测定核酸样品中DNA含量的方法与流程

测定核酸样品中dna含量的方法
技术领域
1.本发明属于生化分析领域，涉及测定核酸样品中脱氧核糖核酸(dna)含量的方法，尤其涉及适于各类核酸样品中脱氧核糖核酸含量的液相色谱检测方法。


背景技术：

2.dna定量常受到样品组织、种类、检材量和检材保存条件等因素影响，同时与提取方法有关。常用的dna定量方法有凝胶电泳法，用已知含量的dna为参照物，属于半定量的方法；紫外分光光度计测定方法，依据核酸在260nm存在吸收峰的原理，在260nm检测时，依据1od值相当于50μg/ml双链dna、40μg/ml单链dna或rna，估算样品dna含量。上述方法缺乏dna特异性。


技术实现要素：

3.本发明鉴于以上技术问题研发而成，目的在于提供一种在无需进一步纯化的情况下绝对定量的dna浓度的测定方法。
4.本发明提供的测定核酸样品中脱氧核糖核酸含量的方法包括：步骤：(1)将待测核酸样品降解至核苷；(2)根据测定降解样品中的核苷来计算待测核酸样品中dna的含量。
5.其中步骤(2)中，根据降解样品在液相图谱中构成dna的各脱氧核糖核苷的峰面积以及核苷峰面积与核苷浓度的关系计算待测核酸样品中dna的含量。其中步骤(2)中，核苷峰面积与核苷浓度的关系由任意核苷对照样品确定。优选地步骤(2)中，核苷峰面积与核苷浓度的关系为任意核苷的多针对照样品的平均核苷峰面积与其浓度的比。
6.其中步骤(2)中，根据下式计算dna含量：
[0007][0008]
其中：cs为核苷对照样品中对照核苷的浓度，
[0009]as
为核苷对照样品中对照核苷的峰面积，
[0010]ai
为降解样品中构成dna的每个脱氧核糖核苷的峰面积，
[0011]
mw
ratio
为构成dna的脱氧核苷酸与其对应核苷的分子量比值，
[0012]
rrfi为核苷在液相色谱体系中相对于对照核苷的相对响应因子，
[0013]
ccs为待测核酸样品降解过程中的体积变化比例。
[0014]
其中步骤(2)中，通过核苷鉴别样品在液相图谱中的峰特征定位降解样品中核苷的峰位置。可选峰特征为各鉴别核苷的相对保留时间或保留时间。
[0015]
其中步骤(2)中，核苷鉴别样品至少包括胸苷、2
’‑
脱氧腺苷、2
’‑
脱氧鸟苷和2
’‑
脱氧胞苷。其中步骤(2)中，核苷鉴别样品还包括尿苷、鸟苷、胞苷或5-甲基-2
’‑
脱氧胞苷。
[0016]
其中步骤(2)还包括由同一液相色谱体系分别检测降解样品、核苷对照样品和核苷鉴别样品。
[0017]
其中步骤(1)包括：(a)将核酸样品用超声波破碎仪超声破碎成寡核苷酸片段；(b)
将超声破碎后的样品用酶消化溶液酶解成核苷。
[0018]
进一步地，步骤(1)包括：取待测核酸样品于第一容器中，用超声波破碎仪进行超声破碎；取第一容器内溶液和酶消化溶液于第二容器中孵育；
[0019]
步骤(2)中，
[0020]
其中：dfs为超声破碎后第一容器内溶液进行酶处理时的稀释因子，ws为超声破碎后第一容器内溶液体积，
[0021]vs
为供试品的取样体积。
[0022]
本发明采用超声将dna分子处理成寡核苷酸片段，进而酶解成核苷，然后采用外标法对核苷进行测定，得到脱氧核苷酸的浓度。dna的四种脱氧核苷酸的浓度之和即为dna的浓度。在超声、酶解完全、无需进一步纯化的情况下实现对dna浓度的绝对定量。
附图说明
[0023]
图1为实施例1中核苷鉴别溶液的液相色谱图谱。
[0024]
图2为实施例1中对照品溶液的液相色谱图谱。
[0025]
图3为实施例1中供试品溶液的液相色谱图谱。
具体实施方式
[0026]
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，均属于本发明保护的范围。
[0027]
本发明可提供一实施方式的dna定量方法包括：
