NK细胞的大量增殖培养方法与流程

nk细胞的大量增殖培养方法
技术领域
1.本发明涉及一种应用于免疫疗法的自然杀伤细胞(nk细胞)的大量增殖培养方法，更特别地，涉及一种大量增殖培养nk细胞的方法，其能够培养来自人外周血的淋巴细胞，从而有效地增殖和激活对治疗恶性肿瘤非常有效的nk细胞，同时又能显著提高nk细胞所占比例。


背景技术：

2.免疫疗法是一种从患者血液中提取对癌症治疗而言最重要的免疫细胞(例如自然杀伤细胞(nk细胞)、树突状细胞(dc)、b细胞和t细胞)，使用各种类型的刺激剂将这些细胞培养成对癌症有强烈作用的免疫细胞，并将其注射回患者体内的方法。由于使用了患者自己的血液，所以与常规化疗相比，副作用更少，施用方法更简单。因此，近年来，人们积极地研究免疫疗法。
3.在免疫疗法中被激活的免疫细胞中，特别地，nk细胞是大颗粒淋巴细胞(lgl)，是淋巴细胞的一种特征类型，其具有在不杀死大多数正常细胞的情况下杀死感染病毒和肿瘤细胞的优异能力。抗肿瘤作用是通过坏死或凋亡，或通过这两种作用机制同时发生来实现的。nk细胞对例如il-2、il-12和干扰素等细胞因子产生响应，从而增加细胞毒性、分泌和增殖功能。人类nk细胞的表型是cd16(fcγriii)和cd56，其中cd16和cd56在细胞表面缺乏trc(t细胞受体复合物)，被用作nk细胞的标志物。
4.已知这些nk细胞在人体的早期生物防御机制及肿瘤免疫中发挥重要的作用。
5.换句话说，nk细胞可以杀死特定的自体细胞、同种异体细胞，甚至异质癌细胞，而无需根据主要组织相容性复合体(mhc)的表达来获得免疫性的过程，并且能够更有效地杀死mhc 1类表达少或不表达的靶细胞。因此，nk细胞可以有效杀死多数不表达mhc的癌细胞，并且可以杀死一些病毒感染的细胞和细菌，例如伤寒沙门氏菌(salmonella typhi)。
6.这些nk细胞是负责先天免疫的重要细胞，与t细胞不同，它们在肝脏和骨髓中成熟。特别是，它们具有自主识别和杀死异常细胞(例如病毒感染细胞或肿瘤细胞)的功能。在过去十年中，利用患者自身免疫系统的肿瘤免疫疗法得到了稳步发展，使用该系统的“细胞疗法产品”也已经商业化。细胞疗法被定义为通过体外增殖和选择自体、同种异体或异种细胞的方法，通过一系列改变细胞生物学特性的作用而用于治疗、诊断和预防的药物产品(食品药品管理局通知2003-26号第2条)。
7.由于nk细胞是用于治疗难治性疾病(例如癌症)的细胞疗法，能够解决免疫排斥问题，并且提供为患者定制的细胞疗法，因此需要大量增殖nk细胞的方法和培养具有增强活性的nk细胞的方法。
8.然而，对杀死癌细胞具有优异效果的nk细胞，即使在正常人中也仅占外周血淋巴细胞的5％至15％，特别是在癌症患者中，这一比例降低到低于1％。因此，在没有单独的增殖过程的情况下，nk细胞在通过免疫疗法有效攻击癌细胞的方面存在局限性。
9.就其功能而言，nk细胞的分化、增殖和存活在很大程度上受到细胞因子的影响，先
前的几项研究表明，细胞因子例如il-2、il-12、il-15和il-18等增加细胞毒性和活化。目前，il-2等细胞因子和cd3等抗体被用于激活和增殖免疫细胞，特别是nk细胞。在目前的技术中，cd3抗体在免疫细胞的增殖中起着关键作用，但问题在于通过使用该抗体激活免疫细胞非常困难。
10.特别地，当从一开始就施加cd3抗体的强烈刺激时，未成熟的祖细胞就会成熟为t细胞。因此，目前普遍进行的的方法利用在开始时稍微刺激cd3抗体的方法，这在很大程度上取决于环境需求，例如个体之间的差异。因此，要获得大量增殖的活化nk细胞具有挑战性。
11.因此，需要开发新的培养基组合物和新的培养方法，其能够稳定地大量扩增和增殖nk细胞，同时能够消除应该将cd3抗体固定在烧瓶中并进行一段时间的反应的现有方法中困难。
12.因此，在考虑使用细胞因子的nk细胞的大量增殖培养方法时，本发明人分离和培养了淋巴细胞(淋巴细胞是来源于人外周血的免疫细胞)，并证实在包被有抗cd16抗体而非抗cd3抗体的培养器中，用各种细胞因子(特别是il-2和il-15)一起处理时，nk细胞大量增殖并活化，从而完成了本发明。


技术实现要素：

13.技术问题
14.本发明的目的是提供一种使用细胞因子的nk细胞的大量增殖培养方法。
15.技术方案
