水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用与流程

1.本技术涉及生物医药技术领域，具体涉及水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.由于创伤、感染及肿瘤等引发的骨骼疾病易导致骨缺损，将严重影响患者的生活质量，如骨缺损超过一定范围，超过了骨骼的最大自行修复能力，则该骨缺损部位将无法自行愈合，从而导致无连续性骨痂形成，造成骨不连。针对这种情况，目前临床上主要采用自体骨移植或同种异体骨移植的方法进行治疗。但自体骨移植来源有限，而同种异体骨移植则面临免疫排斥等并发症问题，限制了其在临床的广泛应用。随着骨组织工程学的发展，利用生物材料、种子细胞和生长因子为新的骨组织再生提供场地，为骨缺损的治疗开辟了新的途径。
3.由于骨缺损部位血管遭受严重破坏，导致局部血供严重不足，造成缺氧及营养耗竭等恶劣微环境，严重影响骨修复过程中种子细胞发挥作用。骨髓间充质干细胞是主要的骨修复种子细胞之一，研究证实，缺氧会下调关键成骨转录因子runx2，抑制其成骨分化，并且当氧浓度在2％以上骨髓间充质干细胞才会发生成骨分化。
4.当骨缺损发生时，局部活性氧水平明显升高，导致种子细胞发生氧化应激，导致细胞处于氧化应激状态，直接激活bmscs中叉形头转录因子o亚型(fox o)转录，下调β-连环蛋白(β-catenin)表达，引起一系列下游信号通路相关促成骨分化因子表达的改变，进而降低bmscs定向成骨分化能力及增殖活性。研究表明，硒元素具备良好的抗氧化性能，一些含硒化合物，比如亚硒酸钠能够抑制氧化应激对骨髓间充质干细胞产生的不良影响，并且抑制了氧化应激诱导细胞外信号调节激酶(erk)的激活，促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化。
5.但在目前应用骨组织工程治疗骨缺损的研究中，针对缺氧微环境，缺乏实时调控长期释放氧气的材料，用来改善种子细胞乏氧，帮助骨修复；针对高浓度活性氧微环境，缺乏实时调控生物活性药物释放的材料，用来提高种子细胞抗氧化能力，帮助骨修复。因此，有必要开发一种能调控氧气及含硒化合物长期释放的生物材料以促进骨修复。


技术实现要素：

6.基于现有技术存在的缺陷，本技术的目的在于提供一种水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用，该水凝胶材料具有超声响应功能，能够在超声辅助下调控氧气和含硒化合物的长期释放，有效促进骨修复。
7.为了达到上述目的，第一方面本技术提供了一种水凝胶制备材料，包括水凝胶基体前驱体、第一复合材料、光引发剂和水；
8.所述第一复合材料包括第二复合材料和含硒化合物，所述含硒化合物分布在所述第二复合材料至少部分表面；
9.所述第二复合材料包括第三复合材料和包覆在所述第三复合材料表面的二氧化
硅；
10.所述第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物；
11.所述液体氟碳化合物中负载有氧气。
12.所述水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够有效应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境。所得水凝胶材料，一方面在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；另一方面，在超声辅助下还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。所得水凝胶材料在超声辅助下，能通过上述两方面的作用，能够有效促进骨修复。
13.所得水凝胶材料通过将第一复合材料负载在水凝胶基体上，一方面能够延长氧气和含硒化合物的缓释时间，另一方面能作为载体，易于填充在骨缺损处。
14.所得水凝胶材料通过将含硒化合物负载在第二复合材料表面，使超声控制氧气的释放的时候，能利用释放的氧气将含硒化合物冲下来，有利于含硒化合物的释放。
15.所述水凝胶制备材料在使用时，可通过注射等方法引入到骨缺损处，经光照凝胶化，再经超声处理，缓释氧气和含硒化合物。
16.在一实施例中，所述第一复合材料的量为所述水凝胶制备材料的量的0.1％-0.5％(w/v)。在计算该比例时，所述第一复合材料的量的单位为g，所述水凝胶制备材料的量的单位为ml，其他类似计算同理。
17.在一实施例中，所述含硒化合物和所述第一复合材料的比例为34μmol:1mg。
18.第二方面，本技术提供了一种水凝胶材料，包括水凝胶基体和第一复合材料；
19.所述第一复合材料负载在所述水凝胶基体中；
20.所述第一复合材料包括第二复合材料和含硒化合物，所述含硒化合物分布在所述第二复合材料至少部分表面；
