 μm-30 μm的适配体溶液；
40.实施例5 金纳米粒子粒径优化实验
41.采用柠檬酸钠还原法制备了粒径为13nm、20nm和40nm金纳米粒子，用紫外-可见分光光度计分别测定紫外吸收光谱；然后准确移取各粒径金纳米粒子溶液100μl，向其中加入25μl阴性对照组上清，-80℃冷冻10min，70℃解冻，扫描紫外吸收光谱。
42.实验结果如图3所示，从图3(a)(b)中可以看出不同粒径金纳米粒子的吸收峰在520nm-531nm发生改变；从图(c)中可以看出20nm和40nm金纳米粒子在冻融后呈现聚集状态，而13nm金纳米粒子几乎没有变化。因此，本实验优选13nm金纳米粒子。
43.实施例6 金纳米粒子与适配体冷冻时间优化实验
44.取100μl金纳米粒子溶液，向其中加入25μl阴性对照组上清，然后将上述溶液混合
均匀，在-80℃放置5min、10min、20min、30min和60min,70℃解冻后。用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
45.实验结果如图4(a)(b)所示，从图4(a)(b)中可以看出-80℃冷冻5min时，金纳米粒子稍微发生了聚集，大于10min时冷冻时金纳米粒子状态相似。本发明优选，-80℃冷冻，冷冻时间10min。
46.实施例7金纳米粒子与适配体融化温度优化实验
47.取100μl金纳米粒子溶液，向其中加入25μl阴性对照组上清，然后将上述溶液混合均匀，-80℃冷冻10min后，置于20℃、37℃、50℃、60℃和70℃解冻，用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
48.实验结果如图5(a)(b)(c)所示，从图5(a)(b)(c)中可以看出融化温度不影响金纳米粒子的聚集，吸收峰几乎没有变化，但随着融化温度的增加，解冻所需要的时间逐渐减少。本发明优选70℃快速解冻。
49.实施例8金黄色葡萄球菌适配体与金黄色葡萄球菌孵育时间优化实验
50.将10μl20μm金黄色葡萄球菌适配体与100μl105cfu/ml金黄色葡萄球菌混合均匀后，置于37℃孵育15min、30min、45min、60min和90min，4000rpm离心10min，取上清25μl与100μl金纳米粒子溶液混合均匀后，在-80℃冷冻10min，融化后用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
51.实验结果如图6(a)所示，随着孵育时间的增加，a
650
/a
520
逐渐增加；当孵育时间为60min时，a
650
/a
520
增加趋于平缓，因此，本实验优选孵育时间为60min。
52.实施例9金黄色葡萄球菌适配体浓度优化实验
53.将10μl浓度分别为0μm,10μm,15μm,20μm,25μm和30μm的金黄色葡萄球菌适配体与100μl105cfu/ml金黄色葡萄球菌混合作为阳性对照组。将10μl不同浓度的金黄色葡萄球菌适配体（0μm,10μm,15μm,20μm,25μm,30μm）与100μl磷酸缓冲液混合作为阴性对照组，上述溶液混合均匀后,置于37℃孵育60min,4000rpm离心10min，取上清25μl与100μl金纳米粒子溶液混合均匀后，在-80℃冷冻10min，融化后用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
54.实验结果如图6(b)所示，当加入金黄色葡萄球菌适配体的浓度为20μm时,有无金黄色葡萄球菌存在时，a
650
/a
520
差值最大，可以获得较为明显的比色信号，因此，适配体的优选浓度为20μm。
55.实施例10异硫氰酸荧光素（fitc）浓度优化实验
56.将10μl浓度为20μm的金黄色葡萄球菌适配体与100μl含有105cfu/ml金黄色葡萄球菌在37℃孵育1h。混合液在4000rpm离心10min后取25μl上清加入到体积为100μl的金纳米粒子，放入冰箱冻融。冻融后的金纳米粒子经4000rpm离心10min，90μl离心后的aunps溶液与10μl浓度分别为2.5，5，10，15和20μm的fitc在室温孵育10min；阴性对照组使用磷酸缓冲液代替金黄色葡萄球菌，利用荧光光度计分别测定上述混合溶液荧光光谱，计算荧光差值δf。
57.实验结果如图6(c)所示，当加入异硫氰酸荧光素fitc的浓度为15μm时，荧光差值最大。因此，异硫氰酸荧光素fitc的优选浓度为15μm。
58.实施例11金黄色葡萄球菌检测实验
