一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法及应用与流程

1.本技术涉及抗菌药物检测的技术领域，尤其涉及一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法及应用。


背景技术：

2.兽用抗菌药物/抗生素作为养殖环节的重要投入品，广泛应用于畜禽疾病预防和治疗中，为保障动物源性食品供给发挥了不可代替的作用。其中磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类和林可胺类兽用抗菌药物是畜牧养殖业常用抗菌药，多用于动物疫病防控和治疗。抗菌药物经口服或注射进入动物体内后，约30％～90％的药物以原型药或代谢物的形式，随畜禽粪便排出体外。畜禽粪便是制作粪肥、堆肥或有机肥的重要原料，制成的商品肥料多用于种植业，是改善土壤地力，提高农作物品质的优良肥料。
3.常用的粪肥(有机肥)制作方法，不能完全降解畜禽粪便中的抗菌药物残留。此外，部分畜禽粪便经晾晒后还田，并存在畜禽粪便不经处理便直接还田的情况。这些含有抗菌药物残留的畜禽粪便或粪肥(有机肥)还田同时，导致抗菌药物残留进入农田环境。在环境中，低浓度的抗菌药物能够改变土壤菌群结构、促进菌群积累耐药性、增加土壤中耐药基因丰度，甚至可能提升致病菌的耐药性，引发环境问题，并威胁公共卫生安全。因此，制定畜禽粪便及粪肥(有机肥)中抗菌药物残留检测方法对于保障环境安全和公共卫生安全具有重要现实意义。
4.在生产中，畜禽粪便单独或与花生壳、玉米秸秆等种植业产物混合后，经堆肥或发酵，可制成粪肥(有机肥)。畜禽粪便和粪肥(有机肥)虽然组份不同，对检测造成干扰的杂质存在差异，但两者成分复杂，皆可对检测产生较强的干扰，因此对样品的前处理净化过程提出了较高的要求。quechers(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe)法是一种简便、易行、低成本的样品前处理方法，可在30～40min实现10～20个样品的快速处理，处理1个样品试剂耗材成本不足10元，特别适合大量样品的快速前处理。目前，该方法在抗菌药物残留检测方法得到广泛的应用，多种国外品牌产品在中国大量销售使用，但售价较高。同时，该方法可导致较多难以气化的无机盐进入检测仪器，影响仪器的使用寿命。
5.畜禽粪便及粪肥(有机肥)中抗菌药物残留检测方法较少，且大多数仅适用于畜禽粪便或粪肥(有机肥)的抗菌药物残留的检测，文献和专利中未说明能同时适用于上述两种基质。目前公开的方法仅能使用于畜禽粪便或粪肥(有机肥)中抗菌药物残留检测，检测方法不能同时兼顾畜禽粪便和粪肥(有机肥)中抗菌药物残留检测。如汪建妹等建立了测定有机肥中46种抗生素的quechers结合柱净化超高效液相色谱-串联质谱法(汪建妹,刘艳平,陈静,等.quechers结合柱净化的超高效液相色谱-串联质谱法测定有机肥中46种抗生素[j].分析测试学报,2017,36(02):218-223.)，该检测方法及评价方法使用的材料仅为有机肥。曾桥等建立了检测畜禽粪便中多种抗生素残留的quechers结合超高效液相色谱-串联质谱法(曾桥,吕生华,李祥等.quechers结合超高效液相色谱-串联质谱法同时测定畜禽粪
便中多种抗生素残留[j].陕西科技大学学报,2020,38(04):52-57.)，该检测方法及评价方法使用的材料为畜禽粪便。
[0006]
在实际检测中发现，部分检测方法净化效果较差，导致检测结果准确性不高。同时，现有方法前处理步骤多需要2次提取，并使用固相萃取柱或quechers试剂包净化，消耗时间长，实验耗材昂贵，增加了检测成本，影响了检测效率。


技术实现要素：

[0007]
针对现有技术的不足，本发明的首要目的是提供了一种快速筛查畜禽粪便和有机肥中多种抗菌药物残留的方法，采用quechers技术结合超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱(uplc-ms/ms)快速筛查与确证粪便和粪肥(有机肥)中抗菌药物残留，满足相关评估和监管的要求。
[0008]
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0009]
一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，包括如下步骤：
[0010]
s1、将各种抗菌药物样品配制成混合标准工作溶液；
[0011]
s2、设置超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱仪的参数，对步骤s1所述混合标准工作溶液进行检测生成各抗菌药物标准曲线；
[0012]
s3、对待测畜禽粪便或粪肥样品进行冻干、研磨过筛处理；
[0013]
s4、加入edta-mcllvaine缓冲液与乙腈/乙酸混合提取液进行超声处理，涡动后离心取上清液；
[0014]