16.为了达到上述目的，本发明提供了一种nk细胞的培养方法，该方法包括：1)通过使用ficoll和离心从血液中分离含有免疫细胞的外周血单个核细胞(pbmc)沉淀；2)在抗cd16抗体包被的培养器中，在含有rpmi培养基、血浆、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30的培养基中培养分离的pbmc；3)将培养的pbmc在rpmi培养基、白蛋白、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30中传代培养(subculturing)；和4)在基于rpmi的培养基组合物中处理传代培养的pbmc，所述rpmi中添加了抗nkp30、抗nkp46和抗cd56抗体，以及选自由il-2、il-15和il-2+il-15组成的细胞因子组中的细胞因子以激活nk细胞。
17.在下文中，将详细描述本发明。
18.nk细胞是大颗粒淋巴细胞(lgl)(一种淋巴细胞)，具有在不杀死大多数正常细胞的情况下杀死感染病毒和肿瘤细胞的优异能力。因此，在活性细胞毒性t淋巴细胞大量产生之前，nk细胞在病毒感染或肿瘤发生的早期阶段发挥着重要作用。例如，当nk细胞接触靶细胞时，一些分子在靶细胞膜上形成孔隙并裂解细胞，而其他分子进入靶细胞并增加核dna的碎片，从而导致坏死、凋亡或程序性细胞死亡。
19.因此，nk细胞可以裂解特定的病毒感染细胞和癌细胞，而无需预先刺激它们。与通过表达tcr特异性地识别抗原的细胞毒性t淋巴细胞不同，nk细胞缺乏抗原特异性受体。
20.nk细胞表达与正常细胞的mhc i类结合的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(kir)。杀伤细胞抑制性受体在与mhc i类结合时，产生诱导特定转录因子抑制的细胞内信号。因此，nk细胞的激活和靶细胞的降解和破坏受到抑制。在病毒感染的细胞或癌细胞中，在其表面上mhc i类分子显著降低。因此，当这些细胞遇到nk细胞时，因为它们无法有效地与杀伤细胞
抑制性受体结合，它们就会暴露于nk细胞介导的细胞毒性，从而被裂解。
21.nk细胞可以来源于例如哺乳动物、人、猴、猪、马、牛、羊、狗、猫、小鼠或兔子。nk细胞可以从正常人或癌症患者获得。nk细胞可以从血液或外周血单个核细胞(pbmc)分离出来。分离血液的方法、由其分离pbmc的方法和由其分离nk细胞的方法可以通过已知的方法进行。
22.在本发明的nk细胞培养方法中，上述步骤4)的细胞因子优选用il-2+il-15处理，更优选用il-2 20ng/ml和il-15 50ng/ml处理。
23.另外，在本发明的nk细胞培养方法中，在上述步骤1)中分离免疫细胞时，优选通过用rbc裂解缓冲液处理免疫细胞沉淀来去除红细胞；并且上述步骤2)中的培养,当细胞数为3
×
107以下时，优选在包被有抗cd16抗体的t25烧瓶中进行，当细胞数为3
×
107以上时，优选在包被有抗cd16抗体的t75烧瓶中进行，其通过如下进行：添加rpmi 8ml、血浆2ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗cd56 5ng/ml、抗nkp465ng/ml和抗nkp30 5ng/ml，将pbmc沉淀悬浮在10ml rpmi中，并进一步添加混合物，在37℃和5％co2的培养器中培养3至4天。
24.此外，在本发明的nk细胞培养方法中，上述步骤3)的传代培养优选通过以下方式进行：在一次传代中，添加上述步骤2)的细胞培养悬液20ml、rpmi 72ml、白蛋白8ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml，在37℃和5％co2的培养器中培养3至5天；以及在二次传代中，添加一次传代培养悬液50ml、rpmi 180ml、白蛋白20ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml，在37℃和5％co2的培养器中培养5至7天。
25.有益效果
26.如上所述，本发明是在各种细胞因子中用il-2和il-15处理nk细胞时，能够有效激活细胞的最佳组合，并且当用il-2+il-15处理时，可以大量培养nk细胞，特别是，当用20ng/ml il-2和50ng/ml il-15处理时，培养是最高效的。由于使用这种方法时，可以促进对癌细胞的凋亡或杀伤能力，因此本发明可以用作预防或治疗癌症的有效的免疫细胞疗法。