21.所述第二复合材料包括第三复合材料和包覆在所述第三复合材料表面的二氧化硅；
22.所述第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)和包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物；
23.所述液体氟碳化合物中负载有氧气。
24.所述水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够有效应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境。所述水凝胶材料，一方面在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；另一方面，在超声辅助下还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。所述水凝胶材料在超声辅助下，能通过上述两方面的作用，能够有效促进骨修复。
25.所述水凝胶材料通过将所述第一复合材料负载在所述水凝胶基体上，一方面能够延长氧气和含硒化合物的缓释时间，另一方面能作为载体，易于填充在骨缺损处。
26.所述水凝胶材料通过将含硒化合物负载在所述第二复合材料表面，使超声控制氧气的释放的时候，能利用释放的氧气将含硒化合物冲下来，有利于含硒化合物的释放。
27.在一实施例中，所述第一复合材料的量为所述水凝胶基体的量的0.1％-0.5％(w/v)。
28.在一实施例中，所述含硒化合物和所述第一复合材料的比例为34μmol:1mg。
29.在一实施例中，所述第一复合材料中氧气的质量含量为0.16％。
30.在一实施例中，所述第一复合材料为纳米材料。所述第一复合材料为至少在一个维度上尺寸小于100nm的材料。
31.在一实施例中，所述含硒化合物包括硒代胱氨酸(sec)、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸中的至少一种，但并不局限于此。
32.在一实施例中，所述液体氟碳化合物包括全氟溴辛烷(pfob)、全氟己烷中的至少一种，但并不局限于此。
33.在一实施例中，所述水凝胶基体包括甲基丙烯酸酰化明胶(gelma)水凝胶、海藻酸钙水凝胶中的至少一种，其中甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶的氨基取代度为90
±
5％，但并不局限于此。
34.第三方面，本技术还提供了一种所述水凝胶制备材料的制备方法，包括以下步骤：
35.将季铵盐表面活性剂溶解于第一水中，得到a液；
36.将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于挥发性溶剂中，再加入液体氟碳化合物，混合均匀，得到b液；
37.将所述b液滴入所述a液中，超声乳化，得到c液；
38.将所述c液中的所述挥发性溶剂挥发除去，固液分离，清洗，得到表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；
39.将表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物分散于第二水中，置于氧气气氛下和/或向所述第二水中通入氧气以使液体氟碳化合物吸收氧气，再加入醇溶剂，分散，然后加入氨水，继续分散，接着加入硅源进行第一反应，反应结束后固液分离，得到第二复合材料；
40.将含硒化合物配制成溶液，得到含硒化合物溶液；
41.将所得第二复合材料加入所述含硒化合物溶液中，在氧气气氛下分散，固液分离，得到第一复合材料；
42.将水凝胶基体前驱体和光引发剂在水中溶解，得到水凝胶基体前驱体溶液；
43.将所述第一复合材料加入所述水凝胶基体前驱体溶液中，分散，得到水凝胶制备材料。
44.所述制备方法制得的水凝胶制备材料经光照处理制得的水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够有效应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境。所得水凝胶材料，一方面在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；另一方面，在超声辅助下还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。所得水凝胶材料在超声辅助下，能通过上述两方面的作用，能够有效促进骨修复。