[0028]
(1)将待测核酸样品降解至核苷；
[0029]
(2)根据测定降解样品中的脱氧核糖核苷来计算待测核酸样品中dna的含量。
[0030]
作为一优选例，步骤
⑴
中包括对待测核酸样品进行超声破碎和酶解。进一步可包括：
[0031]
(a)将核酸样品用超声波破碎仪进行超声处理；
[0032]
(b)将超声处理后的样品用酶消化溶液进行酶解处理。
[0033]
该步骤(a)中，优选核酸样品进行稀释处理。应用超声波破碎过程中应注意保证核酸样品不丢失。可包括超声处理后冲洗破碎仪探头。
[0034]
该步骤(b)，酶消化溶液可包括核酸酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶。在此提供一具体制备：
[0035]
b1:混合丙三醇和反应缓冲液以制备磷酸二酯酶i稀释液；
[0036]
b2:混合磷酸二酯酶i稀释液和磷酸二酯酶i以制备磷酸二酯酶i溶液；
[0037]
b3:混合取核酸酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶i溶液和反应缓冲液以制备酶消化溶液。
[0038]
其中，反应缓冲液为六水合氯化镁、三羟甲基氨基甲烷和氯化钠的混合，并用盐酸调节ph至碱性。
[0039]
优选地，步骤(1)中将核酸样品进行降解处理以使脱氧核糖核酸充分降解成脱氧核糖核苷。一般情况下核糖核酸较脱氧核糖核酸更易降解，本领域技术人员应知，根据具体对象和工艺安排，使脱氧核糖核酸充分降解成脱氧核糖核苷的状态下不限于包括核糖核酸的充分降解。
[0040]
在此提供充分降解dna的具体例：
[0041]
1.制备反应缓冲液：称取六水合氯化镁0.38～0.44g、三羟甲基氨基甲烷0.21～0.27g和氯化钠0.55～0.61g于100ml烧杯中，加入水约75ml溶解并混匀；盐酸调节ph至7.9
±
0.2，转移至100ml容量瓶中，用水定容至刻度并混匀。其中优选称取六水合氯化镁0.40～0.42g、三羟甲基氨基甲烷0.23～0.25g和氯化钠0.57～0.59g；另外优选用1mol/l盐酸调节ph值；另外优选将ph值调节至7.9
±
0.15。
[0042]
2.制备磷酸二酯酶i稀释液：取体积比1:(0.8～1.2)的丙三醇和反应缓冲液于离心管中并混匀。其中优选取体积比1:(0.9～1.1)的丙三醇和反应缓冲液。
[0043]
3.制备磷酸二酯酶i溶液：取磷酸二酯酶i稀释液适量于磷酸二酯酶i中并混匀以得到浓度为0.08～0.12u/μl磷酸二酯酶i溶液。其中优选控制所述适量以得到浓度为0.09～0.11u/μl磷酸二酯酶i溶液。
[0044]
4.制备酶消化溶液：取核酸酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶i溶液适量于适量反应缓冲液中并混匀以得到浓度为核酸酶1800～2200u/ml，碱性磷酸酶40～55u/ml，磷酸二酯酶i 2.2～2.8u/ml的酶消化溶液。其中优选控制所述适量以得到浓度为核酸酶1900～2100u/ml，碱性磷酸酶44～52u/ml，更优选44～50u/ml，磷酸二酯酶i 2.4～2.6u/ml的酶消化溶液。
[0045]
5.降解处理：取待测核酸样品适量于已精密称定的第一容器中，使用超声波破碎仪以功率5％进行超声处理55～65min；取第一容器内溶液和酶消化溶液以体积比1:(0.8～1.2)适量于第二容器中并混匀，在35～39℃下孵育2.5h以上，得到供试品溶液。具体可包括：对适量于已精密称定的第一容器中的核酸样品进行适量稀释并混匀；加入一定量的水冲洗超声波破碎仪探头，并精密称定第一容器，控制溶液净重为4000～5000mg；另外优选超声处理时间为58～62min，优选以体积比1:(0.9～1.1)取第一容器内溶液和酶消化溶液适量于第二容器中，优选所述孵育为36～38℃下孵育2.8h以上。