s5、在步骤s4所述上清液中依次加入净化试剂a和b，涡动离心取上清液；所述净化试剂中a含有氯化钠、无水硫酸钠、柠檬酸二钠、柠檬酸钠，净化试剂b中含有无水硫酸镁、n-丙基乙二胺(psa)、十八烷基二氧化硅(c18)、石墨化炭黑(gcb)、强阴离子交换材料(sax)；
[0015]
s6、将步骤s5所述上清液于氮气下吹干，然后加入甲醇和二甲基亚砜混合有机相复溶，离心取上清液用0.1％甲酸水溶液定容，过滤膜，备用；
[0016]
s7、按照步骤s2设定的超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱仪参数，通过步骤s2生成的标准曲线，对步骤s6处理后的待测畜禽粪便或粪肥样品进行测定分析。
[0017]
优选地，步骤s1所述抗菌药物为磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、林可胺类药物。
[0018]
更优选地，所述磺胺类药物为磺胺二甲基异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺曲噻唑、磺胺氯吡嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺苯、甲氧吡啶、苯甲酰磺胺以及磺胺酰二甲嘧啶中的一种或多种；
[0019]
所述大环内酯类药物为奥美普林、替米考星、克林霉素、泰乐菌素、太地罗欣、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、麦迪霉素以及加米霉素中的一种或多种；
[0020]
所述喹诺酮类药物为氟罗沙星、麻保沙星、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、奥比沙星、依洛沙星、沙拉沙星、二氟沙星、斯帕沙星、吉米沙星、莫西沙星、托氟沙星、曲伐沙星、西他沙星、那氟沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、恩诺沙星以及吡咯酸中的一种或多种；
[0021]
所述林可胺类药物为林可霉素。
[0022]
优选地，步骤s2所述超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱仪的参数设置具体如下：
[0023]
液相色谱条件：色谱柱为beh c18(100
×
2.1mm，1.7μm)，柱温35℃，流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水溶液，流速为0.3ml/min，进样体积为5.0μl；梯度洗脱条件为0～0.5min，a 10％，b 90％；0.5～6min，a线性变化至35％，b线性变化至65％；6～8min，a线性变化至45％，b线性变化至55％；8～8.5min，保持流动项比例；8.5～9min，a线性变化至98％，b线性变化至2％；9～10min，保持流动项比例；10～10.5min，a线性变化至10％，b线性变化至90％；
[0024]
质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式(esi+)，检测方式为多反应检测(mrm)，载气温度为250℃，载气气流为7l/min，鞘气温度为325℃，鞘气流速为11l/min。
[0025]
优选地，步骤s4所述乙腈与乙酸加入量(v：v)比为9：1。
[0026]
优选地，步骤s5所述净化试剂a中含有1g氯化钠、4g无水硫酸钠、0.5g柠檬酸二钠、1g柠檬酸钠，净化试剂b中含有含300mg无水硫酸镁、50mgn-丙基乙二胺、100mg十八烷基二氧化硅、20mg石墨化炭黑、50mg强阴离子交换材料。
[0027]
优选地，步骤s6所述甲醇和二甲基亚砜的加入量(v：v)比为7：3。
[0028]
优选地，以目标抗菌药物的母离子和子离子荷质比、碰撞能量、保留时间分子量等信息进行定性和定量分析。
[0029]
本发明还进行了方法确证，取不含待测药物的畜禽粪便样品，和不含待检药物的畜禽粪肥(有机肥)进行方法学验证，按上述步骤进行样品处理和上机检测。添加不同浓度的混合标准工作溶液，配制成药物浓度分别为1.0、1.5、2.0、5.0、20、50和100ng/ml的系列基质匹配标准工作液，以分子离子峰面积y对浓度x(ng/ml)作标准曲线。用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，获得每种抗菌药物的信噪比等于10(s/n＝10)的浓度，确定其为该化合物的定量限(loq)。在50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg的添加水平下，在空白基质中添加57种常抗菌药，进行筛查确证，每个浓度水平取5份样品进行试验，计算平均回收率。
[0030]
本发明的还提供了上述方法在同时检测畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留中的应用。