45.所述制备方法在制得第二复合材料后，才进行负载含硒化合物处理，这样含硒化合物负载在第二复合材料的表面，使超声控制氧气的释放的时候，能利用释放的氧气将含硒化合物冲下来，有利于含硒化合物的释放。而将含硒化合物同聚乳酸-羟基乙酸共聚物一起加入挥发性溶剂中来制备表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物，由于含硒化合物大多难溶于水及pfob，很难得到同时包裹pfob及含硒化合物的plga纳米颗粒，造成所得水凝胶的含硒化合物缓释效果很差。
46.在一实施例中，所述a液中季铵盐表面活性剂的含量为5mg/ml，所述b液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的含量为7mg/ml且液体氟碳化合物的体积百分含量为0.9％，所述b液和所述a液的体积比为1:4。在该条件下，液体氟碳化合物能很好的包裹在聚乳酸-羟基乙酸共聚物的表面。
47.在一实施例中，所述超声乳化的功率为600w，总时间为10min，每超声2s停1s。在该条件下，所得c液乳化充分，确保后续除去挥发溶剂析出的至少部分表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物为纳米颗粒。
48.在一实施例中，在所述超声乳化过程中将所产生的白色絮状物除去。为了保证plga能完全包裹pfob，会加过量的plga，所以会有未溶解的plga析出，除去析出的plga更能够保证纳米体系的稳定。
49.在一实施例中，所述季铵盐表面活性剂包括溴代十六烷基三甲胺(ctab)、十六烷基三甲基氯化铵中的至少一种，但不局限于此。
50.在一实施例中，所述挥发性溶剂包括丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种，但不局限于此。
51.在一实施例中，通过将所述c液置于通风处，或者利用鼓风工具对其鼓风，或者对其搅拌，或者采用上述方法中的至少两种以加快挥发性溶剂的挥发除去。另外，也可以将所述c液不经特殊处理，静置挥发除去其内挥发性溶剂。
52.在制备所述第二复合材料步骤中，为使所述表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的液体氟碳化合物吸收氧气，在一实施例中，将其置于可密闭的容器中，加入水分散，将该容器抽真空再通入氧气然后停止通气，在密闭环境下搅拌使液体氟碳化合物充分吸收氧气。在另一实施例中，将其置于可密闭的容器中，加入水分散，向所述第二水中通入氧气，然后停止通气，在密闭环境下搅拌使液体氟碳化合物充分吸收氧气。还可以在通入氧气前不进行分散，或者全程搅拌。也可以一直通入氧气，直至液体氟碳化合物充分吸收氧气。
53.在一实施例中，进行所述第一反应时，所用表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物、醇溶剂、氨水和硅源的比例为70mg：5ml：1.92ml：200μl，其中氨水浓度为25wt％。在该条件下，硅源发生充分分解，生成二氧化硅，而在表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面形成薄壳硅。
54.在一实施例中，所述第一反应的温度为20-35℃。在进行第一反应时，可以不需要进行加热或制备处理。所述第一反应的时间可以根据其反应温度进行调整。在一实施例中，所述第一反应的时间为24h。
55.在一实施例中，所述醇溶剂包括异丙醇，但不局限于此。
56.在一实施例中，所述硅源包括硅酸四乙酯，但不局限于此。
57.在一实施例中，所述含硒化合物溶液中含硒化合物含量为4.5mg/ml，所述第二复合材料和所述含硒化合物溶液的比例为20mg：10ml。在此条件下，所述第二复合材料上可以充分负载含硒化合物。
58.在一实施例中，所述将所得第二复合材料加入所述含硒化合物溶液中，在氧气气氛下分散步骤中，在氧气气氛下分散时间为6h。
59.在一实施例中，所述含硒化合物溶液中的溶剂为ph值为2的水，如稀盐酸、稀硫酸等。
60.在一实施例中，所述水凝胶基体前驱体溶液中水凝胶基体前驱体的含量为100mg/ml，光引发剂含量为2.5mg/ml，所述第一复合材料的量为所述水凝胶基体前驱体溶液的量的0.1％-0.5％(w/v)。在该条件下，所述第一复合材料能充分负载在所得水凝胶基体上，并使所得水凝胶在超声辅助下很好的调控氧气和含硒化合物的长期释放。
61.在一实施例中，所述水凝胶基体前驱体包括甲基丙烯酸酰化明胶，但不局限于此。
62.在一实施例中，所述光引发剂包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂(lap)，但不局限于此。
63.第四方面，本技术提供了一种水凝胶材料的制备方法，包括以下步骤：将所述水凝胶制备材料进行光照，得到水凝胶材料。光照波长和时间可以根据所使用的水凝胶基体前驱体和光引发剂的种类等进行调整。在一实施例中，将所述水凝胶制备材料在蓝光下进行照射以得到水凝胶材料，如在405nm波长的光下照射30s。
