一种基于H5N6禽流感病毒HA蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒及其制备方法与应用与流程

一种基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及禽流感疫苗制备领域，特别涉及一种基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒及其制备方法与应用。


背景技术：

2.禽流感(avian influenza,ai)是由禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)引起的一种禽类呼吸道传染病。根据禽流感病毒在家禽中的毒力分为两种病理型，即高致病性禽流感病毒(high pathogenic avian influenza virus,hpaiv)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,lpaiv)，高致病性禽流感病毒源于h5或h7亚型低致病性禽流感病毒。目前，针对h5亚型禽流感传播的免疫防控措施为接种灭活疫苗。然而，灭活疫苗在制备过程中涉及活病毒操作，生产周期长，生物安全隐患大，需要开发其他类型的禽流感疫苗。亚单位疫苗的制备过程能够规避对活病毒的操作，有效地缩短疫苗生产周期，降低生产成本，能够很好地补充灭活疫苗的不足。
3.纳米颗粒(nanoparticles,nps)是指尺寸为1～1000nm的颗粒，由于其大小与细胞成分相似，纳米颗粒疫苗可以通过细胞内吞方式进入活细胞，从而刺激不同的免疫细胞来增强宿主的免疫力。铁蛋白是一种接近球形的蛋白纳米颗粒，外径约为12nm，内径为8nm，具有良好的生物相容性，通过中间体自组装成具有对称性的八面体笼状结构，可用于批量生产。铁蛋白外表面表位呈现均匀，能够负载抗原，诱导机体产生更强的免疫反应。
4.目前，已经有铁蛋白纳米笼开发疫苗的案例。基于铁蛋白的流感疫苗的研究首次出现于2013年，为kanekiyo等人将流感病毒血凝素(ha)融合到幽门螺杆菌铁蛋白表面，其改造方式为将流感病毒ha核酸序列通过linker结构连接到幽门螺杆菌ferritin核酸序列的n端。这种方法设计出来的纳米颗粒蛋白所引起的抗体滴度远超于灭活疫苗，能够很好的保护雪貂免受流感病毒的侵害。基于这种结构的自组装纳米颗粒疫苗能够提高机体免疫效力，并且制备安全，具有广阔的开发前景。但对于禽流感疫苗，存在产生的抗体水平较低，保护效果较差的缺陷，因此，开发一种能够刺激机体产生更高水平的抗体的禽流感疫苗具有重要现实意义。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒。
6.本发明的另一目的在于提供所述基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供所述基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒的应用。
8.本发明的目的通过下述技术方案实现：
9.一种基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒，是通过ha-ferritin蛋白自组装形成纳米颗粒；其中，ha-ferritin蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
10.编码所述ha-ferritin蛋白的基因序列如seq id no:1所示。
11.所述的ha-ferritin蛋白通过如下方法获得：将编码所述ha-ferritin蛋白的基因序列通过柔性连接肽ser-gly-gly连接到幽门螺杆菌铁蛋白ferritin序列的n端。
12.所述的ha-ferritin蛋白中的ha蛋白来自h5n6亚型禽流感病毒流行毒株gdjm株(h5n6-20053)，其氨基酸序列如seq id no:4所示。
13.编码所述ha蛋白的基因序列如seq id no:3所示。
14.所述的ha-ferritin蛋白中的铁蛋白为来源于幽门螺杆菌，其氨基酸序列如seq id no:6所示。
15.编码所述铁蛋白的基因序列如seq id no:5所示。
16.所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
17.(1)将编码ha-ferritin蛋白的基因序列连接到昆虫表达系统载体上，得到重组转移质粒；
18.(2)将重组转移质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒；
