富含多胺的小麦胚芽提取物的应用的制作方法

1.本发明涉及富含多胺的小麦胚芽提取物的新应用，具体涉及富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于皮肤修复、皮肤美白以及延缓皮肤衰老的组合物中的应用。


背景技术：

2.小麦胚芽占小麦籽粒的3％左右，胚芽中含有15～40％的优质蛋白质、10～20％的油脂及食用纤维、矿物质、维生素等有益于人体健康的成分，被营养学家誉为“人类天然营养库”。在国外小麦胚芽被广泛应用于各种营养品、保健品、疗效食品中。小麦胚芽蛋白中的醇溶蛋白是制备药物包衣、药物缓释剂、洗发水爽滑剂、食品保鲜涂膜等的主要原料之一，也用于制备抗氧化肽、高f值寡肽、降压肽及脂肪替代品等。小麦胚芽肽及小麦胚芽抗氧化、抗衰老液含谷胱甘肽等多种小分子短肽、氨基酸、维生素及矿质元素，营养价值极高，可用于保健品、食品及日化行业做营养强化剂及抗衰老、抗疲劳、抗氧化剂、毛发、皮肤等的营养修复剂。因此，近年来开发利用小麦胚芽资源，成为国内外食品、生化、营养等行业的研究热点。
3.目前对于小麦胚芽的利用，主要集中在三个方面：第一，大部分小麦胚芽被混入麸皮中当作饲料来用，造成资源的极大浪费；第二，直接加到食品中，比如麦胚烘烤食品、汤料、休闲小食品等；第三，提取小麦胚油，脱脂后的麦胚又被用作饲料廉价出售。小麦胚芽没有得到合理利用，主要原因是对小麦胚芽的研究开发尚停留在营养源水平上，对于其保健功能研究不够深入。目前尚未见将富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于皮肤修复、皮肤美白以及延缓皮肤衰老的组合物中的应用中的文献报道。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明的目的在于提供富含多胺的小麦胚芽提取物的新用途，经研究发现，本发明制备得到的富含多胺的小麦胚芽提取物具有促进皮肤修复和愈合作用及美白活性、且能够延缓皮肤衰老，促进皮肤胶原蛋白生成，提升皮肤透明质酸合成，为小麦胚芽的研究提供了新的方向。
5.本发明第一方面提供一种富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于皮肤修复的组合物中的应用。
6.本发明第二方面提供一种富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于皮肤美白的组合物中的应用。
7.本发明第三方面提供一种富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于延缓皮肤衰老的组合物中的应用。
8.优选地，所述小麦胚芽提取物中含有亚精胺和/或精胺。
9.本发明提供了一种所述小麦胚芽提取物的制备方法，包括如下步骤：
10.步骤s1，将小麦胚芽粉末采用含0.6-1％ naoh的60-80％乙醇溶液浸泡，浸泡后过滤收集提取上清作为浸泡液；
11.步骤s2，合并浸泡液作为提取液，调节提取液ph至5-7，搅拌、静置，得到固液混合物；
12.步骤s3，对固液混合物进行离心分离，收集富含多胺的固相；
13.步骤s4，对富含多胺的固相进行干燥，获得富含多胺的小麦胚芽提取物。
14.优选地，步骤s1中，小麦胚芽粉末与乙醇溶液的体积比为1:5-10；浸泡温度为25℃～40℃，浸泡次数1-3次。
15.上述方法采用碱性醇溶液进行提取，一方面碱性溶液可以使得小麦胚芽原料组织膨胀，同时可以避免大量淀粉、蛋白的溶出，从而有利于多胺类物质游离释放，对多胺类成分起到更有效的溶解和提取的作用。通过步骤s1的处理，多胺被释放至浸泡液中；经过步骤s2的酸化后多胺以盐的形式从浸泡液中沉淀出来，然后再通过固液分离和干燥处理，即可得到富含多胺的小麦胚芽提取物。
16.本发明还提供了另外一种小麦胚芽提取物的制备方法，包括如下步骤：
17.(1)将小麦胚芽原料采用含0.8-1.2wt％vc(抗坏血酸)的ph3-4稀酸溶液进行浸泡；
18.(2)将浸泡后的小麦胚芽原料用ph3-4稀酸溶液渗漉，收集渗漉液；
19.(3)将渗漉液通过有机膜和/或无机膜进行过滤，收集清液；
20.(4)将清液再过2500-3500dal超滤膜，收集截留液；