[0046]
在此提供充分降解dna的一优选例：
[0047]
1.制备反应缓冲液：称取六水合氯化镁0.41g、三羟甲基氨基甲烷0.24g和氯化钠0.58g于100ml烧杯中，加入水约75ml溶解，混匀；用1mol/l盐酸调节ph至7.9
±
0.1，转移至100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。
[0048]
2.磷酸二酯酶i稀释液：取等量的丙三醇和反应缓冲液于离心管中，混匀。
[0049]
3.磷酸二酯酶i溶液：取磷酸二酯酶i稀释液适量于磷酸二酯酶i中，混匀，得到浓度为0.1u/μl的磷酸二酯酶i溶液。
[0050]
4.酶消化溶液：取核酸酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶i溶液适量于适量反应缓冲液中，混匀，得到浓度为核酸酶2000u/ml，碱性磷酸酶50u/ml，磷酸二酯酶i 2.5u/ml的酶消化溶液。
[0051]
5.量取供试品200μl和水800μl于已精密称定的5ml第一容器中并混匀，用超声波破碎仪以5％功率超声60min，加入一定体积的水冲洗超声波破碎仪探头后，精密称定第一
容器，使溶液的净重约4000～5000mg。量取第一容器内溶液100μl和酶消化溶液100μl于250μl第二容器中，混匀，在37℃下孵育3h，标记为供试品溶液。
[0052]
作为一优选例，步骤(2)中，采用外标法对核苷进行测定，得到脱氧核苷酸的浓度。构成dna的四种脱氧核苷酸浓度之和即为dna浓度。
[0053]
作为一优选例，步骤(2)中，根据降解样品在液相图谱中构成dna的对应各脱氧核糖核苷的峰面积以及核苷峰面积与核苷浓度的关系计算待测核酸样品中dna的含量。进一步还包括：
[0054]
(c)由同一液相色谱体系分别检测降解样品、核苷对照样品和核苷鉴别样品；
[0055]
(d)通过核苷鉴别样品在液相图谱中的保留时间或相对保留时间定位降解样品中核苷的峰位置；
[0056]
(e)根据下式计算dna含量：
[0057][0058]
其中：cs为核苷对照样品中对照核苷的浓度，
[0059]as
为核苷对照样品中对照核苷的峰面积，
[0060]ai
为降解样品中构成dna的每个脱氧核糖核苷的峰面积，
[0061]
mw
ratio
为构成dna的脱氧核苷酸与其对应核苷的分子量比值，
[0062]
rrfi为核苷相对于对照核苷的相对响应因子，
[0063]
dfs为超声破碎后第一容器内溶液进行酶处理时的稀释因子，
[0064]ws
为超声破碎后第一容器内溶液体积，
[0065]vs
为供试品的取样体积。
[0066]
步骤(d)中，核苷鉴别样品至少包括胸苷、2
’‑
脱氧腺苷、2
’‑
脱氧鸟苷和2
’‑
脱氧胞苷。优选地，核苷鉴别样品还包括尿苷、鸟苷、胞苷和/或5-甲基-2
’‑
脱氧胞苷。
[0067]
另外，对于对照核苷的选择本方法不做限定，dna和rna结构对应各核苷和修饰过的核苷都在对照核苷的选择范围。可选择地，可以rna结构对应一核苷为对照核苷并优选由其确定其相对保留时间。并且，作为对照品溶液应满足系统适应性要求。
[0068]
作为一优选例，以多针核苷对照样品的平均核苷峰面积为对照核苷的峰面积。
[0069]
另外步骤(2)还可以包括：
[0070]
核苷鉴别溶液的配制：例如取尿苷、鸟苷、胞苷、胸苷、2
’‑
脱氧腺苷、2
’‑
脱氧鸟苷、2
’‑
脱氧胞苷、5-甲基-2
’‑
脱氧胞苷适量，加入水溶解，混匀；再定量稀释，得到质量浓度为2～3μg/ml的核苷鉴别溶液；
[0071]
