TDP1和Eltrombopag在治疗强直性肌营养不良2型中的应用的制作方法

tdp1和eltrombopag在治疗强直性肌营养不良2型中的应用
技术领域
1.本发明涉及tdp1和eltrombopag在治疗强直性肌营养不良2型中的应用，尤其涉及eltrombopag在制备tdp1抑制剂及治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用，属于生物医药领域。


背景技术：

2.强直性肌营养不良(myotonic dystrophy,dm)是成人最常见的显性遗传性神经肌肉疾病之一，强直性肌营养不良患者的病症特征是肌强直、进行性肌无力和肌肉消瘦，常累及多个组织，还可引起心功能障碍、胰岛素抵抗、过度嗜睡、智力障碍和认知障碍等。根据发病原因等不同，强直性肌营养不良可分为1型和2型，2型(dm2)通常是位于锌指蛋白9基因(znf9)第一个内含子中cctg重复扩增导致。酪氨酰-dna磷酸二酯酶1(tyrosyl-dna phosphodiesterase 1，tdp1)，能够水解拓扑异构酶1(top1)和dna3`磷酸之间的结合。为了去除dna复制和转录形成的超螺旋结构，top1能够催化单链dna瞬时断裂，tdp1通过水解top1和dna之间的磷酸二酯键去除top1，从而修复缺口。未有研究表明其在cctg重复疾病，特别是强直性肌营养不良2型，具有治疗或预防作用。
3.eltrombopag(艾曲泊帕)，是一种thrombopoietin receptor(tpor)的非肽类激动剂，其化学结构式如式1所示，其分子式为c
25h22
n4o4，分子量为442.5。eltrombopag主要用于治疗特发性免疫性血小板减少症，当前没有将其用作tdp1抑制剂及治疗强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病药物的报道。
4.

技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供eltrombopag在制备tdp1抑制剂及治疗强直性肌营养不良2型疾病药物中的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
7.tdp1在作为强直性肌营养不良2型的治疗靶点中的应用。
8.tdp1在作为靶点在开发或设计预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用。
9.能够抑制tdp1基因表达或者能够抑制tdp1蛋白活性的物质在制备用于预防或治疗强直性肌营养不良2型的产品中的应用。
10.进一步地，所述能够抑制tdp1基因表达的物质包括但不限于tdp1 sirna或影响tdp1表达的基因编辑工具。
11.可选地，所述影响tdp1表达包括敲除、替换或修饰tdp1中的若干个碱基。
12.进一步地，所述能够抑制tdp1蛋白活性的物质包括能够抑制tdp1蛋白活性的化合物。
13.tdp1抑制剂在制备预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用。
14.eltrombopag在制备tdp1抑制剂中的应用。
15.eltrombopag在制备预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用。
16.可选地，所述药物还包含任选的其他治疗强直性肌营养不良2型的药物和/或药物可用的辅料。
17.进一步地，tdp1抑制剂通过调节cctg重复序列收缩来治疗强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病。
18.进一步地，所述的强直性肌营养不良2型的表现为人神经系统异常包括认知功能障碍、睡眠障碍、震颤、麻痹、瘫痪等中的一种或几种。
19.进一步地，所述的强直性肌营养不良2型还表现为人肌肉系统肌肉萎缩、疼痛、强直和进行性无力中的一种或几种。
20.本发明可帮助克服当前缺乏有效治疗药物治疗强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病的问题。