21.(5)将截留液煮沸灭菌、干燥，获得含多胺的小麦胚芽提取物。
22.优选地，步骤(3)中，所述有机膜为抽滤袋，无机膜为陶瓷膜。
23.优选地，步骤(1)中稀酸溶液的用量为原料用量的3-10倍；
24.优选地，步骤(5)中干燥为喷雾干燥，喷雾干燥器进风温度控制在185-215℃，出风温度控制在90-110℃。
25.本方法采用含有抗坏血酸(vc)的酸性溶液对原料进行浸泡，再采用酸性溶液对浸泡过的原料进行处理，去除所得处理液中的杂质并截留目标成分制备得到含多胺的小麦胚芽提取物，该制备工艺对多胺的提取率高。
26.本发明所述组合物的剂型为液体制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、乳液或混悬液可以采用本发明常规方法制备得到。
27.本发明与现有技术相比，具有如下优异效果：
28.本发明方法制备的富含多胺的小麦胚芽提取物可以制备用于皮肤修复、皮肤美白以及延缓皮肤衰老的组合物，结果显示，一方面，富含多胺的小麦胚芽提取物能显著增加细胞迁移能力，具有促进皮肤修复和愈合作用，且能显著促进皮肤成纤维细胞增殖，具有促进细胞增殖活性的作用；另一方面，富含多胺的小麦胚芽提取物可显著抑制b16细胞黑素合成量，具有美白活性；再一方面，富含多胺的小麦胚芽提取物能够延缓皮肤衰老，促进皮肤胶原蛋白生成，提升皮肤透明质酸合成。这表明本发明制备得到的富含多胺的小麦胚芽提取物可以制备用于皮肤修复、皮肤美白以及延缓皮肤衰老的保健品、食品、化妆品或药品中，为小麦胚芽的开发利用提供了新途径。
附图说明
29.图1为小麦胚芽提取物的制备工艺图；
30.图2为da1不同浓度对细胞愈合的促进情况；
31.图3为da2不同浓度对细胞愈合的促进情况；
32.图4为小麦胚芽提取物da1、da2对细胞存活的影响；
33.图5为小麦胚芽提取物da1、da2对细胞生长的影响；
34.图6为不同浓度的da1对细胞周期的影响；
35.图7为不同浓度的da1影响下处于分裂增殖期的细胞占比情况；
36.图8为rt-pcr检测小麦胚芽提取物da1对has1、has2、has3的影响；
37.图9为rt-pcr检测小麦胚芽提取物da2对has1、has2、has3的影响。
具体实施方式
38.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
39.原料：小麦胚芽(亚精胺含量0.0339％、精胺含量0.0093％)，市购。
40.实施例1：富含多胺的小麦胚芽提取物的制备方法
41.步骤s1：将小麦胚芽粉末过60目网筛，采用含1％ naoh的80％乙醇溶液在40℃下浸泡，小麦胚芽粉末与乙醇溶液的体积比为1:5，浸泡后过滤收集提取上清作为浸泡液，浸泡次数为1-3次；
42.步骤s2：合并浸泡液作为提取液，调节提取液ph至5-7，搅拌10min、静置10min，得到固液混合物；
43.步骤s3：对固液混合物进行离心分离，收集富含多胺的固相；
44.步骤s4：对富含多胺的固相40℃下热风干燥，获得富含多胺的小麦胚芽提取物da1。制备工艺的优化过程：
45.1.1naoh的添加对于提取效果的影响
46.表1：naoh的添加对于提取效果的影响
[0047][0048]
由上表可以看出，当在乙醇溶液中添加了naoh之后，能够显著的提高提取物中亚精胺和精氨含量，在仅添加乙醇的情况下，亚精胺的提取率为添加了naoh的20％左右，但是如果仅添加naoh发现浸泡液过于粘稠，无法提取过滤获得提取液。
[0049]
1.2不同浓度naoh的添加对于提取效果的影响
[0050]
调整naoh的浓度，其余同实施例1，hplc检测提取液中亚精胺和精胺的含量，具体见表2。
[0051]
表2naoh的浓度对于提取效果的影响
[0052][0053]
由上表可以看出，随着碱醇溶液中氢氧化钠含量的增加，精胺和亚精胺的溶出率增大；但是当氢氧化钠含量超过1％之后，亚精胺和精胺的溶出率不再增加，甚至亚精胺的溶出率有所减小，这可能是由于碱性过大导致亚精胺稳定性降低，有部分亚精胺分解。
[0054]
1.3不同浓度乙醇对提取效果的影响
[0055]
调整乙醇的浓度，其余同实施例1，hplc检测提取液中亚精胺和精胺的含量，具体见表3。
[0056]
表3乙醇浓度对提取效果的影响