19.(3)将重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒；
20.(4)将重组杆状病毒继续感染昆虫细胞，并表达外源ha-ferritin蛋白，得到基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒。
21.步骤(1)中所述的编码ha-ferritin蛋白的基因序列如seq id no:1所示，其n端融合kozak序列。
22.步骤(1)中所述的昆虫表达系统载体优选为昆虫表达系统载体pfastbacdual。
23.步骤(2)中所述的大肠杆菌感受态细胞优选为大肠杆菌dh10bac感受态细胞。
24.步骤(3)和(4)中所述的昆虫细胞优选为sf9昆虫细胞。
25.步骤(3)中所述的重组杆状病毒的原始病毒为昆虫细胞中的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)。
26.所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒在制备禽流感病毒亚单位疫苗中的应用。
27.所述的禽流感病毒为h5n6禽流感病毒；优选为h5n6亚型禽流感病毒流行毒株gdjm株或h5n6亚型禽流感病毒a/wildfowl/guangdong/gz882/2015(h5n6)。
28.一种禽流感病毒亚单位疫苗，含有上述基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒。
29.所述的禽流感亚单位疫苗还含有佐剂。
30.所述的佐剂优选为白油佐剂；进一步优选为seppic montanide
tm isa 78vg。
31.本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
32.1、本发明提供了一种基于h5n6禽流感病毒的ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒，并命名为ha-ferritin蛋白，并且通过动物实验验证了ha-ferritin蛋白的免疫原性。
33.2、本发明提供的自组装纳米颗粒结构的ha-ferritin蛋白可以由昆虫-杆状病毒
表达系统bac-to-bac表达，其制备方法不涉及活病毒操作，生物安全性高，成本低廉，适合大批量生产。
34.3、本发明的ha-ferritin蛋白与seppic montanide
tm isa 78vg配合免疫spf鸡后，针对同源和异源h5n6禽流感病毒，能够产生足够的hi抗体，相比较野生型ha蛋白，可刺激机体更快地产生更高水平的中和抗体，并针对致死量的h5n6禽流感病毒的攻击，以10log2的剂量免疫接种1次，即可实现完全保护，具有良好的免疫原性，可为后续禽流感纳米颗粒疫苗的开发提供新的思路。
附图说明
35.图1为重组质粒pfastbacdual-ha-ferritin的鉴定结果图(图中，泳道m为dna marker(dl 5000marker)；泳道1为bamh i、ecor i双酶切质粒pfastbacdual-ha-ferritin获得的dna片段；泳道2为以ddh2o为模板的阴性对照(nc))。
36.图2为重组杆粒bacmid-ha-ferritin的鉴定结果图(图中，泳道m为dna maker(dl 5000marker)；
37.泳道1-3为以阳性重组白斑为模板扩增外源基因；泳道4为以阴性蓝斑为模板扩增的阴性对照)。
38.图3为重组杆状病毒rbv-ha-ferritin的鉴定结果图。
39.图4为重组纳米颗粒蛋白ha-ferritin western blot鉴定结果图(图中，泳道m为protein maker(180kda)；泳道1为原始ha蛋白样品；泳道2为ha-ferritin纳米颗粒蛋白样品；泳道3为对照细胞处理样品)。
40.图5为重组纳米颗粒蛋白ha-ferritin透射电镜鉴定结果图；其中，a和b为不同视野下ha-ferritin蛋白的透射电镜观察结果。
41.图6为针对同源h5n6-20053病毒株，免疫后第2周和第3周鸡hi抗体水平的检测结果图。
42.图7为针对异源h5n6-d829病毒株，免疫后第2周和第3周鸡hi抗体水平的检测结果图。
43.图8为针对同源h5n6-20053病毒株，免疫后第2周和第3周鸡平均中和抗体水平的检测结果图。
44.图9为针对异源h5n6-d829病毒株，免疫后第2周和第3周鸡平均中和抗体水平的检测结果图。
45.图10为攻毒后14天鸡的存活情况图。
具体实施方式
46.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