21.本发明公开了一种小分子化合物eltrombopag在制备预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用，本发明首次提出在强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病果蝇模型中，eltrombopag能显著下调tdp1的蛋白活性，进而缩减cctg重复数目，缓解由于重复扩增导致的神经变性。给药过程中对野生型果蝇未显示明显的毒性，同时eltrombopag为fda认证小分子化合物，容易通过血脑屏障到达脑部发挥作用。因此，eltrombopag可被制作成一种强直性肌营养不良2型的预防或治疗药物，拥有很好的临床治疗应用前景。
22.本发明使用小分子化合物eltrombopag在体外测试其对tdp1蛋白活性抑制效果，发现其能显著抑制tdp1酶活性，将其配置成药物培养基，饲养强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病果蝇模型。发现eltrombopag可以抑制强直性肌营养不良2型果蝇模型的多种疾病表型。通过tdp1的小分子化合物抑制剂抑制强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病果蝇模型神经变性，改善cctg重复果蝇模型运动缺陷，用于治疗强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病。
23.本发明利用果蝇模型筛选到的小分子化合物eltrombopag，通过抑制tdp1蛋白质活性，能够有效拯救强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病果蝇的神经变性，减少色素生成阻滞、细胞死亡和小眼融合，并改善cctg重复果蝇模型运动缺陷，且在给药过程中未显示明显的毒性。本发明为预防或治疗强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病提供了新的药效物质和作用靶点，扩宽了eltrombopag在医药上的用途。本发明在为强直性肌营养不良2型的cctg重复扩增疾病的治疗提供了一种具有临床应用前景的新型药物和药物靶点。
附图说明
24.图1是本发明相关实施例所用果蝇的杂交方案示意图。
25.图2是cctg重复果蝇模型中，tdp1遗传敲低影响复眼的神经变性情况图，其中图2a分别为为gmr》cctg
16
,gmr》cctg
16
+tdp1 rnai,gmr》cctg
720
和gmr》cctg
720
+tdp1 rnai基因型
果蝇复眼光镜图，图2b为果蝇复眼神经变性严重程度打分图。
26.图3是cctg重复果蝇模型中，tdp1敲低影响果蝇的运动能力图，其中图3a为mef2》cctg
16
和mef2》cctg
720
基因型果蝇的运动情况图，图3b为mef2》cctg
720
组和mef2》cctg
720
+tdp1 rnai基因型果蝇的运动情况图。
27.图4是cctg重复果蝇模型中，tdp1敲低影响cctg重复尺寸结果图，其中图4a为mef2》cctg
720
和mef2》cctg
720
+tdp1 rnai基因型果蝇的胸部dna经pcr扩增后安捷伦芯片电泳胶图，图4b为各基因型统计的cctg重复平均长度。
28.图5是eltrombopag在体外对tdp1酶活性抑制效果图，图5a为tdp1蛋白在dmso或80μmeltrombopag作用下与底物孵育的荧光强度图，图5b为tdp1蛋白在0、5、10、15、25、35、50、100μg/ml eltrombopag作用下与底物孵育的相对活性(以0μm为100％)，并统计ic50为14.12μg/ml。
29.图6是eltrombopag影响cctg重复果蝇异常选择性剪切图，fhos基因是经典的强直性肌营养不良2型下游受影响基因。正常的fhos基因成熟剪切本含有exon 10，但cctg重复导致的异常剪切使剪切本不含有exon 10。图6a为mef2》cctg
16