[0031]
本发明检测从畜禽养殖场采集的畜禽粪污和粪肥样品，验证了上述方法的有效性和可行性。
[0032]
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0033]
(1)采用quechers技术净化操作简单、耗时短、成本低，便于推广，本发明筛选了净化剂组份，降低了检测成本，兼顾吸附畜禽粪便与粪肥(有机肥)中的色素、腐植酸、脂质等杂质，有效降低了基质对检测的干扰。
[0034]
(2)本发明改进了quechers方法，通过使用纯有机相(二甲基亚砜和甲醇混合液体)溶解含待检测抗菌药物残渣的样品，避免了难以气化的无机盐溶解入制备的试样，避免难气化无机盐随试样进入仪器并对仪器造成损害，同时部分难溶于纯有机相的杂质在该过程中析出，通过离心即可去除杂质，提升净化和检测效果。
[0035]
(3)本发明建立了quechers技术结合uplc-ms/ms筛查畜禽粪便和粪肥(有机肥)中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、林可胺类等4类57种抗菌药物残留的方法，该方法简便快速、灵敏度高、重复性好、准确度高、回收率高，适用范围、检测参数、检测成本、检测耗时或
净化效果优于《有机肥料中19种兽药残留量的测定液相色谱串联质谱法》(gbt40462-2021)国家标准方法和文献报道的方法，非常适用于检测畜禽粪便和粪肥(有机肥)中多种抗菌药物残留。
附图说明
[0036]
图1为本发明检测方法建立流程示意图；
[0037]
图2为本发明的实施例1和对比例1的2种不同提取液净化效果对比图；
[0038]
图3为本发明总离子流图；
[0039]
图4为本发明实施例2处理的鸡粪便中检出林可霉素色谱图；
[0040]
图5为本发明实施例2处理的猪粪便中检出甲氧吡啶色谱图；
[0041]
图6为本发明实施例2处理的有机肥中检出恩诺沙星色谱图。
具体实施方式
[0042]
以下结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
[0043]
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行制备。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0044]
实施例1
[0045]
1、仪器及设备
[0046]
aglient 6470高效液相色谱-串联质谱仪配备分析软件(美国安捷伦公司)，5804r台式高速冷冻离心机(德国艾本德公司)，milli-q超纯水仪(美国密理博公司)，cp225d电子天平(德国赛多利斯公司)，umv-2多功能振荡器(日照亿岚公司)，kq-500de超声波仪(昆山市超声波仪器公司)。
[0047]
2、试剂、药品
[0048]
磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、林可霉素等4类57种药物标准品，包括磺胺二甲基异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧吡啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺曲噻唑、磺胺氯吡嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺苯、磺胺酰二甲嘧啶、奥美普林、甲氧吡啶、苯甲酰磺胺、替米考星、克林霉素、泰乐菌素、太地罗欣、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、麦迪霉素、加米霉素、氟罗沙星、麻保沙星、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、奥比沙星、依洛沙星、沙拉沙星、二氟沙星、斯帕沙星、吉米沙星、莫西沙星、托氟沙星、曲伐沙星、西他沙星、那氟沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、恩诺沙星、吡咯酸、林可霉素，均购自德国dr.ehrenstorfer公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(na2edta)等试剂均购自国药集团化学试剂公司；0.22μm滤膜等耗材购自天津市津腾科技公司。
[0049]
3、样品前处理
[0050]
畜禽粪便和粪肥(有机肥)经冻干处理，样品经研磨，过1.7mm试样筛，制成试验样品。准确称取样品1.00g于50ml离心管中，加入2.5ml edta-mcllvaine(ph＝4.0)缓冲液，振
