一种具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞、心肌细胞的丹参茎叶总酚酸转化产物及其应用

1.本发明涉及一种天然产物组合物，特别是涉及一种具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞和心肌细胞减轻氧化损伤的丹参茎叶总酚酸转化产物及其制备方法与应用。
技术背景
2.心血管疾病(cvd)是全球死亡的主要原因，缺血性心脏病(ischemic heart disease,ihd)是主要原因。高血压、糖尿病、高脂血症、肥胖、吸烟等因素都有可能导致动脉粥样硬化或冠状动脉痉挛，引起冠状动脉狭窄或闭塞，导致供血不足，心肌缺血缺氧后，氧自由基、炎症因子、游离脂肪酸升高，能量代谢异常，心肌细胞发生调亡最终死亡。因此，深入探究ihd发病机制及病理过程，开发高效低副作用的有效创新药物对于全球民众健康具有重大意义。
3.丹参为唇形科植物丹参salvia miltiorrhiza bge.的干燥根及根茎。具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦，凉血消痈的功效。丹参是常见大宗药材，临床常用丹参注射液、复方丹参滴丸、复方丹参片等治疗心脑血管疾病，其地上茎叶也具有一定功效，如清代《医方守约》记载：“丹参叶捣烂，合酒糟敷乳，肿初起立消”，此外《山东药用植物志》也记载“丹参茎叶具有活血化瘀，清心除烦之功效”，丹参茎叶具有一定的药效价值。丹参及茎叶均含有丰富的酚酸类成分，具有抗氧化、抗炎、抗血栓药理作用，用于治疗心肌缺血、心肌梗死等心血管疾病。其中以丹酚酸a在缺血再灌注损伤保护作用上活性最佳，具有明确的临床应用价值，但其含量较低。丹参茎叶作为传统非药用部位，未能得到充分的开发利用，造成了极大的资源浪费和环境污染。本发明以丹参茎叶总酚酸为底物进行转化，以提高丹酚酸a含量水平，并基于体内体外考察丹酚酸a含量相对提高后的组合物的抗氧化活性，对血管内皮细胞、心肌细胞的保护作用。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的在于提供一种具有心肌保护功能的丹参茎叶总酚酸转化产物及其制备方法与应用，
5.一种具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞、心肌细胞的丹参茎叶总酚酸转化产物，所述转化产物采用以下制备方法制得：
6.取丹参地上茎叶部分，热风干燥，粉碎机粉碎后过筛，得到丹参茎叶粗粉。加乙醇，回流提取，合并提取液，真空减压浓缩回收乙醇，并浓缩至无醇味，得到丹参茎叶提取液；
7.取上述丹参茎叶提取液加水稀释，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，先用纯水洗至无醇味并除去杂质，20％乙醇洗脱部位和30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品；
8.将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释，用盐酸调ph，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯部
分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸；
9.将得到的丹参茎叶酚酸加水稀释，用盐酸调节转化液ph，采用高温高压灭菌锅反应，真空冷冻干燥即得转化产物。
10.作为优选方案，以上所述的具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞、心肌细胞的丹参茎叶总酚酸转化产物，所述转化产物采用以下制备方法制得：
11.取丹参地上茎叶部分，40～50℃热风干燥，粉碎机粉碎后过药典3号标准筛，得到丹参茎叶粗粉。每次加10～15倍量60％乙醇，80℃～85℃低温回流提取1～3次，每次1～2h，合并提取液，真空减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味得到丹参茎叶提取液；
12.上述丹参茎叶提取液加水稀释至每1ml含0.125～1.5g生药，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用2～3倍体积95％乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，树脂质量与上样量比为2～3:1，树脂柱径高比为1:5～1:20，先用3～5bv纯水洗至无醇味并除去杂质，然后用3～5bv 20％乙醇洗脱部位和前1.5～2bv 30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品；
13.将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释至每1ml含0.1～0.3g生药，5m盐酸调ph至2～3，两倍乙酸乙酯萃取3～5次，合并乙酸乙酯部分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸；
14.将得到的丹参茎叶酚酸加水稀释至每1ml含丹酚酸b10～20mg，用5m盐酸调节转化液ph＝3～5，采用高温高压灭菌锅，105～135℃反应2～4h，真空冷冻干燥即得转化产物。
15.作为最优的方案，本发明所述转化产物采用以下制备方法获得：
16.取丹参地上茎叶部分，40～50℃热风干燥，粉碎机粉碎后过药典3号标准筛，得到丹参茎叶粗粉。每次加10倍量60％乙醇，80℃～85℃低温回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，真空减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味得到丹参茎叶提取液。