47.本发明实施例中涉及的h5n6亚型禽流感病毒流行毒株gdjm株(本发明简称h5n6-20053)已在中国专利申请(申请号为201910078143.7，名称为“一种扩增h5n6亚型禽流感病
毒全基因组的通用引物组、试剂盒及方法”)中公开。
48.本发明实施例中涉及的h5n6亚型禽流感病毒a/wildfowl/guangdong/gz882/2015(h5n6)(本发明简称h5n6-d829)已在文献(周佩娇,邢利,贾伟新,等.1株野禽源h5n6亚型禽流感病毒的分离鉴定与遗传进化分析简[j].中国兽医杂志,2017,53(5):4.)2.1病毒分离结果中公开。
[0049]
实施例1
[0050]
1.试验材料
[0051]
1.1细胞与毒株：试验所用的sf9细胞购自赛默飞世尔科技公司；所用mdck细胞购自海星生物科技有限公司。
[0052]
1.2试剂：bamh i限制性内切酶、ecor i限制性内切酶、1000ml sf-900
tm ii sfm昆虫细胞培养基、ii试剂全部购自赛默飞世尔科技公司；green taq mix、dl5000 dna marker、180kda prestained protein marker；fitc标记的羊抗鼠igg二抗proteinfindtm goat anti-mouse igg(h+l)试剂购自北京全式金生物技术有限公司；800cw goat anti-mouse igg(h+l)secondary antibody购自美国li-cor biosciences公司；抗his标签鼠单克隆抗体his-tag(4c2)monoclonal antibody购自美国bioworld bioworld technology公司；dh10bac感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司；plasmid dna mini kit i试剂盒均购自omega公司；lb肉汤、lb营养琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；montanide
tm isa 78 vg佐剂购自法国seppic公司。
[0053]
1.3试剂配制：
[0054]
①
lb液体培养基：称取25.0g lb肉汤粉于1000ml双蒸水进行高压灭菌处理。
[0055]
②
三抗lb液体培养基：避光取lb液体培养基，加入卡那霉素、庆大霉素和四环素，使得lb液体培养基中的卡那霉素的浓度为50μg/ml、庆大霉素的浓度为7μg/ml、四环素的浓度为10μg/ml，充分振荡混匀。
[0056]
③
三抗lb固体培养基(平板)：称取40.0g lb营养琼脂于1000ml双蒸水进行高压灭菌处理，冷却至60℃左右；然后避光加入卡那霉素、庆大霉素、四环素、异丙基硫代-β-d半乳糖苷(iptg)溶液(200mg/ml)和商品化5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)溶液(20mg/ml)，使得溶液中的卡那霉素的浓度为50μg/ml、庆大霉素的浓度为7μg/ml、四环素的浓度为10μg/ml、iptg的浓度为40μg/ml、x-gal的浓度为100μg/ml，将其轻轻倾注至细菌平皿中静置冷却至凝固。
[0057]
2.重组杆状病毒的获得与鉴定
[0058]
2.1.重组转递质粒pfastbacdual-ha-ferritin的获取与鉴定
[0059]
在h5n6-20053禽流感病毒ha蛋白序列的n端插入kozak序列(密码子优化后核酸序列为：gccgccacc)，c端插入6
×
his标签序列(密码子优化后核酸序列为：caccaccaccaccatcac)，并通过柔性连接肽ser-gly-gly(密码子优化后核酸序列为：agcggtggt)连接含有幽门螺杆菌铁蛋白5-167氨基酸序列n端，获得的新序列，并以草地贪夜蛾为表达宿主进行密码子优化，并将其命名为ha-ferritin序列。将获得ha-ferritin序列的两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点，并将其插入到昆虫表达系统载体pfastbacdual(启动子polyhedrin promoter之后)，获得重组质粒序列后将其命名为pfastbacdual-ha-ferritin，以获得重组转递质粒pfastbacdual-ha-ferritin。
[0060]
在h5n6-20053禽流感病毒ha蛋白序列的n端插入kozak序列(密码子优化后核酸序列为：gccgccacc)，c端插入6
×