荡混合均匀；加入10ml乙腈/乙酸(v：v＝9：1)，混合均匀后，超声处理15min，震荡15min，8000r/min离心5min，将上清液液转移至另一50ml离心管中。在提取液中加入净化试剂包a(含1g氯化钠、4g无水硫酸钠、0.5g柠檬酸二钠、1g柠檬酸钠)，快速振摇并涡旋2分钟，8000r/min离心5min，取上清液7.0ml至15ml离心管中。在含有上清液7.0ml的15ml离心管中加入净化试剂包b(含300mg硫酸镁、20mg gcb、50mg psa、100mg c18、50mg sax)，快速振摇并涡旋2分钟，8000r/min离心5min，取上清液5.0ml至玻璃管试管中，在45℃水浴氮吹下吹至干燥。样品复溶与过滤，在玻璃试管中加入1.0ml有机相复溶液(甲醇/二甲基亚砜＝7/3，v/v)，涡旋40s，将复溶液转移至1.5ml离心管中，10000r/min离心5min，取上清液0.2ml与0.8ml的0.1％甲酸水溶液混合，经0.22μm滤膜过滤后装瓶上机检测。
[0051]
本发明比对了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、edta-mcllvaine缓冲液等作为提取液时提取效果，发现使用乙腈作为提取液时，提取到的杂质较少，药物回收率较高；使用甲醇作为提取液时，有助于提升磺胺类药物的回收率，但用量较大时会提取到大量杂质并难以净化；使用edta-mcllvaine缓冲液有助于喹诺酮类药物的提取。因此本研究使用edta-mcllvaine缓冲液与乙腈/乙酸混合作为提取液，并对比了不同比例混合的提取效果。同时实验中发现，超声处理有助于大环内酯类和喹诺酮类药物的提取，本实验对提取体系超声处理时间为15min。
[0052]
畜禽粪便和粪肥(有机肥)中干扰检测的杂质较多且杂质性质存在差异，为同时去除畜禽粪便和粪肥(有机肥)中干扰检测的杂质，本发明对quechers净化试剂包的组份进行了优化。sax去除腐植酸的效果较好且该杂质在粪肥(有机肥)中较多的存在，因此在quechers净化试剂包中加入了sax；gcb出去脂类的效果较好，猪粪、鸡粪中含有较多未消化的脂类物质，因此在quechers净化试剂包中加入了gcb。
[0053]
本发明对比了不同净化剂的净化作用和最佳用量，综合文献报道并在实验中发现，c18、psa对大多数杂质净化效果较好，但过量使用会吸附亲脂性较强药物；gcb去除色素、脂类的效果较好，但过量使用会吸附药物；sax去除植物源性杂质效果较好；硫酸镁能进一步去除净化体系的水。通过优化0.02g～0.3g范围内不同硫酸镁、c18、psa、gcb、sax的组合，在保证净化效果并避免净化剂吸附药物的前提下，确定含300mg硫酸镁、20mg gcb、50mg psa、100mg c18、50mg sax为最优组合。
[0054]
本发明使用有机相复溶氮吹吹干后的残渣，避免使用含水的复溶液导致难气化的无机盐被溶解。本发明使用了甲醇、乙醇、乙腈、二甲基亚砜等有机溶剂的不同组合，发现甲醇能溶解除喹诺酮类药物外其他抗菌药物；二甲基亚砜能有效溶解所有所用抗菌药物，但影响部分大环内酯类药物的检测。经实验优化二甲基亚砜和甲醇的比例，最终确定复溶液为甲醇：二甲基亚砜＝7：3(v/v)。
[0055]
实验中发现，使用纯有机相的复溶液溶解残渣，部分杂质析出，通过离心即可去除，减少了进入上机样品中的杂质。
[0056]
4、仪器检测
[0057]
色谱条件：色谱柱为beh c18(100
×
2.1mm，1.7μm)，柱温35℃，流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水溶液，流速为0.3ml/min，进样体积为5.0μl。梯度洗脱条件为，梯度洗脱条件为，0～0.5min，a 10％，b 90％；0.5～6min，a线性变化至35％，b线性变化至65％；6～8min，a线性变化至45％，b线性变化至55％；8～8.5min，保持流动项比例；8.5～9min，a线
性变化至98％，b线性变化至2％；9～10min，保持流动项比例；10～10.5min，a线性变化至10％，b线性变化至90％。
[0058]
质谱条件：质谱仪agilent 6470，配备数据采集分析软件；离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式(esi+)，检测方式为多反应检测(mrm)；载气温度为250℃，载气气流为7l/min，鞘气温度为325℃，鞘气流速为11l/min。
[0059]
5、方法学确证
[0060]
取不含待测药物的畜禽粪便样品，和不含待检药物的畜禽粪肥(有机肥)进行方法学验证，按上述步骤进行样品处理和上机检测。添加不同浓度的混合标准工作溶液，配制成药物浓度分别为1.0、1.5、2.0、5.0、20、50和100ng/ml的系列基质匹配标准工作液，以分子离子峰面积y对浓度x(ng/ml)作标准曲线。用基质提取液稀释标准曲线的最低浓度，获得每种抗菌药物的信噪比等于10(s/n＝10)的浓度，确定其为该化合物的定量限(loq)。在50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg的添加水平下，在空白基质中添加57种抗菌药，进行筛查确证，每个浓度水平取5份样品进行试验，计算平均回收率。