对照品溶液的配制：例如取腺苷对照品适量，加入水溶解，混匀；再定量稀释，得到质量浓度为2～8μg/ml的核苷对照溶液，优选浓度为3～7μg/ml，更优选5～7μg/ml。
[0072]
步骤(2)中，优选采用c18液相色谱柱的液相色谱法分别检测降解样品、核苷对照样品和核苷鉴别样品。具体检测条件为：使用醋酸盐溶液和有机溶剂作为流动相，上样量为1μl～100μl，流速为0.5～2.0ml/min，柱温为15～30℃，采用梯度洗脱。进一步为：c18色谱柱，usp分类l1，250
×
4.6mm或者150
×
4.6mm，4μm；流动相a：20mmol/l醋酸铵溶液(ph 4.4
±
0.2)；流动相b：乙腈；流速0.5～2.0ml/min，柱温15～30℃，优选17～25℃；进样量1～100μl；检测器：uv，波长260nm；调整梯度洗脱，使每个脱氧核苷的色谱峰与其临近色谱峰之间的
分离度不小于1.3，具体提出如下。
[0073]
t/min05152020.127％b22202022
[0074]
以上各方式中，待测核酸样品为从生物性检材提取样本dna获得的核酸样品。各方式还可以包含样本dna的提取和/或纯化的方法。提取和/或纯化方法例如采样煮沸裂解法、酚氯仿抽法、浓盐法、阴离子去污剂法、异硫氰酸胍/苯酚法(trizol法)、ctab法原理、离心柱纯化、磁珠法等。
[0075]
本发明具有以下优点：
[0076]
本发明方法简便易行，利于操作。本方法不需要对核酸样品进行额外的分离纯化操作。本方法采用超声处理核酸样品，可以将样品中的的dna和rna类成分处理成寡核苷酸片段，进而酶解成核苷，然后采用液相色谱法对核苷进行分析测定，此液相色谱法可以将组成dna与rna的各类核苷进行完全分离，通过计算各种核苷的含量进而计算得到脱氧核糖核酸的含量。因此，核酸样品中的rna杂质不会干扰dna的检测，不需要对核酸样品进行去除rna杂质的前处理操作，缩短了样品准备过程和检测时间。
[0077]
本发明方法简便易行，适用于实验室的研发和企业大规模生产的产品质量控制。根据本方法的检测原理，通过多种合成、提取、分离纯化方法获取的各类核酸样品中的蛋白类、rna类、脂质类杂质不会对通过液相色谱法分析的各类核苷产生干扰，因此，此方法适用于通过多种合成、提取、分离纯化方法获取的各类核酸样品中脱氧核糖核酸(dna)含量的检测，既适用于实验室的研发分析中各类dna对照品物质的标定，也适用于企业大规模生产的dna类产品质量控制。
[0078]
本发明建立了测定核酸样品中脱氧核糖核酸(dna)含量的液相色谱检测方法，结果表明，该方法专属性强，分离度良好，方法稳定，简便易行，灵敏度高，操作简便，精确度高。在考察的浓度范围内线性关系良好，回收率符合规定，可以准确有效的对脱氧核糖核酸(dna)含量进行定量，耐用性良好，成本低廉，可作为各类核酸样品中脱氧核糖核酸(dna)含量的检测方法，检测结果能满足结果质量判定，即适用于实验室的研发，同时适用于企业大规模生产的产品质量控制。
[0079]
实施例1：
[0080]
1.仪器与试剂
[0081]
仪器/试剂品牌/厂家货号/型号高效液相色谱thermou3000多参数测量仪梅特勒s470超声波破碎仪上海丙林电子科技有限公司c43-900千分之一天平梅特勒xpr603sndr十万分之一天平梅特勒xsr105du三(羟甲基)氨基甲烷vetecv900483氯化钠lableadx190六水合氯化镁vetecv900020醋酸铵sigma32301尿苷sigmau3750
鸟苷sigmag6752胞苷sigmac122106胸苷sigmat18952
’‑
脱氧腺苷sigmad74002
’‑
脱氧鸟苷sigmad71452
’‑
脱氧胞苷sigmad38975-甲基-2-脱氧胞苷mp biomedicals02198883-cf腺苷中国食品药品检定研究院110879磷酸二酯酶i源叶生物s10225核酸酶yeasen20157es碱性磷酸酶lableada5208丙三醇沪试10010618冰醋酸阿拉丁a116172纯化水青言韦辰自制