his标签序列(密码子优化后核酸序列为：caccaccaccaccatcac)，并以草地贪夜蛾为表达宿主进行密码子优化，并将其命名为ha序列。将获得ha序列的两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点，并将其插入到昆虫表达系统载体pfastbacdual(启动子polyhedrin promoter之后)，获得重组质粒序列后将其命名为pfastbacdual-ha。
[0061]
上述两个重组质粒委托华大基因公司合成，以获得优化的含有重组序列的重组质粒。
[0062]
经密码子优化后的h5n6-20053禽流感病毒ha蛋白的核苷酸序列如seq id no:3所示，其蛋白序列如seq id no:4所示；经密码子优化后的幽门螺杆菌铁蛋白5-167的氨基酸序列如seq id no:5所示，其蛋白序列如seq id no:6所示；经密码子优化后的ha-ferritin序列如seq id no:1所示，其蛋白序列如seq id no:2所示。
[0063]
所获重组质粒该质粒pfastbacdual-ha-ferritin利用bamh i、ecor i双酶切，以ddh2o为阴性对照。其酶切结果如图1所示。
[0064]
2.2.bacmid-ha-ferritin质粒的构建与鉴定
[0065]
将2μl重组转递质粒pfastbacdual-ha-ferritin至dh10bac感受态细胞，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min加入900μl lb液体培养基，37℃、220rpm培养4h，取100μl涂布于三抗lb固体培养基，37℃培养48h，挑取白色单一菌落至1ml三抗lb液体培养基，37℃培养4h，选用green taq mix酶和m13引物(表1)对菌液进行pcr鉴定，pcr反应程序为：95℃预变性3min，95℃变性15s，62℃退火15s，72℃延伸5min，将变性、退火、延伸三个步骤作为1个循环；共循环31个循环，72℃彻底延伸5min。依照omegaplasmid dna mini kit i试剂盒说明书，进行重组杆粒提取，命名为bacmid-ha-ferritin质粒。其中，菌液pcr鉴定结果如图2所示。
[0066]
表1 m13引物序列
[0067]
名称序列m13-f5
′‑
cccagtcacgacgttgtaaaacg-3
′
m13-r5
′‑
agcggataacaatttcacacagg-3
′
[0068]
3.重组杆状病毒rbv-ha-ferritin的获得与鉴定
[0069]
3.1.重组杆状病毒rbv-ha-ferritin的获得
[0070]
利用ii试剂进行脂质体介导转染法，将bacmid-ha-ferritin质粒转染sf9细胞，放置于27℃恒温培养箱培养约72h，当细胞出现明显病变时离心收集培养体系上清液，获得第1代重组杆状病毒rbv-ha-ferritin。实验涉及的sf9细胞购自购自赛默飞世尔科技。转染具体操作方法见ii试剂说明书。
[0071]
3.2.重组杆状病毒rbv-ha-ferritin的扩增
[0072]
采用摇瓶悬浮培养的方式对重组杆状病毒rbv-ha-ferritin扩增传代。当sf9细胞密度达到2
×
106～2.5
×
106个/ml时，以moi＝0.1～0.5的接种量向sf9细胞接种第1代重组杆状病毒，置于27℃恒温摇床悬浮培养48～72h后收取培养上清液，获得第2代重组杆状病毒rbv-ha-ferritin。
[0073]
3.3.重组杆状病毒rbv-ha-ferritin的鉴定
[0074]
当sf9细胞交汇度达到80％～90％时，加入适量的rbv-ha-ferritin重组杆状病毒，置于27℃恒温摇床培养48～72h，弃去培养基。4％多聚甲醛室温固定15min，用pbs清洗3遍；向细胞孔中加入抗his标签鼠单克隆抗体his-tag(4c2)monoclonal antibody(1:1500，v/v)，37℃孵育30min，用pbst清洗3遍；向细胞孔中加入fitc标记的羊抗鼠igg二抗proteinfindtm goat anti-mouse igg(h+l)fitc conjugate试剂(1:500，v/v)，37℃孵育30min，用pbst清洗3遍，放置于倒置荧光显微镜下观察到特异性免疫荧光，即说明重组杆状病毒rbv-ha-ferritin可感染sf9细胞，并能表达外源蛋白。其鉴定结果如图3所示。
[0075]
4.重组蛋白ha-ferritin的表达、鉴定
[0076]
4.1.重组蛋白ha-ferritin的表达
[0077]