、mef2》cctg
720
和mef2》cctg
720
+eltrombopag处理组果蝇含有和不含有ex on 10的剪切本的pcr胶图，图6b为胶图灰度分析结果。
30.图7是eltrombopag影响cctg重复果蝇的细胞核foci图，使用cy3-cagg探针与mef2》cctg
16
、mef2》cctg
720
和mef2》cctg
720
+tdp1 rnai基因型果蝇3龄幼虫体壁肌肉进行杂交，检测ccug毒性rna的聚集。图7a为激光共聚焦显微镜观察的原位杂交结果图，图7b为ccug毒性rna的平均聚集面积大小统计图(根据图7a中cy3-cagg相关图片计算获得)。
31.图8是eltrombopag拯救cctg重复果蝇肌肉退化图。图8a为对mef2》cctg
16
、mef2》cctg
720
和mef2》cctg
720
+eltrombopag处理组果蝇胸部肌肉进行石蜡切片和he染色结果图，图8b为根据染色结果图统计的平均肌肉面积。
32.图9是eltrombopag拯救cctg重复果蝇复眼神经变性图。图9a为gmr》cctg
16
、gmr》cctg
720
和gmr》cctg
720
+eltrombopag处理组果蝇复眼光镜图。图9b为果蝇复眼神经变性严重程度打分图。
33.图10是eltrombopag拯救cctg重复果蝇运动能力图。图10a为mef2》
34.cctg
16
、mef2》cctg
720
组和mef2》cctg
720
+eltrombopag处理组果蝇的运动情况图。图10b为根据运动情况图统计果蝇相对运动活力图。
具体实施方式
35.以下将结合实施例来详细说明本发明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
36.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
37.果蝇品系：
38.mef2-gal4工具果蝇(可以驱动uas-基因在肌肉中特异性表达)、gmr-gal4工具果蝇(可以驱动uas-基因在复眼中特异性表达)、tdp1 rnai果蝇和db果蝇购自美国bloomington drosophila stock center。db果蝇是一种在果蝇2号和3号染色体的2对4条染色体中上分别具有4种平衡子的工具果蝇，4种平衡子可分别使果蝇具备4种不同易于观
察的表型，且可使果蝇染色体不发生重组。
39.cctg重复果蝇模型，即uas-cctg
16
和uas-cctg
720
果蝇，由美国宾夕法尼亚大学nancy m.bonini教授赠送。
40.果蝇使用根据bloomington drosophila stock center网站推荐的bdsc cornmeal food配方制备的玉米粉-大豆粉-酵母培养基喂养，在25℃的恒温条件下培养和杂交。
41.杂交方案：
42.a:收集羽化8小时内的mef2-gal4或者gmr-gal4雌性果蝇(处女蝇)，与uas-cctg
16
、uas-cctg
720
和tdp1 rnai雄性果蝇放于同一玻璃管中，雌雄果蝇即会在约12小时后自行发生交配产下子代，约培养10天后，子代羽化为成虫，收集子代，获得mef2》cctg
16
、mef2》cctg
720
、gmr》cctg
16
、gmr》cctg
720
和gmr》tdp1 rnai基因型果蝇。
43.b:收集羽化8小时内的mef2-gal4雌性果蝇(处女蝇)与uas-cctg
720
雄性果蝇杂交，收集f1代处女蝇与db果蝇杂交，单只f2代处女蝇与db果蝇杂交，通过pcr扩增子代gal4序列和cctg重复侧翼序列，鉴定是否为重组果蝇，获得f3代mef2》cctg
720
基因型果蝇，用于与tdp1rnai杂交，获得f4代mef2》cctg
720
+tdp1 rnai果蝇。
44.c:收集羽化8小时内的db雌性果蝇(处女蝇)分别与gmr-gal4和uas-cctg
720
雄性果蝇杂交，收集f1代果蝇，将这两种f1代果蝇杂交，通过平衡子，获得f2代gmr》cctg
720
基因型果蝇，用于与tdp1 rnai杂交，获得f3代gmr》cctg
