一种促进种子发育的青蒿AaSER1基因及其编码的蛋白与应用

一种促进种子发育的青蒿aaser1基因及其编码的蛋白与应用
技术领域
1.本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种黄花蒿中影响种子形态发育的r2r3-myb转录因子aaser1、其编码的蛋白以及在培育优质黄花蒿种质资源中的应用。


背景技术：

2.疟疾是一种全球性疾病，它威胁着全世界约一半人口的健康。对于疟疾特别是恶性疟现有的最佳治疗方法，是以青蒿素为基础的联合疗法。青蒿素是一种合成于我国药用植物黄花蒿腺毛的倍半萜内酯过氧化物，而且黄花蒿是青蒿素的唯一天然来源。对于这种每年销售额超过亿次治疗的药物，青蒿素联合疗法的供应仍然依赖于农业生产的青蒿素。因此，培育优质的黄花蒿种质资源越来越成为人们研究的重中之重。
3.黄花蒿是主产于我国的一种常见的菊科蒿属的一年生草本植物，20世纪70年代其提取物青蒿素被发现在抗疟方面与传统的奎宁类抗疟药物具有不同的作用机理且疗效显著。目前以青蒿素为基础的药剂已成为全球治疗疟疾的首选药物。青蒿素及其衍生物不仅对疟疾等寄生虫疾病有着重要的作用，同时还具有抗炎、抗血吸虫、抗肿瘤以及免疫调节的功能，对乳腺癌、红斑狼疮、风湿等有显著疗效。开发青蒿素及其衍生物的其它用途将进一步增大青蒿素的需求。由于植物表达体系的方便、廉价等优点，利用转基因植物生产药用蛋白越来越受到重视，并迅猛发展，有些已进入商业化生产。因此，培育优质的黄花蒿种质资源，对发掘携带优异基因资源的种质材料，大规模稳定生产青蒿素，具有重大意义。
4.种业是国家战略性、基础性核心产业，种质资源是我国种业发展的基石，加强种质资源保护和育种越来越受到国家的重视。此外，有许多作物是以种子为产物，所以增大种子能大大增加这类作物的产量，具有重要的理论和应用价值。
5.经对现有技术的文献检索发现，尚无有关青蒿aaser1基因及其编码的蛋白的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，第一目的在于提供一种黄花蒿中促进种子发育的青蒿aaser1基因及其编码的蛋白；第二目的在于提供青蒿aaser1基因或蛋白的衍生品；第三目的在于提供青蒿aaser1基因及其编码的蛋白或其衍生品在制备优质黄花蒿种质资源中的应用。
7.为了实现上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
8.本发明的第一方面，提供了一种青蒿aaser1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示：
9.atgaggaatgtgttaccggcctctgttaagaaagggccatggacacatgaagaagatgaattgttgtcgagttacatcgctagagaaggagaggggcagtggcaggccctacccaagaaggcgggacttctccgttgtgggaagagctgcagactccgttggatgaactaccttcgtccttctgtcaagcgaggccacatctccgccgatgaagaagacctcatcatccggctccaccgccttcttggtaataggtggtcattaatagcgggaaggattcctgggcgtacagataa
cgagattaagaactactggaatactcaccttagcaagaagttaacaagccaagggattgatccaaagactcacaaaccattatcatcaccatcttctctaaacccaaatcacaatctaaaccattcatcttcttcaccggatcaaaccaaaactatttcaacaaattcccaagaaaacatctcaaacctcaactccatcaacccgcacagtggtcctcgatctgatgataatcttagccactcgcctgatgatgggttctcttcgttcttggattcactgatcaacgacgaaatgtgcagcgaacgcaccccaactgctctatag。
10.根据图1，该青蒿aaser1基因的核苷酸序列为828bp。
11.本发明的第二方面，提供了一种青蒿aaser1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示：
12.mrnvlpasvkkgpwtheedellssyiaregegqwqalpkkagllrcgkscrlrwmnylrpsvkrghisadeedliirlhrllgnrwsliagripgrtdneiknywnthlskkltsqgidpkthkplsspsslnpnhnlnhsssspdqtktistnsqenisnlnsinphsgprsddnlshspddgfssfldslindemcsertptal。
13.所述的青蒿aaser1基因编码的蛋白，其氨基酸序列为206aa。