附图说明
27.图1示出了对于实施例1分离的三种类型的免疫细胞pbmc样品中的每种，根据cd3抗体和cd56抗体的分布(nk细胞、nkt细胞和t细胞的分布情况)的流式细胞术结果。图1图形的x轴表示cd3(t淋巴细胞标志物)，y轴表示cd56(nk淋巴细胞标志物)。
28.图2是示出了根据nk细胞中细胞因子il-2和il-15的处理浓度，测量ifn-γ分泌量的结果的图。
29.图3是示出了在根据图2设定细胞因子il-2和il-15的最佳浓度并在设定浓度下处理其后，根据ifn-γ的分泌量测量活性的结果的图。
30.图4是示出了在不同条件下根据抗体和细胞因子il-2和il-15处理测量免疫细胞分布的结果的图。
31.图5是示出了在不同条件下根据抗体以及细胞因子il-2和il-15处理的免疫细胞的总细胞计数和细胞活力的图
32.图6是示出了在设定条件下培养nk细胞14天后测量的细胞数的图。
33.图7是示出了在设定条件下根据nk细胞大量培养组合物的facs分析试验的结果的
图。
具体实施方式
34.下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅用于更详细地解释本发明，并且对于本领域普通技术人员来说显而易见的是，根据本发明的要点，本发明的范围不受这些实施例的限制。
35.《实施例1》从血液中分离免疫细胞
36.为了从血液中分离出免疫细胞，首先准备了ficoll(ge healthcare)、pbs(welgene)、两个过滤管(greiner bio-one)、四个50ml管(vwr)、edta管(bd biosciences)和血细胞计数仪(marienfeld)。
37.将收集在无菌edta管中的50ml至100ml血液运送到准备室，并将血液分装到50ml管中。将15ml的ficoll各自放入两个过滤管中，并以2000rpm离心1分钟，将血液分装到含有ficoll的准备好的过滤管中。将混合物以2500rpm离心25分钟。在此，仅分离出外周血单个核细胞(pbmc)层，并将其收集到新的50ml管中，用pbs调节至体积为50ml，并以2000rpm离心10分钟。当沉淀中有许多rbc(红细胞)时，使用rbc裂解缓冲液。
38.离心后，去除上清液，用10ml rpmi(培养基)(hyclone)释放沉淀。然后，取适量的悬液用于细胞计数，用rpmi培养基将体积调整为50ml之后，将剩余的悬液以2000rpm离心10分钟。
39.此时，rbc裂解缓冲液如下所述。
40.每1
×
108至2
×
108个细胞添加1ml的rbc裂解缓冲液，轻轻敲击1分钟。向其中添加15ml至20ml rpmi(培养基)之后，以1500rpm(250
×
g至500
×
g)离心7分钟。当需要进一步去除rbc时，将上述过程重复2至3次。
41.《实施例2》样品外周血单个核细胞(pbmc)的免疫细胞分布
42.如上述实施例1所述，将40cc至60cc的外周血分装到两个含有ficoll的过滤管中，然后以2500rpm离心25分钟。从分层的外周血中仅分离出外周血单个核细胞(pbmc)，将其收集在新的50ml管中，用pbs洗涤。将通过弃去上清液得到的细胞与含有荧光物质的抗体(cd56-pe，cd3-bv421)进行反应，然后通过流式细胞仪进行分析。下表1和图1示出了根据所述抗体的免疫细胞分布结果。
43.[表1]
[0044][0045]
如上表1和图1所示，可以证实从血液中分离的pbmc免疫细胞的总体分布为nk细胞5％至6％，nkt细胞2％至7％，t细胞60％至80％。
[0046]
《实施例3》用于设定细胞因子il-2和il-15浓度的nk活性测量试验(测量ifn-γ)
[0047]
为了证实其作用并设定细胞因子il-2和il-15的浓度作为初步实验，在包被有抗
cd16抗体的烧瓶中，在含有rpmi 18ml、血浆2ml、抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗nkp30 5ng/ml的培养基中，用不同浓度的细胞因子il-2和il-15处理从上述实施例1的外周血中获得的单核细胞，培养7天，然后收获所有细胞。将收集的细胞以2000rpm离心5分钟，并将1ml上清液转移到一个新管中以测量细胞活性。通过使用ifn-γelisa试剂盒测量ifn-γ分泌量从而证实了细胞活性。