[0057][0058]
由上表可以看出，乙醇的浓度在40-80％的范围内，对于亚精胺的提取溶出率影响不大，但是后续测试中发现乙醇溶液中水含量太高的话，会导致后续亚精胺的沉淀比较困难，因此，选择80％的乙醇浓度是一个较优的选择。
[0059]
1.4ph值对提取效果的影响
[0060]
以提取组1为例，向提取液中添加柠檬酸酸化至目标ph值，并搅拌10min，然后静置10min，得到固液混合物。对该固液混合物进行过滤处理，得到分离的滤液和沉淀。在40℃下热风干燥所得沉淀，获得富含多胺的小麦胚芽提取物。各实施例的目标ph值记录在表4中。
[0061]
采用gb5009.208—2016规定的方法对固液混合物分离得到的滤液和干燥后的沉淀中的精胺和亚精胺含量进行检测，并以沉淀中精胺和亚精胺的重量计算精胺和亚精胺的收率，计算公式为收率＝干燥后目标物质总量/沉淀前目标物质的总量，检测结果记录在表4中。
[0062]
表4ph值对提取效果的影响
[0063][0064]
由上表看出，ph值越低，精胺和亚精胺沉淀率越高即二者的收率越高。但是ph值越低，随着精胺和亚精胺沉淀的杂质也越多，因此所得沉淀物总量越多，导致精胺和亚精胺的纯度较低。综上，当酸化至ph值为4～7之间，可以将精胺和亚精胺很好地沉淀出来。进一步的测试了提取2、提取组3在不同酸化ph值条件下的沉淀收集情况，其与表4中展现的结果有同样的趋势，并且在40％～80％的浓度范围内乙醇的浓度越高，越有利于精胺和亚精胺的沉淀。因此，综合考虑杂质沉淀以及目标产物的沉淀情况，选择ph值在5-7之间更有利于提高产物的纯度。
[0065]
实施例2：富含多胺的小麦胚芽提取物的制备方法
[0066]
工艺流程图参见图1：
[0067]
(1)将小麦胚芽原料采用原料量8倍量的含1wt％抗坏血酸(vc)的ph3稀盐酸溶液进行浸泡1h；
[0068]
(2)将浸泡后的小麦胚芽原料用原料量8倍量的ph3稀盐酸溶液渗漉，收集渗漉液；
[0069]
(3)将渗漉液先通过1μm抽滤袋进行过滤，再将滤液转移至0.1μm的陶瓷膜进行过滤，期间补水两次，每次补1倍渗漉液体积的纯化水，收集清液；
[0070]
(4)将清液再过3500dal超滤膜，收集截留液；
[0071]
(5)将截留液煮沸灭菌，喷雾干燥，喷雾干燥器进风温度控制在185-215℃，出风温度控制在90-110℃，获得富含多胺的小麦胚芽提取物da2。
[0072]
制备工艺的优化过程：
[0073]
2.1vc的添加对于提取效果的影响
[0074]
表5：vc的添加对于提取效果的影响
[0075]
组别亚精胺含量％亚精胺相对收率％含1wt％vc0.119894.6**不含vc，其他同实施例20.065255.1
[0076]
hplc检测采用gb5009.208—2016规定的方法。由表5可知，添加vc有助于亚精胺提取过程中亚精胺的释放和稳定，与不添加vc相比，相对收率由55.1％提升到94.6％。
[0077]
2.2vc添加量对于提取效果的影响
[0078]
调整vc的添加量，其他步骤同实施例2，hplc检测提取物中亚精胺的含量，具体见表6。
[0079]
表6不同vc添加量对于亚精胺提取的影响
[0080][0081][0082]
由表6可知，vc添加量在0.8％以下的条件下，对于亚精胺提取率的提升不大，在1.2％以上时，效果不再提升，因此在0.8％-1.2％是一个较为合适的范围。
[0083]
2.3ph值对于提取植物中亚精胺的影响
[0084]
调整料液ph值，其他步骤同实施例2，hplc检测提取物中亚精胺的含量和得率，具体见表7。
[0085]
表7不同ph值对于亚精胺提取的影响
[0086]
料液ph值干燥成品中亚精胺含量％相对收率％ph＝10.03979.13ph＝20.05282.41ph＝30.11596.22ph＝40.11394.00ph＝50.10183.32ph＝60.08259.83ph＝70.06919.02ph＝80.0338.43ph＝90.0245.67
[0087]
其中，相对收率＝(终产品中目标组分的总量/原料中目标组分的总量)
×
100％。
[0088]