[0061]
6、数据分析
[0062]
采用数据分析软件mass hunter qualitative analysis b06.0.633.0。
[0063]
结果分析
[0064]
本发明涉及的磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、林可胺类4类57种药物的质谱参数见表1。以目标化合物的母离子和子离子荷质比、碰撞能量、保留时间分子量等信息进行定性和定量分析。
[0065]
表1
[0066]
[0067]
[0068]
[0069][0070]
经方法学确证，各抗菌药物相关系数大于0.99，loq为10～50μg/kg，回收率为42.5％～110.5％，57种抗菌药物加标回收率、检测限详见表2。结果表明，本发明建立的方法灵敏度、准确性和重复性良好，能够同时满足畜禽粪便和粪肥(有机肥)中多种抗菌药物残留的筛查与检测。
[0071]
表2
[0072]
[0073]
[0074][0075]
综上所述，本技术实施例1提供的一种畜禽粪便和粪肥(有机肥)中多种抗菌药物残留检测的方法，在保证目标药物回收率的前提下，有效的降低基质干扰，大大提高了检测的灵敏度，延长了超高效液相色谱-串联质谱仪的使用寿命，满足实际检测的时效性要求。
[0076]
实施例2
[0077]
使用实施例1中提供的方法测定了检测从畜禽养殖场采集的畜禽粪污和粪肥样品10份，包括4份畜禽粪便(鸡粪便和猪粪便)样品和6份粪肥(有机肥)样品。检测结果显示，畜禽粪便和粪肥样品中普遍有抗菌药物残留，检测出的药物包括恩诺沙星、林可霉素、甲氧吡啶等。
[0078]
对比例1
[0079]
使用国标方法《有机肥料中19种兽药残留量的测定液相色谱串联质谱法》(gb/t40462-2021)测定粪肥(有机肥)中磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲异恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶等7种磺胺类药物的提取效果，和恩诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星等4中喹诺酮类药物提取效果。
[0080]
1实验部分
[0081]
1.1仪器及设备：同实施例1部分。
[0082]
1.2试剂、药品及材料
[0083]
磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶5种磺胺类药物残留，和环丙沙星、氧氟沙星2种喹诺酮类药物，药物标准品购自德国dr.ehrenstorfer公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(na2edta)等试剂均购自国药集团化学试剂公司；
0.22μm滤膜等耗材购自天津市津腾科技公司；waters osis prime hlb(60mg，3ml)固相萃取柱购自waters公司。
[0084]
1.3样品提取与净化
[0085]
畜禽粪肥(有机肥)样品经研磨，过1.0mm试样筛，制成试验样品。准确称取5份不含抗菌药物的有机肥样品于50ml离心管中，每份2.00g，并添加适量标准品，使有机肥成为添加药物浓度为100μg/kg的样品，至于冷藏室过夜。加入5ml edta-mcllvaine(ph＝4.0)缓冲液，振荡混合均匀；加入20ml乙腈/乙酸(v：v＝9：1)，混合均匀后，震荡20min，4000r/min离心10min。取2ml上清液过prime hlb固相萃取柱，准确取1ml流出液，再经过0.22μm滤膜过滤后装瓶上机检测。
[0086]
1.4色谱和质谱条件：同实施例1部分。
[0087]
2数据分析
[0088]
2.1数据分析软件：同实施例1部分。
[0089]
2.2数据分析
[0090]
使用外标基质匹配标准溶液法定量，配置浓度为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml的系列标准曲线工作溶液，进行测定，以定量离子的峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制基质标准曲线，并用于样品中目标药物浓度的测定。
[0091]
3结果与分析
[0092]
实施例1经净化剂处理后液体颜色相对较浅，澄清度较高，将两种经不同净化处理的液体过滤膜后，取3ml氮吹吹干，对比结果如图2所示，a为对比例1经净化处理后液体氮吹吹干残渣，b为施例1经净化剂处理后液体氮吹吹干残渣，a中有较多黑色油状杂质且明显多于b。
[0093]
上机检测发现，对比例1处理的样品中杂质对部分药物的检测有干扰，影响了部分药物的回收率，对比例1和实施例1部分药物检测结果(药物添加浓度100μg/kg)见表3。
[0094]
表3