[0048]
图2示出了根据il-2和il-15的浓度处理的nk细胞中ifn-γ的分泌量。图3示出了在以根据图2所示结果设定的最佳il-2和il-15浓度处理后的ifn-γ分泌量的活性。
[0049]
具体地，图2示出了当il-2处理浓度为5、10、15、20或40(ng/ml)时，ifn-γ的分泌量逐渐增加，在20ng/ml时达到最高分泌量。在40ng/ml时，分泌量没有进一步增加。另一方面，当比较10、30、50和100(ng/ml)的il-15浓度时，在50ng/ml时，ifn-γ的分泌最高，而在100ng/ml时没有增加。两个实验的结果可以证实，就细胞活性而言，il-2为20ng/ml和il-15为50ng/ml是最有效的浓度。
[0050]
图3示出了用il-2+il-15处理的培养细胞中的ifn-γ分泌量显著高于单独用il-2和il-15处理的细胞的ifn-γ分泌量，可以证实细胞活性得以提高。
[0051]
《实施例4》根据il-2和il-15的处理，对于免疫细胞分布、细胞活力和细胞计数的测量
[0052]
作为nk细胞大量培养的初步实验，为了观察抗体和il-2和il-15的各种条件对于nk细胞的比例和细胞活力或细胞计数的影响，在包被有抗cd16抗体的烧瓶中，在含有18ml rpmi和2ml血浆的培养基中，在不同条件下处理根据上述实施例1从外周血中获得的单核细胞，然后培养7天，接着收获所有细胞以分析nk细胞的表面抗原。对于以下各组进行处理：在包被有抗cd16抗体的烧瓶中基本上含有18ml rpmi和2ml血浆的组，其中仅添加了抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)的组；在包被有抗cd16抗体的烧瓶中基本上含有18ml rpmi和2ml血浆的组，其中仅添加了细胞因子il-2(20ng/ml)和il-15(50ng/ml)；在包被有抗cd16抗体的烧瓶中基本上含有的组，其中仅添加了抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)+il-2(20ng/ml)；在包被有抗cd16抗体的烧瓶中基本上含有18ml rpmi和2ml血浆的组，其中仅添加了抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)+il-15(50ng/ml)的组；在包被有抗cd16抗体的烧瓶中基本上含有18ml rpmi和2ml血浆的组，其中添加了抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)+il-2(20ng/ml)+il-15(50ng/ml)的组；并进行培养7天。然后，将培养物以2000rpm离心10分钟，将通过去除上清液得到的细胞与含有荧光物质的抗体(cd56-pe、cd3-bv421)进行反应，并通过流式细胞术进行分析。在将通过离心获得的细胞悬浮在pbs中，取10μl细胞悬液并将其与10μl台盼蓝混合后，使用血细胞计数仪测量细胞数。下表2和图4显示了根据抗体的免疫细胞分布的结果，图5显示了总细胞计数和细胞活力。
[0053]
[表2]
[0054][0055]
如表2和图4所示，用细胞因子il-2+il-15处理的混合物中，nk细胞的比例高于仅用抗体处理的样品中的nk细胞的比例。然而，已经证实了用将抗体+il-2+il-15结合制备的混合物进行的处理能够有效地增加nk和nkt细胞。另外，如图5所示，证实了抗体+il-2+il-15混合物显示的增殖效果较其他对照组高2至4倍，活力也保持较高。
[0056]
《实施例5》设定浓度下的nk免疫细胞大量培养方法
[0057]
《5-1》抗cd16包被
[0058]
通过以下方式包被抗cd16：在t75烧瓶中混合10ml pbs和5ng/ml的抗cd16，将得到的混合物在室温下放置6小时，然后将其在冰箱中存放一夜(24小时)。包被好的培养瓶应在1周内使用，在使用前去除pbs，并在使用前用pbs清洗一次。由于烧瓶被包被，应注意不要使底部干燥。小心进行移液，不要直接向烧瓶底部移液。
[0059]
《5-2》免疫细胞培养
[0060]