59.本发明在最优条件下，建立的一种金黄色葡萄球菌的比色/荧光双模检测方法的步骤如下：
60.（1）稀释金黄色葡萄球菌溶液
61.取6个1.5ml的微量离心管，分别编号为1，2，3，4，5，6，在1号管中加入1000μl标准品金黄色葡萄球菌溶液，在2-6号管中加入900μl标准稀释液(磷酸缓冲液)，用枪头反复吹打5-10次左右（注意控制幅度不要过大容易产生气泡）如果有涡旋仪可以在涡旋仪上涡旋1-10秒左右，然后更换枪头。在1号管中取100μl加入到2号管，后面过程依次类推。最后稀释完，第1-5个管中液体在900μl，6号管为1000μl。金黄色葡萄球菌浓度是从大到小，依次为1
×
10
6-10cfu/ml。
62.（2）金黄色葡萄球菌适配体与金黄色葡萄球菌的结合
63.将10μl浓度为20μm金黄色葡萄球菌适配体与10-106cfu/ml浓度的金黄色葡萄球菌混合均匀，在37℃下孵育60min，4000rpm离心10min；
64.（3）胶体金溶液的加入
65.取步骤（2）的上清液25μl加入到100μl金纳米粒子溶液中，-80℃冷冻10min后，解冻；
66.（4）显色
67.根据解冻后的胶体金溶液的颜色和聚集状态指示金黄色葡萄球菌的含量。
68.（5）异硫氰酸荧光素fitc溶液的加入
69.解冻后的胶体金溶液4000rpm离心10min，取90μl胶体金溶液与10μl15μm异硫氰酸荧光素fitc溶液孵育；
70.（6）读数
71.用紫外可见分光光度计在400-800nm处扫描紫外吸收光谱，记录520nm和650nm处的吸收光强度；用荧光光度计记录在490nm的激发光下，500-600nm的发射光谱；根据标准曲线，阴性样本校正，测定金黄色葡萄球菌的浓度。
72.利用本发明的比色/荧光方法（吸光度比值和荧光信号）对金黄色葡萄球菌的检测结果如图7所示，其中，图7(a)是用金纳米粒子与适配体冻融检测不同浓度的金黄色葡萄球菌时的扫描光谱，线性校正曲线见图7(b)。该比色方法对于金黄色葡萄球菌检测线性范围为10
2-106cfu/ml，线性关系良好，相关系数为0.994，检测下限为5cfu/ml。
73.图7(c)是基于金纳米粒子与异硫氰酸荧光素fitc作用而检测不同浓度的金黄色葡萄球菌时的荧光曲线，线性校正曲线见图7(d)。该荧光方法对于金黄色葡萄球菌检测线性范围为10
1-106cfu/ml，线性关系良好，相关系数为0.991，检测下限为2cfu/ml。
74.实施例12特异性实验
75.分别准确移取100μl浓度105cfu/ml大肠杆菌o157:h7，浓度为105cfu/ml假单胞菌、浓度为105cfu/ml单核细胞增生李斯特菌，浓度为105cfu/ml金黄色葡萄球菌和以上细菌的混合菌，依次向各管中加入10μl20μm金黄色葡萄球菌适配体，将上述溶液混合均匀后，置于37℃孵育60min，4000rpm离心10min，取上清25μl加入到100ul金纳米粒子溶液中，-80℃冷冻10min后，室温解冻，测定其吸收值；解冻后的胶体金溶液4000rpm离心10min，取90μl胶体金溶液与10μl15μm异硫氰酸荧光素溶液孵育，测量其荧光光谱。
76.实验结果如图8所示，从图8中可以看出该方法可以特异性识别金黄色葡萄球菌。
因此，基于适配体诱导胶体金聚集和金纳米粒子对异硫氰酸荧光素作用建立的金黄色葡萄球菌比色/荧光双模检测方法检测选择性高，特异性好。
77.实施例13金黄色葡萄球菌试剂盒的制备和使用
78.一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒，它包括：由实施例1所描述的胶体金、实施例2所描述的磷酸缓冲液、实施例3所描述的异硫氰酸荧光素溶液、用1%甲醛灭活的109菌液阳性标准品、阴性质控磷酸缓冲液。
79.一种金黄色葡萄球菌快速检测试剂盒的使用步骤如下：
80.待检食品样品研磨后，取5g匀浆，加入试剂盒中的磷酸缓冲液10ml，充分混匀后，将100
µ
l浸提液转入离心管中，向该离心管中加入试剂盒中的适配体10μl,漩涡混匀后在37℃下孵育60min,4000rpm离心10min，用移液器吸出上清。取上清25μl加入到100μl金纳米粒子溶液中，-80℃冷冻10min后，解冻，测定其吸收值。利用可见分光光度计，测定吸收值，也可目视观察。解冻后的胶体金溶液4000rpm离心10min，取90μl胶体金溶液与10μl15μm异硫氰酸荧光素fitc溶液孵育，测量其荧光光谱。按上述同样的方法检测试剂盒中提供的阴性质控品及阳性质控品样品，并利用标准菌液制作标准曲线，阳性质控品样品的a