[0095][0096]
对比例2
[0097]
使用文献报道的方法《猪、鸡粪便中四类抗菌药物残留检测方法的建立及恩诺沙星在猪体内残留消除的研究》测定鸡粪中磺胺吡啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶5种磺胺类药物提取效果，和环丙沙星、氧氟沙星等2种喹诺酮类药物提取效
果。
[0098]
1实验部分
[0099]
1.1仪器及设备：同实施例1部分。
[0100]
1.2试剂、药品及材料
[0101]
磺胺吡啶、磺胺哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲嘧啶等7种磺胺类药物残留，和诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星等4中喹诺酮类药物，药物标准品购自德国dr.ehrenstorfer公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(na2edta)等试剂均购自国药集团化学试剂公司；0.22μm滤膜等耗材购自天津市津腾科技公司；waters osis hlb(60mg，3ml)固相萃取柱购自waters公司。
[0102]
1.3样品提取与净化
[0103]
将采集的鸡粪冻干机进行处理后，研磨过筛制成待测样品。准确称取不含抗菌药物的鸡粪样品1.0g样品5份，置于50ml的离心管中，并添加适量标准品，使鸡粪成为添加药物浓度为100μg/kg的样品，至于冷藏室过夜。加入10ml edta-mcllvaine缓冲液：乙腈＝1:1(v/v)的提取液涡旋30s，然后使用多管涡旋混匀仪于2500r/min涡动10min，8000r/min离心10min，将上清移至新离心管。重复提取1次，合并2次上清。将两次上清液混匀后重复离心，取5ml上清液氮吹至2.5ml，过0.45μm滤膜。将预先用3ml甲醇、水活化的hlb柱放置于固相萃取装置上，将氮吹过滤后的上样液通过hlb柱，在负压下保持流速1ml/min滴落，依次用5ml水、5ml 5％甲醇淋洗，真空泵抽干后，使用3ml甲醇进行洗脱，45℃水洛条件下氮吹至近干，用1ml的0.1％甲酸水：乙腈(85/15，v/v)复溶后过0.22μm滤膜，上机检测。
[0104]
1.4色谱条件和质谱条件：同实施例1部分。
[0105]
2数据分析
[0106]
2.1数据分析软件：同实施例1部分。
[0107]
2.2数据分析
[0108]
使用外标基质匹配标准溶液法定量，配置浓度为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml的系列标准曲线工作溶液，进行测定，以定量离子的峰面积为纵坐标，标准溶液质量浓度为横坐标，绘制基质标准曲线，并用于样品中目标药物浓度的测定。
[0109]
3结果与分析
[0110]
上机检测发现，对比例2处理的样品中杂质对部分药物的检测有干扰，影响了部分药物的回收率，对比例2和实施例1部分药物检测回收率结果(药物添加浓度100μg/kg)见表4。
[0111]
表4
[0112][0113]
上述数据表明，本发明的方法可以同时用于畜禽粪便和粪肥(有机肥)中多种抗菌药物的检测，成本低，操作简便，药物回收率高，准确度高，重复性好，适合大规模的应用。
[0114]
本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、将各种抗菌药物样品配制成混合标准工作溶液；s2、设置超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱仪的参数，对步骤s1所述混合标准工作溶液进行检测生成各抗菌药物标准曲线；s3、对待测畜禽粪便或粪肥样品进行冻干、研磨过筛处理；s4、在步骤s3处理后的待测样品中加入edta-mcllvaine缓冲液与乙腈/乙酸混合提取液进行超声处理，涡动后离心取上清液；s5、在步骤s4所述上清液中加入净化试剂a后涡动离心取上清液，再加入净化试剂b，涡动离心取上清液；所述净化试剂中a含有氯化钠、无水硫酸钠、柠檬酸二钠、柠檬酸钠，净化试剂b中含有无水硫酸镁、n-丙基乙二胺、十八烷基二氧化硅、石墨化炭黑、强阴离子交换材料；s6、将步骤s5所得上清液于氮气下吹干，然后加入甲醇和二甲基亚砜混合有机相复溶，离心取上清液用0.1％甲酸水溶液定容，过滤膜，备用；s7、按照步骤s2设定的超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱仪参数，通过步骤s2生成的标准曲线，对步骤s6处理后的待测畜禽粪便或粪肥样品进行测定分析。2.根据权利要求1所述的一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，步骤s1所述抗菌药物为磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、林可胺类药物。3.