17.上述丹参茎叶提取液加水稀释至每1ml含0.125g生药，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用2倍体积95％乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，树脂质量与上样量比为2:1，树脂柱径高比为1:5～1:20，先用5bv纯水洗至无醇味并除去杂质，5bv 20％乙醇洗脱部位和前1.5bv 30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品。
18.将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释至每1ml含0.1g生药，5m盐酸调ph至2，两倍乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸。
19.将得到的丹参茎叶总酚酸加水稀释至每1ml含丹酚酸b15mg，用5m盐酸调节转化液ph＝3，采用高温高压灭菌锅，135℃反应2h，真空冷冻干燥即得转化产物。
20.本发明制备得到的转化产物包括下列重量百分比的活性成分：丹酚酸a7～9％，丹参素15％～17％，原儿茶醛1％～2％，迷迭香酸13～15％，紫草酸1％～2％，丹酚酸b3～4％。
21.本发明提供一种丹参茎叶总酚酸转化产物的测定方法，采用超高效液相色谱法测定丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸b的含量，测定条件如下：
22.优选的，采用超高效液相色谱法测定：丹酚酸a，丹参素，原儿茶醛，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸b含量，测定条件如下：
23.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；
24.检测波长280nm；流速0.4ml/min；柱温35℃；
25.理论塔板数按丹酚酸a计应不低于10000；
26.对照品溶液的制备精密称取丹酚酸a、丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸c对照品适量至容量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液；
27.供试品溶液的制备：精密称取样品10mg到5ml容量瓶中，加50％甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度线，即得；
28.洗脱以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按下述条件进行梯度洗脱，运行21分钟。
29.0～1分钟时，乙腈的比例保持在5％，0.1％甲酸水溶液的比例保持在95％；
30.1～3分钟时，乙腈的比例由5％升至10％，0.1％甲酸水溶液的比例由95％降至90％；
31.3～7分钟时，乙腈的比例由10％升至15％，0.1％甲酸水溶液的比例由90％降至85％；
32.7～11分钟时，乙腈的比例由15％升至21％，0.1％甲酸水溶液的比例由85％降至79％；
33.11～15分钟时，乙腈的比例由21％升至33％，0.1％甲酸水溶液的比例由79％降至66％；
34.15～17分钟时，乙腈的比例由33％升至70％，0.1％甲酸水溶液的比例由66％降至30％；
35.17～18分钟时，乙腈的比例由70％升至80％，0.1％甲酸水溶液的比例由30％降至20％；
36.18～20分钟时，乙腈的比例保持在80％，0.1％甲酸水溶液的比例保持在20％；
37.20～21分钟时，乙腈的比例由80％降至5％，0.1％甲酸水溶液的比例由20％升至95％；
38.测定法：分别精密吸取混合对照品溶液于供试品溶液各1ml至液相小瓶，自动进样，每次吸取2μl，测定，计算丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b的含量。
39.本发明通过对丹参地上部分进行提取、纯化、萃取、高温高压转化，得到了以丹酚酸a含量相对提高的丹参茎叶总酚酸，即转化产物。丹参茎叶主要含有迷迭香酸和丹酚酸b，丹酚酸b水溶性好但性质不稳定，高温条件下易降解生成丹酚酸a等其它酚酸类成分。因此，采用60％乙醇，在80℃～85℃回流提取，以保证丹酚酸b不被破坏。
40.本发明提供的丹参茎叶总酚酸转化产物，体外清除dpph自由基、清除abts自由基及还原fe
3+
能力测定(frap法)检测结果显示转化产物较丹参茎叶总酚酸的抗氧化作用明显增强；基于过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞和大鼠心肌细胞氧化损伤模型，考察丹参茎叶总酚酸转化前后对细胞的保护作用，结果表明，过氧化氢诱导氧化损伤后，模型组sod水平降低，mda、ldh水平升高(p《0.0001)，丹参茎叶总酚酸转化前后均具有较强的抗氧化活性，与维生素c相比保护效果相当，能显著升高sod水平、降低mda(p《0.001)，一定范围内，给药剂量与保护效果呈剂量依赖性，且给药组高剂量组较低剂量组的保护效果显著，转化产
物保护效果优于丹参茎叶总酚酸；对异丙肾上腺素诱导的急性心肌缺血大鼠模型有很好的保护作用，iso造模后，模型组心率显著升高，长时间缺血会导致左心室代偿性肥大，心脏脏器指数显著升高(p《0.0001)，心电图st段下降表明为心内膜缺血损伤，心肌缺血缺氧导致氧自由基增多、膜通透性增大、炎症因子分泌增多，反映在模型组心肌酶ast、ldh、ck、ck-mb水平显著降低(p《0.001)；抗氧化酶sod、cat、gsh-px活性显著下降(p《0.0001)，脂质过氧化终产物mda含量升高；转化产物较丹参茎叶总酚酸能有效下调ldh、提高cat、sod活性水平(p《0.001)，高剂量效果优于低剂量。心电图结果、he和masson病理切片结果与上述结果一致。