采用摇瓶悬浮培养的方式，培养感染重组杆状病毒rbv-ha-ferritin的sf9细胞，表达重组蛋白ha-ferritin。待sf9细胞密度达到2
×
106个/ml，以moi＝1-5的接种量向sf9细胞中接种第2代重组杆状病毒，置于27℃恒温摇床培养48～72h。培养结束后离心收集细胞，用pbs重悬细胞后超声波破碎细胞，处理功率为25w，每次5s，间歇10s，共计5min。离心后的上清为目的蛋白。
[0078]
4.2.重组蛋白ha-ferritin的鉴定
[0079]
(1)进行血凝活性鉴定。使用eppendorf八道连排移液器在96孔v型反应板中加入无菌处理的pbs缓冲溶液，从第1孔添加至第13孔，每孔上液量为25μl。在第1孔添加25μl的离心后的上清蛋白，每个样品做两次重复。使用eppendorf八道连排移液器对第1孔充分吹打混匀后，从中吸取25μl混合液加至第2孔，重复上述过程至第12孔后，弃去25μl混合液。在1～13孔中加入提前稀释好的浓度为1％鸡红细胞稀释液25μl，混匀后在室温下静置反应20～30min。待反应完成后，将血凝板竖起来，在背面读数，以红细胞能完全凝集的孔作为样品的血凝效价，该孔数即为血凝滴度(血凝效价)。其中，1％的鸡红细胞悬液为实验室制备，制备方法为：取spf白羽鸡的静脉血全血以1000rpm离心10min，去掉上清液，加入适量的pbs缓冲溶液，重复上述操作至离心后上清液清澈。小心吸取1ml沉积的红细胞至100ml pbs缓冲溶液，得到的混合液即为1％的鸡红细胞悬液，结果表明，本方法制备的重组蛋白ha-ferritin具有良好的血凝活性，血凝孔数为12，效价达到12log2。
[0080]
(2)进行western blot鉴定。按照western blot常规方法鉴定重组蛋白ha-ferritin，结果表明成功表达了约100kda的目的蛋白(图4)。其中，选取抗his标签鼠单克隆抗体his-tag(4c2)作为wb试验的一抗；800cw goat anti-mouse igg(h+l)secondary antibody作为wb试验的二抗。
[0081]
(3)进行透射电镜鉴定。用透射电子显微镜观察处理的重组蛋白形态，结果表明目的蛋白形成了直径约20nm的颗粒状结构(图5)。
[0082]
5.重组蛋白ha-ferritin的免疫原性评估
[0083]
5.1.灭活抗原
[0084]
采用bpl病毒灭活方法对抗原蛋白ha-ferritin进行杆状病毒灭活，方法如下:
[0085]
用无菌pbs稀释β-丙内酯(bpl)灭活剂，将抗原溶液与稀释的bpl灭活剂混合，使bpl终浓度保持在0.1％～0.8％(v/v)，将混合液置于4℃摇床反应12～24h灭活病毒，得到灭活抗原液。灭活结束后取灭活抗原液在sf9细胞上盲传两代，以验证残留杆状病毒是否彻底灭活。
[0086]
5.2.制备疫苗
[0087]
参考seppic montanide
tm isa 78vg佐剂使用说明书，将灭活抗原液与78vg佐剂按照质量比3:7混合制备疫苗。
[0088]
5.3.实施免疫
[0089]
取4周龄spf鸡(购于广东省新兴大华农禽蛋有限公司)随机分为6组并标记，免疫分组如表2所示；其中，取血凝效价为12log2的表达的h5n6-20053禽流感病毒重组ha蛋白(ha蛋白的核苷酸序列如seq id no:3)以及血凝效价分别为12log2、10log2、8log2的重组ha-ferritin蛋白制备的疫苗(ha蛋白的核苷酸序列如seq id no:4)。商品化疫苗为广州市华南农大生物药品有限公司生产的重组禽流感病毒(h5+h7)三价灭活疫苗(h5n2 rhn5801株+rgd59株，h7n9 rhn7903株)产品。
[0090]
表2
[0091]
组别免疫抗原免疫数量免疫剂量免疫方式1ha蛋白(12log2)100.3ml/只皮下免疫2ha-ferritin蛋白(12log2)100.3ml/只皮下免疫3ha-ferritin蛋白(10log2)100.3ml/只皮下免疫4ha-ferritin蛋白(8log2)100.3ml/只皮下免疫5商品化疫苗100.3ml/只皮下免疫6pbs缓冲液70.3ml/只皮下免疫
[0092]
表中，“8log2”、“10log2”和“12log2”均为抗原稀释液的血凝效价，即稀释后的血凝孔数。
[0093]
5.4.抗体水平检测
[0094]
(1)hi抗体检测
[0095]