[0082]
2.实验方法
[0083]
2.1溶液配制
[0084]
2.1.1流动相和稀释剂的配制
[0085]
流动相a：20mmol/l醋酸铵溶液(ph 4.4)
[0086]
称取醋酸铵3.08g于2l烧杯中，加水1.8l溶解，混匀，用醋酸调ph值为4.4
±
0.2，加水稀释至2l。用0.22μm滤膜过滤，并用真空泵真空脱气2min。
[0087]
流动相b：乙腈
[0088]
量取乙腈1000ml于适宜的容器中。
[0089]
稀释剂：水
[0090]
量取水1000ml于适宜的容器中。
[0091]
2.1.2反应溶液的配制
[0092]
反应缓冲液：称取六水合氯化镁0.41g、三羟甲基氨基甲烷0.24g和氯化钠0.58g于100ml烧杯中，加入水约75ml溶解，混匀；用1mol/l盐酸调节ph至7.9
±
0.1，转移至100ml容量瓶中，用水定容至刻度，混匀。2～8℃下可储存6个月。
[0093]
磷酸二酯酶i稀释液：量取丙三醇5.0ml和反应缓冲液5.0ml于15ml离心管中，混匀。
[0094]
磷酸二酯酶i溶液(0.1u/μl)：量取磷酸二酯酶i稀释液1000μl于磷酸二酯酶i(100u/瓶)中，涡旋混匀。
[0095]
酶消化溶液(核酸酶2000u/ml，碱性磷酸酶50u/ml，磷酸二酯酶i 2.5u/ml)：取核酸酶(250u/μl)40μl、碱性磷酸酶(1u/μl)250μl和磷酸二酯酶i溶液125μl于5.0ml反应缓冲液中，混匀。
[0096]
2.1.3鉴别溶液的配制
[0097]
取尿苷、鸟苷、胞苷、胸苷、2
’‑
脱氧腺苷、2
’‑
脱氧鸟苷、2
’‑
脱氧胞苷、5-甲基-2
’‑
脱氧胞苷各25.0(
±
3)mg，精密称定，置200ml容量瓶中，加入水约185ml，超声溶解，用水稀释至刻度，混匀；精密量取该溶液2.0ml于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，标记为鉴
别溶液。
[0098]
2.1.4对照品溶液的配制
[0099]
取腺苷标准品20.0(
±
2)mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加入水约85ml，超声溶解，用水稀释至刻度，混匀。标记为腺苷储备溶液。
[0100]
精密量取腺苷储备溶液3.0ml于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。标记为对照品溶液。
[0101]
2.1.5系统适用性溶液的配制
[0102]
精密量取腺苷对照品溶液1.0ml于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀。标记为系统适用性溶液。
[0103]
2.1.6空白对照溶液
[0104]
量取水100μl和酶消化溶液100μl于250μl内插管中，混匀，在37℃下孵育3h，标记为空白对照溶液。
[0105]
2.1.7供试品溶液
[0106]
量取供试品200μl和水800μl于已精密称定的5ml流式管中，混匀，用超声波破碎仪以5％功率超声60min，加入一定体积的水冲洗超声波破碎仪探头后，精密称定流式管，使溶液的净重约4000～5000mg。量取流式管内溶液100μl和酶消化溶液100μl于250μl内插管中，混匀，在37℃下孵育3h，标记为供试品溶液。
[0107]
2.2色谱条件
[0108][0109]
2.3系统适应性要求
[0110][0111]
2.4计算
[0112]
按照合理的积分参数，扣除空白后，进行积分。
[0113]