720
+tdp1 rnai果蝇。
45.具体的杂交方案见图1a、b、c，“—”上下分别表示两条同源染色体基因型，“；”前后表示2号和3号染色体基因型，“+”表示野生型(两条或其中一条同源染色体上无任何gal4或基因)，“x”表示杂交。
46.实验试剂：
47.药物培养基制备：取500μl玉米粉-大豆粉-酵母培养基，1μl药物(药物中eltrombopag的浓度为10mm，溶剂为dmso)，2μl苹果绿色素(用于指示药物是否混匀)加至5ml离心管中，涡旋混匀器混匀，冷却后4℃保存。eltrombopag终浓度约为20μm。
48.非药物培养基制备：取500μl玉米粉-酵母培养基，1μl dmso，2μl苹果绿色素(指示药物是否混匀)加至5ml离心管中，涡旋混匀器混匀，冷却后4℃保存。
49.dmso购买自sigma-aldrich公司，货号d2438。
50.高gc-pcr使用的试剂盒来自takara公司的takara lawith gc buffer，货号为rr02bg。
51.high sensitivity dna kit购买自安捷伦公司，货号5067-4626。
52.dna和rna提取试剂盒购买自擎科公司，货号tsp201-200和tsp413。
53.逆转录试剂盒购买自诺唯赞公司，货号r312-02。
54.tdp1蛋白购买自abcam公司，货号ab131921。
55.dna片段和底物均合成自生工公司。tris-hcl、kcl、dtt、edta、triton x-100和4％pfa均购买自生工公司，货号依次为b548127-0500、a501159-0500、a300862-0005、b540625-0005、a110694-0100和e672002-0500。
56.石蜡购买自生工公司，货号为a601888-0500，苏木素伊红染色试剂盒购买自碧云天公司，货号为c0105s。
57.仪器设备如表1所示：
58.表1
[0059][0060][0061]
实施例1：在cctg重复果蝇模型中敲低tdp1拯救其复眼变性表型
[0062]
gmr组》cctg
16
：如杂交方案所述获得gmr》cctg
16
果蝇，收集雄性果蝇，于co2通气板麻醉后，光镜观察羽化拍照第7天的雄性果蝇(n≥100)复眼表型；
[0063]
gmr》tdp1 rnai组：在所述培养基饲养gmr》tdp1 rnai在神经系统敲低tdp1的果蝇(通过上述杂交方案进行杂交，下同)；
[0064]
gmr》cctg
720
组：在所述培养基饲养gmr》cctg
720
在神经系统表达cctg毒性重复的果蝇；
[0065]
gmr》cctg
720
+tdp1 rnai组：在所述培养基饲养在神经系统敲低tdp1以及表达cctg毒性重复的果蝇；
[0066]
上述基因型同时还利用扫描电镜对果蝇复眼进行拍照，并根据复眼面积减少、色素脱失、结痂斑点(视神经元坏死)和视网膜塌陷四个指标的影响面积进行评分，正常为0分，当影响面积在0～15％为10分，影响面积在15～40％为20分，影响面积在40～65％为30分，65％以上为40分，将四项指标评分相加即为最终得分，分数越高表明果蝇复眼变性程度越深。如图2所示，tdp1敲低显著拯救了cctg重复果蝇中复眼色素脱失和结痂斑点的表型。
[0067]
实施例2：tdp1敲低对cctg重复果蝇模型运动活性的影响
[0068]
在果蝇运动能力检测系统中放入相应果蝇后，由系统自动监测果蝇活动行为，用于果蝇运动能力、活跃频率以及昼夜节律的检测。具体地，收集羽化第15天目的基因型子代雄性果蝇(n≥30)，每支装有培养基的玻璃小管中装入1只果蝇，通过果蝇运动能力检测系统监测运动能力，玻璃管正中存在激光射线，系统会自动统计果蝇通过次数，每30min记录一次总运动数据即果蝇通过玻璃管正中次数，从羽化后第15天监测至第25天及以后。其中，目的基因型包括mef2》cctg
16
，mef2》cctg
720
和mef2》cctg
720
+tdp1 rnai(通过上述杂交方案获得，下同)三种，每种基因型进行三次以上重复实验，统计不同基因型果蝇在羽化后第15天监测至第25天的10d内通过玻璃管正中次数，mef2-gal4型设为活动能力为100％，其余基因型则据此计算相对活动能力。