由表7可见，提取过程中ph值呈从高到低的变化过程，对应亚精胺的提取相对收率及含量呈先升高再降低的变化过程，在ph值1-6都适合用于亚精胺的提取，在ph值为3、4的条件下，固形物中亚精胺的含量以及亚精胺的收率都达到最高值，可以优选使用ph＝3-4的溶剂进行提取。
[0089]
2.4超滤膜截留分子量的选择
[0090]
利用不同分子量的超滤膜截留步骤(3)所获得的清液中的目标成分，hplc检测提取物中亚精胺的含量和亚精胺得率，具体见表8。
[0091]
表8不同截留分子量的超滤膜对于亚精胺提取的影响
[0092][0093][0094]
如上表8所示：
[0095]
(1)100000dal、50000dal、10000dal超滤膜在分离亚精胺过程中，因膜孔径较大，固形物以及亚精胺全部透过，基本没有纯化效果。
[0096]
(2)5000dal超滤膜在分离过程中，膜浓液中亚精胺含量可以提升，但是在其清液中有亚精胺透过，且透过比例在30％以上，造成目标产品部分的收率偏低。
[0097]
(3)3500dal、2500dal超滤膜在分离亚精胺过程中，亚精胺透过很少(10％以内)，且膜浓液部分含量提升较高，有富集作用，同时截留液(浓液)作为目标产物部分，亚精胺收率高，可省去纳滤浓缩工序，直接进行干燥。
[0098]
(4)1000dal、500dal超滤膜在分离亚精胺过程中，虽然亚精胺并没有透过膜，但是固形物杂质透过同样也较少，所以并未起到明显的纯化富集效果。
[0099]
综上所述，最优选择2500-3500dal间的超滤膜，其亚精胺收率可达90％以上。
[0100]
实施例3：小麦胚芽提取物的功效测试：
[0101]
3.1小麦胚芽提取物促进皮肤的修复和愈合
[0102]
细胞迁移指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的刺激后而产生的移动。细胞迁移能力增加，表明具有促进创伤修复作用。
[0103]
本试验例通过细胞划痕愈合速度，计算划痕愈合率评价受试物的修护作用。
[0104]
1)细胞系：hacat(人类永生化角质细胞，源自美国标准生物品收藏中心(atcc))；
[0105]
2)培养基：dmem高糖培养基；
[0106]
3)培养条件：37℃，5％ co，饱和湿度条件下培养；
[0107]
4)溶液及对照：空白对照(control)：细胞培养基；测试样品(ta)：采用培养液依次稀释至所需测试浓度。
[0108]
将细胞接种于24孔板，细胞量以隔日能够达融合状态为度。24小时贴壁培养后，采用塑料吸头(20μl)于培养板底部划直痕，保证力度、角度及粗细一致，用pbs洗去漂浮细胞，重新添加新培养液(含1％胎牛血清)，空白对照组细胞不采取任何干预，样品组加入含有受试物的培养液。选取划痕粗细一致且细胞密度相同的部位，记录坐标，并于不同时间点进行拍照观察，比较各组划痕愈合速度；利用imagej软件对各组划痕愈合面积百分比进行测量。
[0109]
划痕愈合率/％＝(0h划痕面积－各时间点划痕面积)/0h划痕面积
×
100％。
[0110]
试验结果：da1和da2不同浓度对细胞愈合的促进情如图1-2及表9所示。
[0111]
表9不同浓度的da1和da2对细胞愈合的促进情况
[0112][0113]
划痕愈合实验结果所示，不同工艺的小麦胚芽提取物在各试验浓度的划痕愈合率明显高于空白对照组(p＜0.05)，结果表明1.25～5μg/ml的小麦胚芽提取物能显著促进细胞迁移。3.2小麦胚芽提取物提升皮肤细胞活力：
[0114]
以受试物(小麦胚芽提取物)作用于皮肤成纤维细胞，通过检测细胞存活率、细胞生长曲线和细胞周期，评价是否能提高细胞活力。
[0115]
细胞系：hsf(人皮肤成纤维细胞)、培养基：含10％ fbs的dmem/f12培养基(完全培养基)、培养条件：37℃，5％ co，饱和湿度条件下培养、溶液及对照：空白对照(control)：细胞培养基；测试样品(ta)：采用培养液依次稀释至所需测试浓度、mtt、细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物。试验中分别通过mtt法检测细胞存活率、细胞计数法绘制细胞生长曲线、流式细胞术检测细胞周期(相关具体试验方法可参考细胞学实验指南以及供应商的试剂盒使用说明)。