首先，除了上述实施例5-1中准备的抗cd16包被的t75烧瓶之外，还准备了rpmi培养基、血浆、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46、抗nkp30。
[0061]
当细胞悬液中的细胞数为3
×
107以下时，将细胞在包被有抗cd16抗体的t25烧瓶中培养，而当细胞数为3
×
107以上时，在包被有抗cd16抗体的t75烧瓶中培养。具体地，将8ml rpmi、2ml血浆、20ng/ml il-2、50ng/ml il-15、5ng/ml抗cd56、5ng/ml抗nkp46和5ng/ml抗nkp30添加到包被好的t75烧瓶中，通过实施例1的方法，去除上清液，获得细胞。用10mlrpmi移液后，将细胞添加到烧瓶，根据细胞的情况在37℃和5％co2的培养器中培养3至4天。
[0062]
《5-3》传代培养
[0063]
对于传代培养，准备了t175烧瓶或t225烧瓶、rpmi培养基、白蛋白、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30。
[0064]
《5-3-1》一次传代培养(从t75烧瓶到t175烧瓶)的传代培养
[0065]
将上述实施例5-2的在t75烧瓶中培养的免疫细胞传代培养到t175烧瓶中。具体来说，用刮刀刮t75烧瓶以分离附着在底部的细胞，并通过移液器释放聚集的细胞。将制备好的20ml细胞悬液添加到含有rpmi 72ml、白蛋白8ml、il-2 20ng/ml、il-1550ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml的新t175烧瓶中，并与培养基混合。然后，根据细胞的情况，在37℃和5％co2的培养器中培养3至5天。
[0066]
《5-3-2》二次传代培养(从t175烧瓶到两个t225烧瓶)的传代培养
[0067]
从一个t175烧瓶到两个t225烧瓶进行传代培养。具体来说，用刮刀刮t175烧瓶以分离附着在底部的细胞，并通过移液器释放聚集的细胞。将制备好的100ml细胞悬液添加到
两个新的烧瓶中的每一个中，每个烧瓶50ml，烧瓶中含有rpmi 180ml，白蛋白20ml，il-2 20ng/ml，il-15 50ng/ml，将细胞悬液与培养基混合。然后，根据细胞的情况，在37℃和5％co2的培养器中培养5至7天。此时，根据细胞条件添加培养基，注意对于每个t225烧瓶，不要超过400ml的最终体积。
[0068]
《实施例6》在设定的浓度下培养nk细胞14天后,测量细胞数目的试验
[0069]
研究了用于大规模增殖的组合物是否可以允许nk细胞的大量增殖，并且即使在培养14天后也增加分布。具体而言，将通过上述实施例1的方法分离的5
×
107个淋巴细胞添加到每个样品的培养基中，另外用设定的组合物进行处理，即rpmi+白蛋白+抗体(抗cd56 5ng/ml，抗nkp46 5ng/ml，抗nkp30 5ng/ml)+il-2(20ng/ml)+il-15(50ng/ml)，然后培养14天。另外，对照组是仅用rpmi+白蛋白+细胞因子il-2(20ng/ml)+il-15(50ng/ml)处理的组和仅用rpmi+白蛋白+抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)处理的组。此外，根据细胞数量进行传代培养，并通过添加培养基培养14天。对于细胞计数，每天收获培养细胞，取10μl悬浮细胞并与10μl台盼蓝混合，然后用血细胞计数仪进行测量。图6示出了结果。如图6所示，当在制备的培养基中培养14天时，细胞增殖到大于2
×
109个细胞。
[0070]
《实施例7》根据设定浓度下nk细胞大量培养的组合物进行的facs分析试验
[0071]
在关于根据实施例5-3-2培养的淋巴细胞免疫细胞的分布实验(facs)中，用rpmi+白蛋白+抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)+il-2(20ng/ml)+il-15(50ng/ml)处理细胞并培养14天，对照组仅用rpmi+白蛋白+细胞因子il-2(20ng/ml)+il-15(50ng/ml)或仅用rpmi+白蛋白+抗体(抗cd56 5ng/ml、抗nkp465ng/ml、抗nkp30 5ng/ml)处理，各对照组根据细胞数量传代培养14天以进行比较。将通过2000rpm离心10分钟并去除上清液得到的细胞与含有荧光物质的抗体(cd56-pe，cd3-bv421)进行反应，使用流式细胞仪进行分析。结果如下表3和图7所示。