[0069]
如图3所示，tdp1敲低可显著改善mef2》cctg
720
在神经系统表达cctg
720
导致的爬行障碍。
[0070]
实施例3：tdp1敲低对cctg重复果蝇模型cctg重复数目的影响
[0071]
在提取果蝇成虫胸部肌肉dna后，利用takara公司的高gc-pcr试剂盒扩增cctg重复片段，联合安捷伦高灵敏度dna芯片检测重复数目缩减情况。具体地，收集羽化第15天目的基因型子代雄性果蝇(n＝5)，剪取胸部肌肉组织，按照dna提取试剂盒提供的说明书使用试剂盒提取目的dna，使用la taq酶进行高gc-pcr扩增后，利用high sensitivity dnakit在2100生物分析仪上分析片段长度和分布。
[0072]
如图4所示，tdp1敲低可显著缩减果蝇胸部cctg
720
重复片段长度。
[0073]
实施例4：eltrombopag在体外对tdp1酶活性抑制效果
[0074]
合成5`-fam-aaagcaggc ttc aac gcaactgtg aag atc gct tgg gtg cgt tga agc ctg ctt t-bhq1-3`作为tdp1酶活性底物，加入20ng购自abcam公司的tdp1蛋白，加入dmso作为对照或终浓度为80um小分子抑制剂，dna底物终浓度为0.5um，其余反应buffer为20mm tris-hcl ph 8,100mm kcl,10mm dtt,10mm edta,and 0.05％ triton x-100，总体积为25ul。酶标仪中37℃反应1h。
[0075]
如图5所示，荧光检测发现eltrombopag可以抑制tdp1蛋白活性，为tdp1蛋白的有效抑制剂。
[0076]
实施例5：eltrombopag拯救cctg重复果蝇模型异常选择性剪切
[0077]
强直性肌营养不良主要是由于毒性rna影响剪切调控蛋白，进而导致下游一系列基因选择性剪切异常。按照rna提取试剂盒说明书使用试剂盒提取果蝇成虫胸部rna，再通过逆转录试剂盒逆转录为cdna，pcr扩增fhos基因的exon 10和周围区域，琼脂糖凝胶电泳分析含有和不含有exon10的转录本相对量。
[0078]
mef2》cctg
16
组：如杂交方案所述获得目的基因型果蝇，在所述非药物培养基饲养mef2》cctg
16
果蝇至羽化后15d；
[0079]
mef2》cctg
720
组：如杂交方案所述获得目的基因型果蝇，在所述非药物培养基饲养mef2》cctg
720
果蝇至羽化后15d；
[0080]
mef2》cctg
720
+eltrombopag组：如杂交方案所述获得目的基因型果蝇，在所述药物培养基饲养mef2》cctg
720
果蝇至羽化后15d；
[0081]
收集羽化第15天上述组雄性果蝇(n＝10)，剪取胸部肌肉组织，按照rna提取试剂盒说明书使用试剂盒提取rna，通过逆转录试剂盒逆转录为cdna，pcr扩增fhos基因的exon 10和周围区域，琼脂糖凝胶电泳分析含有和不含有exon 10的转录本相对量，进而fhos的选择性剪切，如图6所示，eltrombopag喂养dm2模型果蝇，mef2》cctg
16
组正常果蝇体内大部分为+exon 10的转录本，mef2》cctg
720
组异常组则一般左右为-exon 10的转录本，而eltrombopag可以有效缓解果蝇fhos基因的选择性剪切异常。
[0082]
实施例6：eltrombopag拯救cctg重复果蝇模型毒性rna聚集
[0083]
强直性肌营养不良2型患者会在肌肉细胞核中形成毒性rna聚集foci，foci是表征疾病严重程度的良好指标。基因型如实施例5，解剖目的基因型果蝇三龄幼虫，4％pfa固定，使用cy5-caggcaggcaggcaggcagg-cy5探针以及dapi染料与mef2》cctg
16
、mef2》cctg
720
和mef2》cctg
720
+eltrombopag组幼虫胸部肌肉孵育过夜，pbs溶液洗去探针和染料，激光显微镜检测荧光。
[0084]