免疫后2、3周，分别收集各组血清进行hi试验：分别在96孔微量反应板的1～11孔加入25ul pbs缓冲液，第12孔加入50ul pbs缓冲液。吸取25ul待测血清样品加入到第1孔，依次倍比稀释至第10孔，向1～11孔加入25ul由同源或异源禽流感病毒制备的4hau抗原液，室温孵育1h。每孔均加入25ul 1％的鸡红细胞悬液，室温孵育1h后，将血凝板竖起来，在背面读数，以红细胞能完全流下来的孔作为血清的hi滴度，该孔数即为hi抗体结果。实验每个样品设置三次重复，每组鸡的hi抗体取品均数即为该组的平均hi抗体水平。其中，4hau抗原液制备方法为：取同源或异源禽流感病毒进行血凝试验。通过测定其血凝滴度，取适量的病毒抗原液于pbs缓冲液中，使获得混合液的血凝效价为2log。
[0096]
对于同源h5n6-20053病毒株和异源h5n6-d829病毒株免疫后第2周和第3周鸡hi抗体水平的检测结果如图6和图7所示，其平均hi抗体如表3所示：
[0097]
表3
[0098][0099]
结果显示：对于同源h5n6-20053毒株，免疫后3周，疫苗组平均hi抗体滴度均在7log2以上；对于异源h5n6-d829毒株，免疫后3周，疫苗组平均hi抗体滴度均在4log2以上。因此，ha-ferritin纳米颗粒蛋白可以快速地刺激机体产生足够的hi抗体水平。
[0100]
(2)中和抗体检测
[0101]
对免疫2、3周的血清进行中和抗体试验：将分离的第2周血清稀释至1：20，将第3周血清稀释至1：40。分别在96孔细胞培养板的，加入100μl血清稀释液于第1～11孔，加入200ul血清稀释液于第12孔。加入100ul的稀释的血清样品于到第1孔，依次倍比稀释至第10孔，加入100ul 100tcid
50
病毒液(同源h5n6-20053毒株、异源h5n6-d829毒株)向于1～11孔，37℃细胞培养箱孵育1h。将其转至mdck细胞交汇度为90％的96孔细胞培养板，培养3d。将培养液转至在96孔微量反应板中，每孔50ul，加入50ul 1％的鸡红细胞悬液，室温孵育30min，将血凝板竖起来，在背面读数，以获取红细胞能完全流下来的孔数，该孔数乘以血清稀释倍数即为中和抗体结果。实验设置三次重复。
[0102]
对于同源h5n6-20053毒株和异源h5n6-d829毒株，免疫后第2周和第3周鸡平均中和抗体水平的检测结果如图8和图9所示，其平均中和抗体如表4所示：
[0103]
表4
[0104][0105]
结果显示:对于同源h5n6-20053毒株和异源h5n6-d829毒株，第2周和第3周，
12log2的ha-ferritin纳米颗粒疫苗组的中和抗体水平优于12log2的ha蛋白组；10log2的ha-ferritin纳米颗粒疫苗组的中和抗体水平优于商品化疫苗组。以上结果说明，免疫ha-ferritin纳米颗粒疫苗，spf鸡能够产生更高水平的中和抗体。
[0106]
6.攻毒保护实验研究
[0107]
6.1.疫苗攻毒保护结果
[0108]
免疫后第3周，使用h5n6-20053禽流感病毒，通过滴鼻的方式，以106eid
50
进行攻毒，200μl/只。攻毒后连续14天对鸡进行观察(图10)，具体包括鸡每天的食欲、饮欲，精神状况，存活情况等。在第3、5、7天采集鸡的口咽拭子和肛门拭子进行病毒分离，统计疫苗保护情况。
[0109]
结果如表5所示：pbs对照组在攻毒后2天内全部死亡。ha-12log2+78vg组、ha-ferritin-12log2+78vg组、ha-ferritin-10log2+78vg组、ha-ferritin-8log2+78vg组、商品化疫苗组的鸡存活率为100％，未检测到排毒，食欲饮欲及精神体况良好，实验结束后体重增加明显。而ha-ferritin-8log2+78vg组在攻毒后第3、5天检测到1只鸡排毒。结果表明，针对h5n6禽流感病毒的攻击，相比高剂量的野生ha蛋白疫苗和商品化灭活疫苗，以更低剂量的ha-ferritin蛋白制备的疫苗，能够达到同等甚至更好的保护效果。
[0110]
表5
[0111][0112][0113]
6.2.攻毒后对组织器官病毒检测
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当pbs对照组的鸡全部死亡后，从各实验组中随机选三只鸡，解剖采集其心、肝、脾、肺、气管共五个器官，将其充分研磨后，进行病毒分离检测。结果如表6所示：
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表6
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结果显示:各疫苗组的脏器均未检测到病毒，而pbs对照组的各脏器均带毒。表明疫苗有良好的保护效果，能够抵抗h5n6禽流感病毒的攻击。
[0118]