14.本发明的第三方面，提供了一种青蒿aaser1重组表达载体，重组有上述所述的青蒿aaser1基因。优选的，该重组表达载体为phb-aaser1-flag。
15.本发明的第四方面，提供了一种青蒿aaser1重组菌，含有青蒿aaser1基因、其编码的青蒿aaser1蛋白或青蒿aaser1重组表达载体。优选的作为宿主的工程菌优选为大肠杆菌、农杆菌等。
16.本发明的第五方面，提供了一种青蒿aaser1基因的表达盒，其内包含用于扩增青蒿aaser1基因的引物对，一条引物序列如seq id no.3所示，另一条引物序列如seq id no.4所示：
17.正向(f)：atgaggaatgtgttaccggcctctg(seq id no.3)
18.反向(r)：ctatagagcagttggggtgcgttcg(seq id no.4)
19.本发明的第六方面，提供了一种转基因植物，重组有青蒿aaser1基因、青蒿aaser1蛋白或青蒿aaser1重组表达载体，或者转染青蒿aaser1重组菌。优选的，该转基因植物为转基因黄花蒿。
20.本发明的第七方面，提供了青蒿aaser1基因、青蒿aaser1蛋白、青蒿aaser1重组表达载体、青蒿aaser1重组菌或转基因植物在培育黄花蒿种子中的应用。
21.本发明的第八方面，提供了一种黄花蒿种子，从上述转基因植物中获取得到。该种子相较于野生黄花蒿种子，种子长度、宽度、重量分别比野生型种子增加了6.58％、20.55％、43.66％，长宽比减小了11.61％，差异有统计学意义；大种子的占比显著增大且萌芽速率明显增加。
22.本发明的第九方面，提供了一种增大黄花蒿种子形态及重量的方法，包括以下步骤：
23.a、构建aaser1基因的重组表达载体，所述的aaser1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
24.b、将步骤a的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，并将其转化黄花蒿的愈伤组织；
25.c、通过抗生素筛选得到转化成功的黄花蒿细胞，并培育使之长成完整植株，该转基因植株产生大而饱满的黄花蒿种子。
26.本发明的aaser1基因编码的蛋白是一个r2r3-myb类的转录因子，aaser1在花及花
蕾中表达量最高，其次为根，在叶片及茎中表达量极低，提示aaser1基因可能与黄花蒿的生殖发育相关，因此可以用来生产优质种质资源的黄花蒿品系，在农业生产上具有十分重要的应用。
27.具体的，通过转基因方法提高植物组织中青蒿aaser1基因的表达量，促进子叶发育，导致种子形态变大。
28.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的aaser1基因编码的蛋白可以用来生产新的具有优质种质资源的青蒿品系，在青蒿素的获得和农业生产上具有十分重要的应用；此外，在模式植物拟南芥中过表达aaser1基因，也可以增大拟南芥种子，因此aaser1基因可以促进种子发育，可以广泛用于种子类作物育种，对于种子类作物增产具有非常巨大的意义和实用价值。
附图说明
29.图1为aaser1基因结构示意图：a为cdna结构示意图；b为gdna结构示意图。
30.图2为aaser1基因组织器官表达特征分析：a图为aaser1基因组织器官表达特征半定量pcr结果；b图为aaser1基因组织器官表达特征qrt-pcr结果。其中r为根，s为茎，yl为幼嫩叶片，ml为成熟叶片，b为花蕾，f为花，下文中指代相同。
31.图3为aaser1定位于细胞核：a-d为转入peaq-aaser1-gfp载体黄花蒿叶片在不同光下观察结果，e-h为转入peaq-gfp载体黄花蒿叶片在不同光下观察结果。
32.图4为转基因植株的鉴定：共提取9株经过潮霉素筛选黄花蒿植株dna进行pcr鉴定，9株均为转基因阳性黄花蒿，pcr鉴定结果如图示，图中m为trans2k plusⅱdnamarker，1-9为不同转基因株系，n为以野生型黄花蒿dna为模板的阴性对照，p为以phb-aaser1-flag载体质粒为模板的阳性对照。
33.图5为aaser1基因表达量qrt-pcr鉴定结果，wt为野生型黄花蒿，其余为各转基因株系，sd值为3次技术重复，*p《0.05，**p《0.01。
34.图6为干燥成熟黄花蒿种子表型：a为35s:aaser1黄花蒿种子，b为野生型黄花蒿种子bar＝750μm，c为1000粒种子在200μlpcr管中所占体积对比，d为1ml35s:aaser1黄花蒿种子大小分布情况，e为1ml野生型黄花蒿种子大小分布情况，f为黄花蒿成熟胚对比情况bar＝500μm。
35.图7为干燥成熟黄花蒿种子形态尺寸统计箱式图，*p《0.05，**p《0.01。