如图7所示，eltrombopag可以有效拯救cctg重复果蝇肌肉细胞核中毒性rna的聚
集。
[0085]
实施例7：eltrombopag拯救cctg重复果蝇模型肌肉变性
[0086]
收集羽化后15天雄果蝇，胸部肌肉石蜡切片，苏木素伊红染色，显微镜观察肌肉大小。选取如实施例5所示目的基因型雄果蝇，放入4％pfa溶液中进行固定，放入无水乙醇溶液进行脱水。在已设定的65℃杂交炉中，将果蝇放入已融化的石蜡溶液中1小时进行透蜡，随后室温冷却，将石蜡块进行切片，并使用苏木素伊红染色试剂盒进行染色，显微镜下观察统计肌肉面积。
[0087]
如图8所示，eltrombopag可以有效恢复cctg重复果蝇模型胸部肌肉萎缩表型，拯救肌肉面积减少等症状。
[0088]
实施例8：eltrombopag可以有效拯救cctg重复果蝇模型复眼变性
[0089]
如实施例1，选择羽化后7d的gmr》cctg
16
组、gmr》cctg
720
组和gmr》cctg
720
+eltrombopag组果蝇，收集雄性果蝇，于co2通气板麻醉后，体式显微镜下，光镜观察羽化拍照第7天的雄性果蝇(n≥100)复眼表型，并拍照。根据复眼面积减少、色素脱失、结痂斑点(视神经元坏死)和视网膜塌陷四个指标的影响面积进行严重程度评分，正常为0分，当影响面积在0～15％为10分，影响面积在15～40％为20分，影响面积在40～65％为30分，65％以上为40分，将四项指标评分相加即为最终得分，分数越高表明果蝇复眼变性程度越深。
[0090]
如图9所示，eltrombopag可以有效拯救cctg重复果蝇模型复眼变性。
[0091]
实施例9：eltrombopag可以有效拯救cctg重复果蝇模型运动活性
[0092]
如实施例2，对羽化后15-25d的mef2》cctg
16
组，mef2》cctg
720
组和mef2》cctg
720
+eltrombopag组果蝇检测其运动能力、活跃频率。具体地，收集羽化第15天子代雄性果蝇(n≥30)，每支装有培养基的玻璃小管中装入1只果蝇，通过果蝇运动能力检测系统监测运动能力，每30min记录一次运动数据，从羽化后第15天监测至第25天及以后。统计不同基因型果蝇在羽化后第15天监测至第25天的10d内通过玻璃管正中次数，mef2》cctg
16
型设为活动能力为100％，其余基因型则据此计算相对活动能力。
[0093]
如图10所示，eltrombopag可以有效拯救cctg重复果蝇模型运动活性。
[0094]
上述实施例阐明的内容应当理解为这些实施例仅用于更清楚地说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本技术所附权利要求所限定的范围。

技术特征：
1.tdp1在作为强直性肌营养不良2型治疗靶点中的应用。2.tdp1在作为靶点在开发或设计预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用。3.tdp1抑制剂在制备预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用。4.eltrombopag在制备tdp1抑制剂中的应用。5.eltrombopag在制备预防或治疗强直性肌营养不良2型的药物中的应用。

技术总结
本发明涉及TDP1和Eltrombopag在治疗强直性肌营养不良2型的中的应用。本发明利用果蝇模型鉴定出TDP1敲低能够有效拯救CCTG重复果蝇模型的神经变性，减少色素生成阻滞、细胞死亡和小眼融合，并改善运动缺陷，同时利用小分子进行体外筛选，发现Eltrombopag可作为TDP1抑制剂，可以显著减轻疾病细胞毒性。本发明为强直性肌营养不良2型的CCTG重复以扩增疾病提供了新的作用靶点和药效物质，扩宽了Eltrombopag在医药上的用途。本发明在为强直性肌营养不良2型的CCTG重复扩增疾病治疗提供了一种具有临床应用前景的新型药物。了一种具有临床应用前景的新型药物。


技术研发人员：段然慧 王凌云 朱英保 李光旭
受保护的技术使用者：浙江瀚维科技有限责任公司
技术研发日：2023.04.26
技术公布日：2023/9/20