对照品溶液、鉴别溶液的相对保留时间见下表，根据对照品溶液、鉴别溶液中不同核苷的相对保留时间或保留时间对供试品溶液中的各个峰进行确定。
[0114]
按照如下公式计算核酸的质量浓度：
[0115][0116][0117]cs
为腺苷对照品溶液中腺苷的浓度，μg/ml
[0118]as
为腺苷对照品溶液中腺苷的平均峰面积(n＝6)
[0119]ai
为供试品溶液中每个核苷的峰面积
[0120]
mw
ratio
为dna/rna结构中核苷酸与其对应核苷的分子量比值(见下表)
[0121]
rrfi为核苷的相对响应因子(见下表)
[0122]
dfs为超声处理后流式管内溶液进行酶处理时的的稀释因子，2
[0123]ws
为超声处理后流式管内溶液体积，ml
[0124]vs
为供试品的取样体积，ml
[0125]
备注：
[0126]
(1)溶剂密度按1.0kg/l计算，单位可换算ng/μl或μg/ml；
[0127]
(2)dna质量浓度为2
’‑
脱氧胞苷、2
’‑
脱氧鸟苷、胸苷、2
’‑
脱氧腺苷等四种核苷计算所得结果，rna质量浓度为胞苷、尿苷、鸟苷、腺苷等四种核苷计算所得结果。
[0128]
dna/rna结构中核苷酸与其对应核苷的分子量比值(mw
ratio
)和核苷的相对响应因子(rrfi)为见下表。
[0129]
名称相对保留时间rrt相对响应因子rrfimw
ratio
胞苷0.380.531.25482
’‑
脱氧胞苷0.500.561.2727尿苷0.530.751.25375-甲基-2
’‑
脱氧胞苷0.820.251.2569鸟苷0.860.741.21882
’‑
脱氧鸟苷0.910.831.2319胸苷0.960.681.2558腺苷1.001.001.23192
’‑
脱氧腺苷1.041.091.2466其它-1.001.0000
[0130]
2.5测定结果及结论
[0131]
测定结果见表1～表3及图1～图3。表1:核苷鉴别溶液
[0132]
名称保留时间/min分离度胞苷5.473n.a.2
’‑
脱氧胞苷7.239.34
尿苷7.5751.595-甲基-2
’‑
脱氧胞苷11.80223.79鸟苷12.4024.932
’‑
脱氧鸟苷13.1126.96胸苷13.7456.142
’‑
脱氧腺苷14.91310.59
[0133]
表2:对照品溶液
[0134][0135]
表3:样品检测结果
[0136][0137]
从表1中可以看出，核苷鉴别溶液中各核苷之间的离度均＞1.5，均符合规定。表明该方法可很好的分离各类核苷。典型图谱参见图1、图2、图3。从图1中可以看出，此方法可以完全分离各类核苷，且峰型良好；从图2中可看出，对照品溶液色谱图中腺苷峰型良好，从表2中可看出，六针对照品溶液之间重复性良好；从图3中可看出，检测样品中无杂质干扰各核苷的分离，且分离良好，从表3中可看出，核酸样品中脱氧核糖核酸含量检测结果良好，满足方法使用目的。

技术特征：
1.一种测定核酸样品中dna含量的方法，其特征在于，包括步骤：(1)将待测核酸样品中dna分子降解至脱氧核糖核苷；(2)根据测定降解样品中的核苷来计算待测核酸样品中dna的含量。2.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，根据降解样品在液相图谱中构成dna的各脱氧核糖核苷的峰面积和核苷峰面积与核苷浓度的关系计算待测核酸样品中dna的含量。3.如权利要求2所述的方法，其中，步骤(2)中，核苷峰面积与核苷浓度的关系由任意核苷对照样品确定。4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤(2)中，根据下式计算dna含量：其中：c
s
为核苷对照样品中对照核苷的浓度，a
s
为核苷对照样品中对照核苷的峰面积，a