36.图8为野生型和aaser1过表达种子萌发试验：对野生型和aaser1过表达种子在相同条件下进行种子的萌发试验，分别在40h，50h和72h时进行拍照。wt：野生型黄花蒿种子；aaser1-oe：aaser1过表达种子。h：小时；bar＝1mm。
具体实施方式
37.现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
38.本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人《分子克隆：实验室指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
39.实施例1：青蒿aaser1基因的克隆
40.1.青蒿基因组总rna的提取
41.使用试剂盒transzol up plus rna kit进行提取，剪取生长状态良好的黄花蒿叶片，按说明书步骤处理样品及总rna的分离纯化。提取完成后取10μl样品进行琼脂糖凝胶电泳，以检测总rna质量，判断是否大量降解；使用nanodrop测定a260/a280值及rna浓度，合格样品可反转录为cdna进行后续实验，剩余样品可置-80℃冰箱中冷冻保存。
42.2.青蒿aaser1基因的克隆
43.使用试剂盒transscript one-step gdna removal and cdna synthesis supermix进行黄花蒿cdna合成，以第一步提取的黄花蒿总rna为模板，在通风橱中按说明书配制第一链cdna合成反应体系如表1所示：
44.表1第一链cdna合成反应体系
[0045][0046]
反应体系配制完成后轻轻混匀并将液体低速离心至管底，置于pcr仪中，设置反应程序：25℃ 10min,42℃ 30min,85℃ 5sec。反应结束即得黄花蒿cdna，置于-20℃保存待用。
[0047]
依据下列引物进行pcr扩增：
[0048]
正向(f)：atgaggaatgtgttaccggcctctg(seq id no.3)
[0049]
反向(r)：ctatagagcagttggggtgcgttcg(seq id no.4)。
[0050]
pcr反应体系及条件如表2和表3所示：
[0051]
表2 pcr反应体系
[0052][0053]
表3 pcr反应条件
[0054][0055]
获得的pcr产物经电泳、胶回收、连接、转化，过夜培养后，挑单克隆，然后菌检、测序、比对，最后获得青蒿中aaser1基因的全长编码序列(seq id no.1)，aaser1基因的cdna和gdna的基因结构示意图如图1所示，其核苷酸序列为828bp；使用a plasmid editor软件确定目的基因的orf区域，并翻译为相应的氨基酸序列(seq id no.2)。
[0056]
实施例2：青蒿aaser1基因的时空表达分析
[0057]
1.材料准备
[0058]
根据实施例1中所使用的总rna的提取方法，分别提取黄花蒿不同部位，包括：根，茎，老叶，嫩叶，早期花苞，开花前花苞，盛花期花的总rna，并反转成cdna，获得空间表达分析的材料。
[0059]
2.实时荧光定量rt-pcr分析
[0060]
使用taq pro universal sybr qpcr master mix配制反应体系如下表4所示：
[0061]
表4实时荧光定量pcr反应体系
[0062][0063]
选取aaser1基因序列中内含子前后的两条序列为引物进行rt-pcr分析，引物设计如下：
[0064]
正向(f)：tccaccgccttcttggtaat(seq id no.5)
[0065]
反向(r)：ttggtttgatccggtgaaga(seq id no.6)。
[0066]
在quantstudio 3real-time pcr system中进行pcr反应并采集荧光信号，运行程序设置如下表5所示：
[0067]
表5实时荧光定量pcr反应条件
[0068][0069]
程序运行结束后使用仪器配套软件quantstudio design&analysis software分析数据，使用相对定量法，以actin基因为内参，以δct值最小的一组作为参照，即基因表达量最高的样品设为1。
[0070]
实验结果如图2所示，其中r为根，s为茎，yl为幼嫩叶片，ml为成熟叶片，b为花蕾，f为花。通过半定量pcr和荧光定量pcr实验分析了aaser1基因在不同器官中的表达水平，结果表明aaser1基因在花及花蕾中表达量较高，其次为根，在叶和茎中表达量极低，sd值为3次技术重复。
[0071]
实施例3：青蒿aaser1基因的亚细胞定位分析
[0072]
为进一步验证aaser1基因转录因子的性质，我们构建了aaser1基因的亚细胞定位载体，通过激光共聚焦显微镜观察转入peaq-aaser1-gfp载体的黄花蒿表皮细胞中gfp荧光的定位情况，以转入peaq-gfp空载体的样品作为对照，证实aaser1定位于细胞核，与生物信息学预测结果一致，也与其作为转录因子的功能相适应。