上述所有实验结果表明:(1)本发明方法能够形成基于h5n6禽流感病毒的ha蛋白与幽门螺杆菌ferritin融合的纳米颗粒ha-ferritin蛋白；(2)本发明中制备的自组装形成纳米颗粒结构的ha-ferritin蛋白具有免疫原性，且免疫原性得到进一步提升，表现为单次免疫后，针对不同h5n6禽流感病毒，ha-ferritin纳米颗粒蛋白可诱导机体产生足够水平的hi抗体，且可诱导机体更迅速地产生更高水平的中和抗体水平；(3)以血凝效价为10log2的ha-ferritin纳米颗粒蛋白配合seppic montanide
tm isa 78vg佐剂制备疫苗免疫spf鸡后，在应对h5n6禽流感病毒的攻击时可提供完全的保护，具有良好的保护效果。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒，其特征在于：是通过ha-ferritin蛋白自组装形成纳米颗粒；其中，ha-ferritin蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。2.根据权利要求1所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒，其特征在于：编码所述ha-ferritin蛋白的基因序列如seq id no:1所示。3.根据权利要求2所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒，其特征在于，所述的ha-ferritin蛋白通过如下方法获得：将编码所述ha-ferritin蛋白的基因序列通过柔性连接肽ser-gly-gly连接到幽门螺杆菌铁蛋白ferritin序列的n端。4.权利要求1～3任一项所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将编码ha-ferritin蛋白的基因序列连接到昆虫表达系统载体上，得到重组转移质粒；(2)将重组转移质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒；(3)将重组杆状病毒质粒转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒；(4)将重组杆状病毒继续感染昆虫细胞，并表达外源ha-ferritin蛋白，得到基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的编码ha-ferritin蛋白的基因序列如seq id no:1所示；步骤(1)中所述的昆虫表达系统载体为昆虫表达系统载体pfastbacdual；步骤(2)中所述的大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌dh10bac感受态细胞；步骤(3)和(4)中所述的昆虫细胞为sf9昆虫细胞。6.权利要求1～3任一项所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒在制备禽流感病毒亚单位疫苗中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的禽流感病毒为h5n6禽流感病毒。8.一种禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：含有权利要求1～3任一项所述的基于h5n6禽流感病毒ha蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒。9.根据权利要求8所述的禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：所述的禽流感亚单位疫苗还含有佐剂。10.根据权利要求8所述的禽流感病毒亚单位疫苗，其特征在于：所述的佐剂为seppic montanide
tm
isa 78vg。

技术总结
本发明公开了一种基于H5N6禽流感病毒HA蛋白与铁蛋白融合的纳米颗粒及其制备方法与应用。该纳米颗粒是通过HA-Ferritin蛋白自组装形成纳米颗粒；其中，HA-Ferritin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的自组装纳米颗粒结构的HA-Ferritin蛋白与免疫佐剂配合免疫SPF鸡后，针对同源和异源H5N6禽流感病毒，均能够产生足够的HI抗体，相比较野生型HA蛋白，可刺激机体更快地产生更高水平的中和抗体，具有良好的免疫原性，可用于开发禽流感亚单位疫苗。亚单位疫苗。亚单位疫苗。


技术研发人员：樊惠英 高银泽 陈陶然 廖明 叶贺佳 仇微红 朱秀同
受保护的技术使用者：广州市华南农大生物药品有限公司
技术研发日：2023.04.27
技术公布日：2023/9/20