根据权利要求2所述的一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，所述磺胺类药物为磺胺二甲基异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲噁唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧吡嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺曲噻唑、磺胺氯吡嗪、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺苯吡唑、磺胺苯、甲氧吡啶、苯甲酰磺胺以及磺胺酰二甲嘧啶中的一种或多种；所述大环内酯类药物为奥美普林、替米考星、克林霉素、泰乐菌素、太地罗欣、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、麦迪霉素以及加米霉素中的一种或多种；所述喹诺酮类药物为氟罗沙星、麻保沙星、氧氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、达氟沙星、奥比沙星、依洛沙星、沙拉沙星、二氟沙星、斯帕沙星、吉米沙星、莫西沙星、托氟沙星、曲伐沙星、西他沙星、那氟沙星、萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、恩诺沙星以及吡咯酸中的一种或多种；所述林可胺类药物为林可霉素。4.根据权利要求1所述的一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，步骤s2所述超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱仪的参数设置具体如下：液相色谱条件：色谱柱为behc18(100
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2.1mm，1.7μm)，柱温35℃，流动相a为乙腈，流动相b为0.1％甲酸水溶液，流速为0.3ml/min，进样体积为5.0μl；梯度洗脱条件为0～0.5min，a10％，b90％；0.5～6min，a线性变化至35％，b线性变化至65％；6～8min，a线性变化至45％，b线性变化至55％；8～8.5min，保持流动项比例；8.5～9min，a线性变化至98％，b线性变化至2％；9～10min，保持流动项比例；10～10.5min，a线性变化至10％，b线性变化至90％；
质谱条件：离子源为电喷雾离子源，正离子扫描模式esi+，检测方式为多反应检测mrm，载气温度为250℃，载气气流为7l/min，鞘气温度为325℃，鞘气流速为11l/min。5.根据权利要求1所述的一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，步骤s4所述乙腈与乙酸加入体积比为9：1。6.根据权利要求1所述的一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，步骤s5所述净化试剂a中含有1g氯化钠、4g无水硫酸钠、0.5g柠檬酸二钠、1g柠檬酸钠，净化试剂b中含有含300mg无水硫酸镁、50mgn-丙基乙二胺、100mg十八烷基二氧化硅、20mg石墨化炭黑、50mg强阴离子交换材料。7.根据权利要求1所述的一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法，其特征在于，步骤s6所述甲醇和二甲基亚砜的加入体积比为7：3。8.权利要求1-7任一项所述方法在同时检测畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留中的应用。

技术总结
本申请涉及抗菌药物检测的技术领域，尤其涉及一种快速筛查畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留的方法及应用。本发明通过采用改进的QuEChERS技术结合超高效液相色谱串联-三重四级杆质谱对畜禽粪便和粪肥中多种抗菌药物残留进行快速筛查与确证，不仅优化了净化剂组份，兼顾吸附畜禽粪便与粪肥中的色素、腐植酸、脂质等杂质，有效降低了基质对检测的干扰，并使用纯有机相二甲基亚砜和甲醇混合液体溶解含待检测抗菌药物残渣的样品，提升净化和检测效果。可用于快速筛查畜禽粪便和粪肥中磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、林可胺类等4类57种抗菌药物的残留，具有简便快速、回收率高等优点。点。点。


技术研发人员：秦立得 宋翠平 张柏铭 孙晓亮 刘迎春 曹旭敏 王晓茵 王淑婷 王述柏 李木子 赵思俊 方汉卿 宋彦莹 刘坤
受保护的技术使用者：中国动物卫生与流行病学中心
技术研发日：2023.05.06
技术公布日：2023/9/20