[0073]
1.peaq-aaser1-gfp载体转化gv3101农杆菌感受态
[0074]
从-20℃冰箱中取出peaq-aaser1-gfp于冰上融化，从-80℃冰箱中取出gv3101农杆菌感受态，置于室温中融化至冰水混合状态后置于冰上。在超净工作台中吸取20μl感受态至新的1.5ml无菌离心管中，然后吸取1μl质粒至感受态中，轻轻搅拌混匀。之后冰浴5min、液氮冷冻5min、37℃热激5min，再冰浴5min后加入700μl无抗yeb液体培养基，置于28℃恒温摇床中震荡培养2h。培养完成后低速离心收集菌体，弃去500μl上清，菌体重悬后涂布于yeb(kan 75mg/l,rif20mg/l)固体培养基平板，置于28℃恒温培养箱中培养2天。以peaq-gfp空载体作为对照，转化方法同上。然后进行阳性农杆菌筛选及培养，重悬液配制并进行nb烟草叶片注射。
[0075]
2.激光共聚焦显微镜下观察荧光
[0076]
暗培养结束后，剪取一小片浸染过的黄花蒿叶片制片，置于激光共聚焦显微镜下观察。在波长488nm激发光下，gfp蛋白会发出绿色荧光，叶绿体会有红色自发荧光。设置共聚焦显微镜参数，激发光波长为488nm，绿色荧光接收波长为505-530nm，红色荧光接收波长为650-800nm。在激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录gfp蛋白荧光情况及分布特征，见图3。结果显示转入peaq-aaser1-gfp载体黄花蒿叶片在不同光下观察结果，仅能在细胞核中观察到gfp信号，表明aaser1定位于细胞核，与转录因子的功能相一致。
[0077]
实施例4：青蒿aaser1基因过表达植株表型观察
[0078]
1.aaser1基因过表达植株构建与鉴定
[0079]
共提取9株经过潮霉素筛选黄花蒿植株dna，并进行pcr鉴定，9株均为转基因阳性黄花蒿。pcr鉴定结果如图4所示，图中m为trans2k plusⅱdnamarker，1-9为不同转基因株
系，n为以野生型黄花蒿dna为模板的阴性对照，p为以phb-aaser1-flag载体质粒为模板的阳性对照。
[0080]
通过qrt-pcr鉴定出转基因阳性植株中aaser1基因表达量，表达量显著提高的株系如图5所示，其中oe-3株系表达量提高215倍，其余株系提高14-33倍。
[0081]
2.转aaser1基因可以增大模式植物拟南芥种子
[0082]
35s:aaser1转基因拟南芥收种后，测量长度、宽度、百粒重等数据，统计结果见下表6。与野生型种子相比，35s:aaser1种子宽度较野生型增加p《0.01长宽比减小p《0.05，百粒重增加p《0.01；种子长度相近p》0.05。
[0083]
表6干燥成熟拟南芥种子形态尺寸和重量测定
[0084][0085]
*p＜0.05，**p＜0.01
[0086]
3.aaser1基因过表达可显著增大黄花蒿种子大小和重量，并加快萌发速率
[0087]
与野生型种子相比，35s:aaser1的种子显著增大，如图6a、b所示，其中a为35s:aaser1黄花蒿种子，b为野生型黄花蒿种子bar＝750μm；各计数1000粒种子置于200μlpcr管中，可见35s:aaser1种子体积较野生型明显增加(图6c～e)。种子浸泡后在体视镜下小心剥去果皮和种皮，可见35s:aaser1子叶形态较野生型明显增大(图6f)。测量结果表明35s:aaser1种子长度、宽度、重量分别比野生型种子增加了6.58％、20.55％、43.66％，长宽比减小了11.61％，差异有统计学意义。
[0088]
测量过程中我们发现黄花蒿种子大小变异较大，如图7所示，为初步了解种子大小的分布情况我们各量取1ml种子使用45目和50目筛(孔径分别为400μm和355μm)将种子分为小中大三类结果如图6de所示35s:aaser1小中大种子体积比约为2:3:15，野生型小中大种子体积比约为3:1:1，可见35s:aaser1大种子的占比显著增大。
[0089]
接下来，我们对aaser1过表达的种子和野生型种子进行了萌发试验，发现aaser1过表达种子萌发速率明显加快(图8)，在种子萌发40小时左右，可以观察到aaser1过表达种子均已发芽而野生型种子却没有；在萌发50小时野生型种子出现了萌芽表型而aaser1过表达种子已经明显出现了双子叶且根部已出现；在萌发72小时后，二者之间的差异十分明显，aaser1过表达种子子叶变绿，茎生长相对较长。我们推测aaser1的过表达种子可以促进淀粉等营养物质的积累增多。
[0090]
总之，本发明提供了一个黄花蒿r2r3-myb类转录因子aaser1编码序列在培育优质黄花蒿种质资源中的应用。亚细胞定位实验证明aaser1定位于细胞核中，与生物信息学分析中的预测结果一致，符合其作为转录因子的特性。通过半定量pcr和qrt-pcr探究了aaser1基因在不同组织中的表达特征，结果表明aaser1在花及花蕾中表达量最高，其次为根，在叶片及茎中表达量极低。gus染色实验结果也印证了这一结论，目前观察到少量头状花序中的个别管状花以及部分幼嫩的根被染为蓝色，值得注意的是在被染色的管状花中，除花冠外，花丝、柱头及部分花粉粒均被染为蓝色，提示aaser1基因可能与黄花蒿的生殖发育相关。