650
/a
520
小于阴性质控品或阳性质控品样品的荧光值小于阴性质控品，则表明试剂盒失效。

技术特征：
1.一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，它包括：食源性致病菌适配体水溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液；所述的金黄色葡萄球菌适配体溶液浓度为10
ꢀµ
m-30
ꢀµ
m；所述的胶体金粒径为13-40 nm，表面官能团为羧基；所述的异硫氰酸荧光素溶液浓度为2.5-20 μm。2.根据权利要求1所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的食源性致病菌为金黄色葡萄球菌，适配体基因序列为5'sh-gca atg gta cgg tac ttc ctc ggc acg ttc tca gta gcg ctc gct ggt cat ccc aca gct acg tca aaa gtg cac gct act ttg cta a-3'。3.根据权利要求1、2所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的胶体金溶液是采用氯金酸和柠檬酸三钠反应制备的。4.根据权利要求3所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所的反应为将1 mm的氯金酸加热至沸腾，在剧烈搅拌的状态下快速加入4 mmol/l柠檬酸三钠，反应20 min。5.根据权利要求3所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的适配体溶液浓度为20 μm；异硫氰酸荧光素fitc的浓度为15 μm；所述的胶体金为粒径为13 nm。6.根据权利要求5所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括阴性质控品：磷酸缓冲液，阳性质控品：灭活金黄色葡萄球菌悬液。7.一种食源性致病菌快速比色/荧光检测方法，它包括：采用权利要求1所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒；1）待检样品加入缓冲液，充分混匀后，将浸提液转入离心管中；所述的缓冲溶液体积为5-10 ml，优选的体积为5 g样品加缓冲液10 ml；2） 加入金黄色葡萄球菌适配体溶液，漩涡混匀后在37 ℃下孵育15-90 min，离心分离，吸出上清；3）取上清溶液加入到胶体金溶液中，在温度为-20～-80 o
c冷冻10-60 min，在温度25-70 o
c下融解后，目视观察或用紫外可见光谱仪测定胶体金溶液在400-800 nm处扫描光谱；4）将溶解后的胶体金溶液进行离心，去除聚集的纳米粒子，加入荧光素溶液孵育，使用荧光光度计测量荧光，确定金黄色葡萄球菌的含量。8.一种食源性致病菌快速比色/荧光检测方法，其特征在于：，步骤3）所述的冷冻温度为-80 o
c，时间为10 min，融解温度为70 o
c。9.一种食源性致病菌快速比色/荧光检测方法，其特征在于：步骤2）所述的孵育时间为60 min。10.根据权利要求6所述的一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为取nacl 8.0 g、kcl 0.2 g、na2hpo
4 1.44 g和kh2po
4 0.24 g溶于800 ml蒸馏水中，用naoh调节ph 7.4，定容至1000 ml。

技术总结
本发明公开了一种食源性致病菌快速比色/荧光检测试剂盒及方法，它包括：食源性致病菌适配体溶液，胶体金溶液，异硫氰酸荧光素溶液，阴性质控品，阳性质控品。它通过简单的离心实现了食源性致病菌的特异性识别，利用食源性致病菌适配体诱导胶体金冻融后发生聚集变化，根据胶体的聚集颜色变化和异硫氰酸荧光素影响，对金黄色葡萄球菌进行定量检测，定量检测时变异系数小，方法灵敏度高，线性范围广，成本较低，操作简单，易于实施，检测时间短，比色信号检测限为5 CFU/mL，荧光定量检测限为2 CFU/mL，双信号不仅实现了现场可视化，还提高了检测准确度。测准确度。


技术研发人员：齐燕飞 孙瑞蒙 张晓宇 杜婷 李雨函 马海楠 孙浩霖 张李娜
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.02.16
技术公布日：2023/9/20