[0116]
表10小麦胚芽提取物da1、da2对细胞存活的影响
[0117][0118]
mtt检测显示(如图4和表10)，与空白对照组相比较，2.5～10.0mg/ml不同工艺小麦胚芽提取物能显著促进皮肤成纤维细胞增殖(p《0.01)，具有促进细胞增殖活性的作用。
[0119]
根据培养时间和细胞计数的结果得到细胞生长曲线，如图5所示。细胞初始生长缓慢，为延滞期，两到三天之后细胞进入对数生长期。与空白对照组相比，2.5～10ug/ml不同工艺小麦提取物能促进皮肤成纤维细胞生长。
[0120]
基于上述结果，进一步检测了细胞添加受试物小麦胚芽提取物da1后的细胞周期情况，结果如图6-7和表11所示，随着浓度的增加处于g2/m+s期的细胞显著增加，说明细胞分裂活跃，增殖活性较高。
[0121]
表11不同浓度的da1对细胞周期的影响
[0122][0123]
3.3小麦胚芽提取物黑色素合成抑制功效检测方法：
[0124]
实验原理：通过测定受试物作用于黑素细胞后黑素合成量的变化，评价受试物的美白活性。
[0125]
实验试剂：细胞系：b16(小鼠黑素瘤细胞)、培养基：含10％ fbs的dmem高糖培养基(完全培养基)、培养条件：37℃，5％ co，饱和湿度条件下培养、溶液及对照：阴性对照(ctrl)：细胞培养基、阳性对照(pc)：曲酸(50μg/ml)；
[0126]
测试样品(ta)：采用培养液依次稀释至所需测试浓度、曲酸(kojic acid)、l-dopa购自上海源叶公司；
[0127]
实验方法：
[0128]
细胞铺板：将复活培养后细胞用新鲜完全培养基重悬，以2500个/孔接种至6孔细胞培养板，贴壁培养24h。弃旧培养基，将配制好的阴性对照、受试样品组和阳性对照组溶液分别加入6孔细胞培养板，继续培养48小时。
[0129]
去旧培养基，分别更换含有阴性对照、受试样品组和阳性对照组的新培养基，继续培养48小时。重复以上操作，然后继续培养48-72h(让细胞融合率达90％以上)。
[0130]
黑色素含量检测：pbs洗涤细胞2次，加入0.25％胰酶消化细胞，计数，将每个组的细胞量调整为一致，4000rpm离心收集细胞沉淀于离心管。每管加入200μl黑素提取液，80℃水浴加热1小时。冷却后吸取提取液移入96孔板，酶标仪检测各孔405nm处吸光度。
[0131]
按公式(1)计算黑素合成抑制率。
[0132][0133]
式中：t——受试样品孔吸光度；
[0134]
c——阴性对照组吸光度的3次平均值；
[0135]
c0——黑素提取液本底吸光度。
[0136]
细胞内黑素合成量测定结果如表12。与阴性对照组相比，阳性对照组(kojic acid，50μg/ml)黑素合成抑制率具有显著差异(p＜0.05)，c.v值≤20％，实验体系有效。与阴性对照组相比，各试验浓度的黑素合成抑制率均具有显著差异(p＜0.05)，结果表明0.25～1.00mg/ml小麦胚芽提取物可显著抑制b16细胞黑素合成量。
[0137]
表12细胞内黑素合成量测定结果
[0138][0139][0140]
3.4成纤维细胞胶原蛋白生成检测方法：
[0141]
实验原理：通过测定受试物给药后，分析人皮肤成纤维细胞ⅰ型胶原蛋白含量的上调率，评价受试物在促进胶原蛋白合成方面是否具有功效。
[0142]
实验试剂：
[0143]
细胞系：hsf(人皮肤成纤维细胞)；
[0144]
培养基：含10％ fbs的dmem/f12培养基(完全培养基)；
[0145]
溶液及对照：空白对照(control)：细胞培养基、测试样品(ta)：采用培养液依次稀释至所需测试浓度、tgf-β1购自peprotech公司，胶原蛋白i(collagen i)elisa检测试剂盒购自武汉博士德生物公司。
[0146]
将细胞复苏培养后，用培养基稀释细胞至接种密度后(接种后24h融合度达到45％～60％)接种至96孔板，每孔液量为200μl。接种结束后，放置于co培养箱中培养24h
±
2h。弃掉96孔板中的培养基，开展给药操作。受试物孔中加入含有受试物的培养基，阳性对照孔中加入含有阳性对照的培养基，空白/溶剂对照孔中加入正常的细胞培养基，每孔200μl。给药完毕后将96孔板放置在co培养箱中培养48h
±