64.第五方面，本技术还提供所述水凝胶制备材料、所述水凝胶材料、所述制备方法制得的水凝胶制备材料或所述制备方法制得的水凝胶材料在制备超声辅助下促进骨修复的药物中的应用。所述药物包括但不局限于支架。
65.相比现有技术，本技术的有益效果在于：
66.(1)本技术水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料在超声辅助下能够长期调控氧气释放，提高骨缺损局部氧浓度，改善骨髓间充质干细胞乏氧问题，增强其活性；同时还可以长期调控含硒化合物的释放，通过调节骨髓间充质干细胞中抗氧化硒蛋白上调，增强其抗氧化能力，激活β-catenin通路，上调关键成骨转录因子runx2，促进干细胞成骨分化。
67.(2)本技术水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料具有超声相应功能，能很好应对骨缺损微环境中缺氧及高浓度活性氧的不利微环境，有效促进骨修复。
附图说明
68.图1为本技术一实施方式中水凝胶材料制备和应用流程图；
69.图2为本技术所得o
2-si@sec的结构示意图；
70.图3为实施例1所得o
2-si@sec的tem及eds图；
71.图4为实施例1所得o
2-si@sec的xps图；
72.图5为sec以及实施例1所得o
2-si和o
2-si@sec的紫外吸收图谱；
73.图6为icp测得实施例1所得o
2-si@sec中sec含量结果图；
74.图7为超声调控氧气释放曲线图，其中(a)实施例1所得o
2-si@sec，(b)实施例1所得o
2-si@sec@gel；
75.图8为乏氧条件下骨髓间充质干细胞(bmscs)增殖图；
76.图9为超声调控硒代胱氨酸(sec)释放曲线图，其中(a)实施例1所得o
2-si@sec在不同电压幅值下每日超声1min，(b)实施例1所得o
2-si@sec在200mvpp下每日超声不同时间，(c)实施例1所得o
2-si@sec@gel在200mvpp下每日超声不同时间；
77.图10为细胞死活染色图(am/pi)及活性氧检测图(dcfh-da)；
78.图11为大鼠颅骨8mm缺损修复图。
具体实施方式
79.为了更好地说明本技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本技术作进一步说明，其目的在于详细地理解本技术的内容，而不是对本技术的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术的保护范围。本技术实施所涉及的实验试剂及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂及仪器。
80.实施例1
81.参见图1制备水凝胶支架，具体包括以下步骤：
82.1.a液：称取200mg ctab溶于40ml超纯水中，用超声波震荡使其完全溶解，得到a液；
83.2.b液：称取70mg plga溶解于10ml丙酮中，加入90μl pfob，混匀，得到b液；
84.3.将b液按体积比b液：a液＝10ml：40ml缓慢滴入a液中，并使用超声进行乳化，得到c液，其中超声参数为超声2s停1s，超声总时间为10min，功率为600w，超声期间挑除产生的白色絮状物；
85.4.将c液置于通风橱内，等待其丙酮挥发完毕进行下一步实验；
86.5.将丙酮挥发后所得液体进行离心，参数为6000rpm、10min，之后弃去上清，然后用超纯水清洗两次，获得包裹pfob的plga纳米颗粒；
87.6.将70mg包裹pfob的plga纳米颗粒置于三口烧瓶中，加入转子及45ml超纯水，震荡混匀，采用橡皮塞进行密封，利用真空泵将烧瓶内空气抽尽，接着向其内通入氧气，关闭阀门密封，调节搅拌器使转子保持250转/min，搅拌1h使pfob充分吸氧；
88.7.使用1ml注射器通过橡皮塞向三口烧瓶内加入5ml异丙醇，继续搅拌30min，接着加入1.92ml浓度25wt％的氨水，搅拌30min，接着加入200μl硅酸四乙酯，反应24小时后12000rpm离心10min得到第一复合材料，即载氧薄壳硅，记作o
2-si；
89.8.量取10ml超纯水，加入60μl浓度30wt％的盐酸，得到稀盐酸溶液(ph值＝2)，称取硒代胱氨酸(sec)溶解于所得稀盐酸中，终浓度为4.5mg/ml，装入三口烧瓶内，抽真空并充氧气，接着加入20mg上述载氧薄壳硅，搅拌6h，12000rpm后离心得到合成负载硒代胱氨酸的载氧薄壳硅，即表面负载含硒化合物的第一复合材料，记作o
2-si@sec，采用透射电镜及能谱对o