[0072]
[表3]
[0073][0074]
如上表3和图7所示，结果显示，即使在大量培养14天后，为大量增殖设定的组合物包含85％的nk细胞和nkt细胞以及8.5％的t细胞，证实了与其他对照组相比，nk细胞的比例明显更高。
[0075]
以上述本发明的优选实施例详细描述的本发明不限于上述实施例，本领域普通技术人员可以在本发明的技术原理范围内进行各种修改。

技术特征：
1.一种nk细胞的培养方法，所述方法包括：1)通过使用ficoll和离心从血液中分离含有免疫细胞的外周血单个核细胞(pbmc)沉淀；2)在抗cd16抗体包被的培养器中，在含有rpmi培养基、血浆、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30的培养基中培养分离的pbmc；3)将培养的pbmc在rpmi培养基、白蛋白、il-2、il-15、抗cd56、抗nkp46和抗nkp30中传代培养；和4)在基于rpmi的培养基组合物中处理传代培养的pbmc以激活nk细胞，所述基于rpmi的培养基组合物中添加有抗nkp30、抗nkp46和抗cd56抗体，以及选自由il-2、il-15和il-2+il-15组成的细胞因子组的细胞因子。2.如权利要求1所述的nk细胞培养方法，其中，所述步骤4)的细胞因子是用il-2+il-15处理。3.如权利要求2所述的nk细胞培养方法，其中所述步骤4)的细胞因子是用20ng/ml il-2和50ng/ml il-15处理。4.如权利要求1所述的nk细胞培养方法，其中，在步骤1)中分离免疫细胞时，通过用rbc裂解缓冲液处理免疫细胞沉淀来去除红细胞。5.如权利要求1所述的nk细胞培养方法，其中，所述步骤2)中的培养，当细胞数为3
×
107以下时，在包被有抗cd16抗体的t25烧瓶中，当细胞数为3
×
107以上时，在包被有抗cd16抗体的t75烧瓶中，其通过以下进行：添加rpmi 8ml、血浆2ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗cd56 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗nkp305ng/ml，将pbmc沉淀悬浮在10ml rpmi中，并进一步添加混合物，在37℃和5％co2的培养器中培养3至4天。6.如权利要求1所述的nk细胞培养方法，其中，所述步骤3)的传代培养优选通过以下进行：在一次传代中，添加步骤2)的细胞培养悬液20ml、rpmi 72ml、白蛋白8ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml，在37℃和5％co2的培养器中培养3至5天；以及在二次传代中，添加一次传代培养悬液50ml、rpmi 180ml、白蛋白20ml、il-2 20ng/ml、il-15 50ng/ml、抗nkp30 5ng/ml、抗nkp46 5ng/ml和抗cd56 5ng/ml，在37℃和5％co2的培养器中培养5至7天。

技术总结
本发明涉及一种NK细胞的培养方法，更具体而言，涉及一种NK细胞的培养方法，该方法包括：1)从血液中分离外周血单个核细胞(PBMC)的免疫细胞的沉淀；2)在抗CD16抗体包被的培养器中，在RPMI培养基中培养PBMC；3)将PBMC传代培养；和4)用由IL-2、IL-15和IL-2+IL-15组成的细胞因子组的细胞因子处理PBMC而激活NK细胞。本发明是一种最佳组合，当用各种细胞因子中的IL-2和IL-15处理NK细胞时，可以有效地激活细胞，并且当用IL-2+IL-15处理时，NK细胞可以大量培养。另外，当使用该NK细胞时，可以促进对癌细胞的凋亡或杀伤能力，因此该NK细胞可以用作预防或治疗癌症的有效的免疫细胞治疗剂。预防或治疗癌症的有效的免疫细胞治疗剂。预防或治疗癌症的有效的免疫细胞治疗剂。


技术研发人员：D
受保护的技术使用者：D
技术研发日：2021.05.10
技术公布日：2023/9/13