2h。孵育培养结束后，收集细胞培养上清液于无菌离心管，置于-80℃超低温冰箱冷冻保存。根据人ⅰ型胶原酶联免疫试剂盒的使用说明书检测i型胶原蛋白含量。
[0147]
统计分析：
[0148]
使用curveexpert 1.4标准曲线分析软件，以标准品的浓度与od450值计算出标准曲线的回归方程式，将样本的od450值代入方程式，计算样本的i型胶原蛋白含量。取各组3个复孔的平均值作为最终的i型胶原蛋白结果。依据公式(1)计算ⅰ型胶原蛋白上调率。
[0149]
上调率(％)＝(t/c-1)
×
100％
···········
(1)
[0150]
式中：t——受试物i型胶原蛋白含量平均值；
[0151]
c——空白/溶剂对照i型胶原蛋白含量平均值。
[0152]
每批次试验均须设置阳性对照，与空白/溶剂对照相比，阳性对照i型胶原蛋白含量上调率需≥20％，则认为试验系统有效。以酶标仪测得的各组复孔间光密度的标准差(standard deviation，sd)计算变异系数(coefficient of variation，c.v)，c.v值≤20％，则认为试验平行性有效。
[0153]
表13collagen i检测结果
[0154][0155]
collagen i检测结果如表13，与control组相比，阳性对照(tgf-β1)collagen i含量上调率为(26.64
±
8.78)％≥20％，试验系统有效。各组复孔间光密度的c.v值≤20％，试验平行性有效。与control组相比，2.5μg/ml小麦胚芽提取物da1对细胞collagen i含量上调没有显著作用(p＞0.05)，5.0μg/ml、10.0μg/ml小麦胚芽提取物da1对collagen i含量上调率分别为(14.68
±
2.35)％和(19.76
±
5.84)％，统计分析具有显著性差异(p＜0.05)；结
果表明，小麦胚芽提取物da1能促进人皮肤成纤维细胞collagen i含量上调。2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml小麦胚芽提取物da2对collagen i含量上调率分别为(13.48
±
2.51)％、(17.98
±
3.65)％和(21.46
±
6.34)％，统计分析具有显著性差异(p＜0.05)；结果表明，小麦胚芽提取物da2能促进人皮肤成纤维细胞collagen i含量上调。
[0156]
3.5透明质酸合成酶表达量检测方法：
[0157]
实验原理：人类透明质酸合成酶(hyaluronan synthase，has)是一类在透明质酸(hyaluronic acid，ha)合成过程中发挥重要作用的酶，可分为has1、has2、has3。本试验通过测定受试物给药后，人皮肤成纤维细胞中透明质酸合成酶基因表达的变化，评价受试物对透明质酸合成的影响。
[0158]
细胞系：hsf(人皮肤成纤维细胞)；
[0159]
培养基：含10％ fbs的dmem/f12培养基(完全培养基)；
[0160]
溶液及对照：空白对照(control)：细胞培养基、测试样品(ta)：采用培养液依次稀释至所需测试浓度、rna提取试剂盒、cdna反转录合成试剂盒购自天根生化公司，sybr green pro taq hs、预混型qpcr试剂盒购自艾科瑞生物公司；
[0161]
用细胞培养基稀释细胞至接种密度后(接种后24h融合度达到45％～60％)接种至12孔板，每孔液量为1000μl。接种结束后，放置于co培养箱中培养24h
±
2h。弃掉原培养基，开展给药操作。受试物孔中加入含有受试物的培养基，空白/溶剂对照孔中加入正常的细胞培养基，每孔1000μl。给药完毕后将12孔板放置在co培养箱中培养48h
±
2h。孵育培养结束后，用pbs洗涤1～2次，收集细胞提取mrna，定量，反转录获得cdna进行real-time pcr反应。
[0162]
采用2－
△△
ct法分析基因相对表达量。以每个cdna样本，每个基因的3个重复设置的ct平均值作为扩增结果，以gapdh基因扩增量作为内参基因，计算基因的循环阈值
△
ct＝ct基因-ctgapdh，基因相对表达量
△△
ct＝
△
ct受试物
‑△
ct空白对照，以2-δδct分析计算受试物组与空白对照组表达量的比值。