2-si@sec进行表征，证明其形貌及各元素的载入(图3和图4)；采用紫外分光光度计进行分析，证明硒代胱氨酸成功负载在薄壳硅表面(图5)；采用电感耦合等离子体(icp)测量o
2-si@sec中硒代胱氨酸含量(图6)；
90.9.称量氨基取代度为90
±
5％的gelma 100mg，溶于1ml lap浓度0.25mg/ml的lap溶液中，60℃下避光加热1h，形成gelma溶液；
91.10.避光条件下，将o
2-si@sec加入gelma溶液中(o
2-si@sec终浓度为0.25％(w/v)，
混匀，得到水凝胶制备材料，再将所得水凝胶制备材料滴加于模具中，采用405nm蓝光照射30s，得到载有o
2-si@sec的甲基丙烯酸酰化水凝胶支架，记作o
2-si@sec@gel。
92.实施例2：超声调控水凝胶材料中氧气释放，并改善乏氧微环境验证
93.(1)将实施例1所得25mg o
2-si@sec置于5ml超纯水中，每日8点采用不同电压幅值的超声辐照1min，使用溶氧仪测量其氧气释放情况，测试结果见图7(a)，由该图可知，氧气释放时间在一周左右，一周之后氧气释放不明显，并且随着电压幅值的提高，氧气释放量增加，当电压幅值≥200mvpp时，氧气释放量较多。另外，当电压幅值≥200mvpp时，还观察到明显的强回声，代表氧气的释放。
94.采用类似的方法，将实施例1所得25mg o
2-si@sec@gel置于5ml超纯水中，每日8点采用200mvpp的超声辐照不同时间，使用溶氧仪测量其氧气释放情况，测试结果见图7(b)，由该图可知，随着每天超声辐照时间增加，氧气释放速度增加，在每天辐照1min的条件下，其氧气可释放长达2周。
95.(2)在乏氧条件下(1％(v/v)氧浓度)将骨髓间充质干细胞分别进行单独培养(hypoxic组)、与o
2-si@sec@gel(实施例1所得，下同)共培养(hypoxic+o
2-si@sec@gel组)和在超声辅助下与o
2-si@sec@gel(hypoxic+o
2-si@sec@gel+us组)；同时设置骨髓间充质干细胞在正常氧气浓度条件下单独培养的对照组(normal组)。在第1，3，5天分别采用结晶紫对各组细胞进行染色，结果见图8。由此发现hypoxic+o
2-si@sec@gel+us组细胞增殖速度明显快于hypoxic+o
2-si@sec@gel组及hypoxic组，与normal组类似。这证明通过超声可调控氧气释放增加，促进骨髓间充质干细胞增殖。
96.超声辅助功率：200mvpp，频率1.5mhz，波形为正弦波，每天辐照时间为1min。水凝胶中o
2-si@sec浓度为0.25％(w/v)，水凝胶的用量为24孔板中培养小室内注入200μl水凝胶。骨髓间充质干细胞的用量为24孔板中培养小室内注入500μl浓度1*105个/ml的骨髓间充质干细胞。
97.实施例3：超声调控水凝胶材料中硒代胱氨酸释放，并提高骨髓间充质干细胞抗氧化应激能力的验证
98.(1)将25mg o
2-si@sec(实施例1所得，下同)置于5ml超纯水中，每日8点采用不同电压幅值的超声辐照1min，于次日8点过滤留下液体，采用王水进行硝化，利用hplc测量se浓度，结果见图9(a)，可以看出超声电压幅值的改变可以很好调控sec释放情况，且随着超声电压幅值的增加，sec释放量增加。
99.将25mg o
2-si@sec置于5ml超纯水中，每日8点采用200mvpp超声辐照不同时间，于次日8点过滤留下液体，采用王水进行硝化，利用hplc测量se浓度，结果见图9(b)，可以看出超声时间的改变可以很好调控sec释放情况，且随着超声时间的增加，sec释放量增加。
100.将25mg o
2-si@sec@gel(实施例1所得)置于5ml超纯水中，每日8点采用200mvpp超声辐照不同时间，于次日8点过滤留下液体，采用王水进行硝化，利用icp测量se浓度。剩余o
2-si@sec@gel继续置于5ml超纯水中，重复上述实验，连续测量十四天，做出超声调控sec释放曲线图，见图9(c)，发现随着超声时间增加，sec释放量增加。
101.(2)将骨髓间充质干细胞分别进行单独培养(即100μm h2o2组)、与o
2-si@sec@gel(实施例1所得)进行共培养(即o2@sec@gel组)、在超声辅助下与o
2-si@sec@gel(实施例1所得)进行共培养(即o2@sec@gel+us组)，并分别加入100μm过氧化氢建立干细胞氧化应激损
伤模型。同时设置骨髓间充质干细胞正常培养组，作为control组。用ros探针dcfh-da检测不同组别产生活性氧情况，o2@sec@gel组及o2@sec@gel+us组均能干细胞活性氧产生，其中o2@sec@gel+us组最优异。继续培养24h后采用细胞死活染色发现，o2@sec@gel组及o2@sec@gel+us组均能减少干细胞死亡率，其中o2@sec@gel+us组最为明显，证明o