i
为降解样品中构成dna的每个脱氧核糖核苷的峰面积，mw
ratio
为构成dna的脱氧核苷酸与其对应脱氧核糖核苷的分子量比值，rrf
i
为核苷在液相色谱体系中相对于对照核苷的相对响应因子，cc
s
为待测核酸样品降解过程中的体积变化比例。5.如权利要求4所述的方法，其中，a
s
为多针核苷对照样品中对照核苷的峰面积的平均值。6.如权利要求2所述的方法，其中，步骤(2)中，通过核苷鉴别样品在液相图谱中的峰特征定位降解样品中核苷的峰位置，所述峰特征为各鉴别核苷的相对保留时间或保留时间。7.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(2)中，核苷鉴别样品至少包括胸苷、2
’‑
脱氧腺苷、2
’‑
脱氧鸟苷和2
’‑
脱氧胞苷。8.如权利要求4所述的方法，其中，步骤(1)包括：取待测核酸样品于第一容器中，用超声波破碎仪进行超声破碎；取第一容器内溶液和酶消化溶液于第二容器中孵育；步骤(2)中，其中：df
s
为超声破碎后第一容器内溶液进行酶处理时的稀释因子，w
s
为超声破碎后第一容器内的溶液体积，v
s
为供试品的取样体积。9.如权利要求8所述的方法，其中，步骤(1)包括：制备反应缓冲液：取质量比(0.38～0.44):(0.21～0.27):(0.55～0.61)的六水合氯化镁、三羟甲基氨基甲烷和氯化钠于烧杯中，加入水溶解并混匀；盐酸调节ph至7.9
±
0.2，转
移至容量瓶中，用水定容至容量瓶刻度并混匀以得到浓度为六水合氯化镁3.8～4.4mg/ml、三羟甲基氨基甲烷2.1～2.7mg/ml和氯化钠5.5～6.1mg/ml的反应缓冲液；制备磷酸二酯酶i稀释液：取体积比1:(0.8～1.2)的丙三醇和反应缓冲液于离心管中并混匀；制备磷酸二酯酶i溶液：取磷酸二酯酶i稀释液适量于磷酸二酯酶i中并混匀以得到浓度为0.08～0.12u/μl磷酸二酯酶i溶液；制备酶消化溶液：取核酸酶、碱性磷酸酶和磷酸二酯酶i溶液适量于适量反应缓冲液中并混匀以得到浓度为核酸酶1800～2200u/ml，碱性磷酸酶40～55u/ml，磷酸二酯酶i 2.2～2.8u/ml的酶消化溶液；降解处理：取待测核酸样品适量于已精密称定的第一容器中并加入一定量的水稀释混匀，使用超声波破碎仪以功率5～20％进行超声处理30～90min后，精密称定第一容器以控制溶液净重为4000～5000mg；取第一容器内溶液和酶消化溶液以体积比1:(0.8～1.2)适量于第二容器中并混匀，在35～39℃下孵育2.5h以上。10.如权利要求9所述的方法，其中，采用c18液相色谱柱的液相色谱法分别检测降解样品、核苷对照样品和核苷鉴别样品，检测条件为：c18色谱柱，usp分类l1，250
×
4.6mm或者150
×
4.6mm；流动相a：20mmol/l醋酸铵溶液(ph 4.4
±
0.2)；流动相b：乙腈；流速0.5～2.0ml/min，柱温15～30℃；进样量1～100μl；检测器：uv，波长260nm；梯度洗脱，调整洗脱梯度，使每个脱氧核苷的色谱峰与其临近色谱峰之间的分离度不小于1.3。

技术总结
本发明提供一种测定核酸样品中DNA含量的方法，适用于各种方式提取或纯化的核酸样品中DNA含量的测定，不需要额外的纯化。测定方法包括：采用超声破碎和酶处理等方式降解待测核酸样品中的DNA分子至脱氧核糖核苷；根据测定降解样品中的核苷来计算待测核酸样品中DNA的含量。根据本发明，尤其建立了测定各种类型核酸样品中DNA含量的液相色谱检测方法。样品中DNA含量的液相色谱检测方法。样品中DNA含量的液相色谱检测方法。


技术研发人员：弓培源 李敬谊 张雨嫣 庞田 段盼盼 陈静
受保护的技术使用者：北京青言韦辰生物科技有限公司
技术研发日：2023.05.19
技术公布日：2023/9/20