[0163]
统计分析软件应用graphpad prism 8.0，多组间比较行单因素方差分析，以p＜0.05为统计学有显著性差异。
[0164]
rt-pcr检测小麦胚芽提取物da1对has1、has2、has3的影响rt-pcr检测结果如图8-9所示，与空白对照组相比，2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml小麦胚芽提取物对人皮肤成纤维细胞透明质酸合成酶has2表达有显著促进作用(p＜0.05)。小麦胚芽提取物各测试浓度对人皮肤成纤维细胞透明质酸合成酶has1、has3的表达没有明显促进作用。

技术特征：
1.一种富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于皮肤修复的组合物中的应用。2.一种富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于皮肤美白的组合物中的应用。3.一种富含多胺的小麦胚芽提取物在制备用于延缓皮肤衰老的组合物中的应用。4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述小麦胚芽提取物中含有亚精胺和/或精胺。5.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述小麦胚芽提取物的制备方法，包括如下步骤：步骤s1，将小麦胚芽粉末采用含0.6-1% naoh的60-80%乙醇溶液浸泡，浸泡后过滤收集提取上清作为浸泡液；步骤s2，合并浸泡液作为提取液，调节提取液ph至5-7，搅拌、静置，得到固液混合物；步骤s3，对固液混合物进行离心分离，收集富含多胺的固相；步骤s4，对富含多胺的固相进行干燥，获得富含多胺的小麦胚芽提取物。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤s1中，小麦胚芽粉末与乙醇溶液的体积比为1:5-10；浸泡温度为25℃~40℃，浸泡次数1-3次。7.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述小麦胚芽提取物的制备方法，包括如下步骤：（1）将小麦胚芽原料采用含0.8-1.2wt%抗坏血酸的ph3-4稀酸溶液进行浸泡；（2）将浸泡后的小麦胚芽原料用ph3-4稀酸溶液渗漉，收集渗漉液；（3）将渗漉液通过有机膜和/或无机膜进行过滤，收集清液；（4）将清液再过2500-3500dal超滤膜，收集截留液；（5）将截留液煮沸灭菌、干燥，获得含多胺的小麦胚芽提取物。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，所述有机膜为抽滤袋，无机膜为陶瓷膜。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（1）中稀酸溶液的用量为原料用量的3-10倍；步骤（5）中干燥为喷雾干燥，喷雾干燥器进风温度控制在 185-215℃，出风温度控制在 90-110℃。10.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述组合物的剂型为液体制剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、乳液或混悬液。

技术总结
本发明公开了富含多胺的小麦胚芽提取物的新应用，结果显示，富含多胺的小麦胚芽提取物能显著增加细胞迁移能力，具有促进皮肤修复和愈合作用，且能显著促进皮肤成纤维细胞增殖，具有促进细胞增殖活性的作用；可显著抑制B16细胞黑素合成量，具有美白活性；能够延缓皮肤衰老，促进皮肤胶原蛋白生成，提升皮肤透明质酸合成。这表明本发明制备得到的富含多胺的小麦胚芽提取物可以制备用于皮肤修复、皮肤美白以及延缓皮肤衰老的保健品、食品、化妆品或药品中，为小麦胚芽的开发利用提供了新途径。为小麦胚芽的开发利用提供了新途径。为小麦胚芽的开发利用提供了新途径。


技术研发人员：岳中宝 何健 汪玉芳 贺瑞坤
受保护的技术使用者：汤臣倍健股份有限公司
技术研发日：2023.05.10
技术公布日：2023/9/12