2-si@sec@gel+超声可释放出硒代胱氨酸提高其抗氧化应激能力(图10)。
102.超声辅助功率：200mvpp，频率1.5mhz，波形为正弦波，每天辐照时间为1min。水凝胶中o
2-si@sec浓度为0.25％(w/v)，水凝胶的用量为24孔板中培养小室内注入200μl水凝胶。骨髓间充质干细胞的用量为24孔板中培养小室内注入500μl浓度1*105个/ml的骨髓间充质干细胞。
103.实施例4：动物体内验证支架修复效果
104.1.选取8周龄雄性sd大鼠，3％戊巴比妥(0.3mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠颅骨手术局部进行备皮，用手术刀从鼻梁处开始切至颅底，将皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜拉开以完全暴露颅顶骨，使用8mm直径的打孔器(必须是正圆形骨钻，圆形伤口)在顶骨中央形成8mm圆形全层颅骨缺损，用生理盐水冲洗降温，同时保持硬脑膜的完整性(颅骨全层缺损)。2.植入成骨材料，水凝胶制备材料填充骨缺损处用量为100μl，之后采用蓝光手电筒照射30s，具体组别分别为单纯造模组(即blank组)、造模+gelma治疗组(即gelma组)、造模+gelma+超声治疗组(即gelma+us组)、造模+o
2-si@sec@gel治疗组(即o
2-si@sec@gel组)、造模+o
2-si@sec@gel+超声治疗组(即o
2-si@sec@gel+us组)，其中gelma组和gelma+us组所用水凝胶制备材料为实施例1步骤9所得gelma溶液，o
2-si@sec@gel组和o
2-si@sec@gel+us组所用水凝胶制备材料为实施例1步骤10所得水凝胶制备材料。各超声治疗组每天采用200mvpp、频率1.5mhz且波形为正弦波的超声辐照1min。各组在治疗4周后，将颅骨取出固定进行micro-ct观察治疗效果。发现造模+o
2-si@sec@gel+超声治疗组效果最好，骨修复最快(图8)。
105.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本技术的技术方案而非对本技术保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本技术作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术技术方案的实质和范围。

技术特征：
1.一种水凝胶制备材料，其特征在于，包括水凝胶基体前驱体、第一复合材料、光引发剂和水；所述第一复合材料包括第二复合材料和含硒化合物，所述含硒化合物分布在所述第二复合材料至少部分表面；所述第二复合材料包括第三复合材料和包覆在所述第三复合材料表面的二氧化硅；所述第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物；所述液体氟碳化合物中负载有氧气。2.一种水凝胶材料，其特征在于，包括水凝胶基体和第一复合材料；所述第一复合材料负载在所述水凝胶基体中；所述第一复合材料包括第二复合材料和含硒化合物，所述含硒化合物分布在所述第二复合材料至少部分表面；所述第二复合材料包括第三复合材料和包覆在所述第三复合材料表面的二氧化硅；所述第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和包覆在所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物；所述液体氟碳化合物中负载有氧气。3.如权利要求2所述的水凝胶材料，其特征在于，所述第一复合材料的量为所述水凝胶基体的量的0.1％-0.5％(w/v)。4.如权利要求2所述的水凝胶材料，其特征在于，所述含硒化合物和所述第一复合材料的比例为34μmol:1mg。5.如权利要求2所述的水凝胶材料，其特征在于，所述第一复合材料中氧气的质量含量为0.16％。6.如权利要求2所述的水凝胶材料，其特征在于，满足以下条件中的至少一条：(1)所述第一复合材料为纳米材料；(2)所述含硒化合物包括硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸中的至少一种；(3)所述液体氟碳化合物包括全氟溴辛烷、全氟己烷中的至少一种；(4)所述水凝胶基体包括甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶、海藻酸钙水凝胶中的至少一种，其中甲基丙烯酸酰化明胶水凝胶的氨基取代度为90
±