[0091]
我们构建了aaser1基因过表达植株，分析发现，aaser1过表达能促进了黄花蒿种子的发育，种子的大小、重量均明显增加，通过对种子的解剖初步判断是促进了子叶发育导致的种子形态变化。aaser1在模式植物拟南芥中过表达也促进了种子的发育，能使拟南芥种子的宽度和重量显著增加。通过对种子大小进行分类，我们发现野生型黄花蒿种子中形态小的种子占大多数，结合aaser1基因在花中独特的表达特征，我们推测aaser1基因的表达可以有效促进种子的发育从而产生大而饱满的种子，但因其仅在少数管状花中有表达，因此产生大种子的数量很少，而过表达aaser1基因导致了发育为大种子的比例大幅上升。综上所述，aaser1基因可以用来培育具有优质种质资源的黄花蒿品系，在青蒿素的获得和农业生产上具有十分重要的应用，同时aaser1基因也可以用于增加模式植物拟南芥以及其他作物的种子大小，对于种子类作物增产具有非常巨大的意义和实用价值。
[0092]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。

技术特征：
1.一种青蒿aaser1基因，其特征在于，该青蒿aaser1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.权利要求1所述的青蒿aaser1基因编码的青蒿aaser1蛋白，其特征在于，该蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.一种青蒿aaser1重组表达载体，其特征在于，重组有权利要求1所述的青蒿aaser1基因。4.一种青蒿aaser1重组菌，其特征在于，含有权利要求1所述的青蒿aaser1基因、权利要求2所述的青蒿aaser1蛋白或权利要求3所述的青蒿aaser1重组表达载体。5.一种青蒿aaser1基因的表达盒，其特征在于，包含用于扩增青蒿aaser1基因的引物对，一条引物序列如seq id no.3所示，另一条引物序列如seq id no.4所示。6.一种转基因植物，其特征在于，含有权利要求1所述的青蒿aaser1基因、权利要求2所述的青蒿aaser1蛋白、权利要求3所述的青蒿aaser1重组表达载体或权利要求4所述的青蒿aaser1重组菌。7.根据权利要求6所述的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物为转基因黄花蒿，重组表达载体为phb-aaser1-flag，重组菌为农杆菌或大肠杆菌。8.权利要求1所述的青蒿aaser1基因、权利要求2所述的青蒿aaser1蛋白、权利要求3所述的青蒿aaser1重组表达载体、权利要求4所述的青蒿aaser1重组菌或权利要求6所述的转基因植物在培育黄花蒿种子中的应用。9.一种黄花蒿种子，其特征在于，从权利要求6所述的转基因植物中获取得到。10.一种增大黄花蒿种子形态及重量的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、构建aaser1基因的重组表达载体，所述的aaser1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；b、将步骤a的重组表达载体转入宿主细胞农杆菌，并将其转化黄花蒿的愈伤组织；c、通过抗生素筛选得到转化成功的黄花蒿细胞，并培育使之长成完整植株。

技术总结
本发明涉及植物生物技术领域，提供了一种促进种子发育的青蒿AaSER1基因及其编码的蛋白与应用。本发明的青蒿AaSER1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白R2R3-MYB类转录因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供一种通过AaSER1来使种子形态及重量均显著增大的方法：将包含SEQ ID NO.1所示基因的植物表达载体转化入黄花蒿细胞；培育转化的黄花蒿细胞，得到AaSER1基因过表达的黄花蒿植株。本发明AaSER1基因编码的蛋白可以用来显著增大黄花蒿及模式植物拟南芥的种子形态及重量，既可以用于培育优质黄花蒿种质资源，也可以作为提高模式植物拟南芥以及种子类作物产量的重要突破口，对AaSER1基因的合理运用具有重要的现实意义。用具有重要的现实意义。用具有重要的现实意义。


技术研发人员：谭何新 潘百威 常淑伟 李澄越 李琦 李明育
受保护的技术使用者：中国人民解放军海军军医大学
技术研发日：2023.03.07
技术公布日：2023/9/20