5％。7.一种如权利要求1所述的水凝胶制备材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将季铵盐表面活性剂溶解于第一水中，得到a液；将聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶解于挥发性溶剂中，再加入液体氟碳化合物，混合均匀，得到b液；将所述b液滴入所述a液中，超声乳化，得到c液；将所述c液中的所述挥发性溶剂挥发除去，固液分离，清洗，得到表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；将表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物分散于第二水中，置于氧气气氛下和/或向所述第二水中通入氧气以使液体氟碳化合物吸收氧气，再加入醇溶剂，分散，然后加入氨水，继续分散，接着加入硅源进行第一反应，反应结束后固液分离，得到第二复合材料；
将含硒化合物配制成溶液，得到含硒化合物溶液；将所得第二复合材料加入所述含硒化合物溶液中，在氧气气氛下分散，固液分离，得到第一复合材料；将水凝胶基体前驱体和光引发剂在水中溶解，得到水凝胶基体前驱体溶液；将所述第一复合材料加入所述水凝胶基体前驱体溶液中，分散，得到水凝胶制备材料。8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，满足以下条件中的至少一条：(a)所述a液中季铵盐表面活性剂的含量为5mg/ml，所述b液中聚乳酸-羟基乙酸共聚物的含量为7mg/ml且液体氟碳化合物的体积百分含量为0.9％，所述b液和所述a液的体积比为1:4；(b)所述超声乳化的功率为600w，总时间为10min，每超声2s停1s；(c)在所述超声乳化过程中将所产生的白色絮状物除去；(d)所述季铵盐表面活性剂包括溴代十六烷基三甲胺、十六烷基三甲基氯化铵中的至少一种，所述挥发性溶剂包括丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷中的至少一种；(e)进行所述第一反应时，所用表面包覆液体氟碳化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物、醇溶剂、氨水和硅源的比例为70mg：5ml：1.92ml：200μl，其中氨水浓度为25wt％；(f)所述第一反应的温度为20-35℃，所述第一反应的时间为24h；(g)所述醇溶剂包括异丙醇，所述硅源包括硅酸四乙酯；(h)所述含硒化合物溶液中含硒化合物含量为4.5mg/ml，所述第二复合材料和所述含硒化合物溶液的比例为20mg：10ml；(i)所述将所得第二复合材料加入所述含硒化合物溶液中，在氧气气氛下分散步骤中，在氧气气氛下分散时间为6h；(j)所述含硒化合物溶液中的溶剂为ph值为2的水；(k)所述水凝胶基体前驱体溶液中水凝胶基体前驱体的含量为100mg/ml，光引发剂含量为2.5mg/ml，所述第一复合材料的量为所述水凝胶基体前驱体溶液的量的0.1％-0.5％(w/v)；(l)所述水凝胶基体前驱体包括甲基丙烯酸酰化明胶，所述光引发剂包括苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂。9.一种水凝胶材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1所述的水凝胶制备材料进行光照，得到水凝胶材料。10.如权利要求1所述的水凝胶制备材料、如2～6任一项所述的水凝胶材料、如权利要求7～8任一项所述的制备方法制得的水凝胶制备材料或者如权利要求9所述的制备方法制得的水凝胶材料在制备超声辅助下促进骨修复的药物中的应用。

技术总结
本申请公开了一种水凝胶制备材料、水凝胶材料及其制备方法与应用，涉及生物医药技术领域。本申请水凝胶制备材料包括水凝胶基体前驱体、第一复合材料、光引发剂和水，其中第一复合材料包括第二复合材料和分布在该第二复合材料至少部分表面的含硒化合物，第二复合材料包括第三复合材料和包覆在该第三复合材料表面的二氧化硅，第三复合材料包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物和包覆在该聚乳酸-羟基乙酸共聚物表面的液体氟碳化合物，液体氟碳化合物中负载有氧气。本申请水凝胶制备材料凝胶化形成的水凝胶材料具有超声响应功能，在超声辅助下能够调控氧气和含硒化合物的长期释放，有效促进骨修复。复。复。


技术研发人员：刘红梅 陈填烽 许仁豪 尤媛媛 何燕妮 许智莉
受保护的技术使用者：广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院）
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/9/20