41.本发明提供的丹参茎叶总酚酸转化产物较丹参茎叶总酚酸的丹酚酸a相对含量升高，而迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸c含量减少，转化后的产物可显著改善iso诱导的心肌缺血大鼠st段变化，提高抗氧化酶活性，减少心肌损伤酶含量，保护心肌细胞，具有明显的抗心肌缺血作用。
42.上述研究表明本发明提供的转化产物有很好的抗氧化活性，对氧化损伤的血管内皮细胞及心肌细胞能起到良好的保护作用，可用于制备具有改善冠状动脉缺血、缺氧引起的心血管损伤。
43.本发明所述的具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞和心肌细胞减轻氧化损伤的转化产物及其制备方法与应用，将此转化产物和药学上可接受的载体制成片剂、丸剂、散剂、汤剂、颗粒剂、煎膏剂或浸膏剂剂型的药物，临床服用方便。
附图说明
44.图1为混合对照品的uplc图谱。
45.图2为转化产物对huvec细胞氧化损伤模型的保护作用结果图。
46.图3为转化产物对huvec细胞氧化损伤模型细胞中sod含量影响的柱状图。
47.图4为转化产物对huvec细胞氧化损伤模型细胞中mda含量影响的柱状图。
48.图5为转化产物对huvec细胞氧化损伤模型上清中ldh含量影响的柱状图。
49.图6为转化产物对h9c2细胞氧化损伤模型的保护作用结果图。
50.图7为转化产物对h9c2细胞氧化损伤模型细胞中sod含量影响的柱状图。
51.图8为转化产物对h9c2细胞氧化损伤模型细胞中mda含量影响的柱状图。
52.图9为转化产物对h9c2细胞氧化损伤模型上清中ldh含量影响的柱状图。
53.图10为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型的心脏指数影响的柱状图。
54.图11为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心率值影响的柱状图。
55.图12为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心电图上st段影响的柱状图。
56.图13为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心电图影响的柱状图。
57.图14为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心肌的he染色结果。
58.图15为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心肌的masson染色结果。
59.图16为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型血清中ck含量影响的柱状图。
60.图17为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型血清中ck-mb含量影响的柱状图。
61.图18为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型血清中ast含量影响的柱状图。
62.图19为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型血清中ldh含量影响的柱状图。
63.图20为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心肌中sod含量影响的柱状图。
64.图21为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心肌中mda含量影响的柱状图。
65.图22为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心肌中gsh-px含量影响的柱状图。
66.图23为转化产物对急性心肌缺血大鼠模型心肌中cat含量影响的柱状图。
具体实施方式
67.下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本技术所附权利要求所限定的范围。
68.实施例1一种具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞和心肌细胞减轻氧化损伤的转化产物的制备方法，包括如下步骤：
69.(1)取丹参地上茎叶部分，45℃热风干燥，粉碎机粉碎后过药典3号标准筛，得到丹参茎叶粗粉。每次加10倍量60％乙醇，85℃低温回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，真空减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味得到丹参茎叶提取液。
70.(2)上述丹参茎叶提取液加水稀释至每1ml含0.125g生药，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用2倍体积95％乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，树脂质量与上样量比为2:1，树脂柱径高比为1:10，先用5bv纯水洗至无醇味并除去杂质，5bv 20％乙醇洗脱部位和前1.5bv 30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品。
71.(3)将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释至每1ml含0.1g生药，5m盐酸调ph至2，两倍乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸。
72.(4)将得到的丹参茎叶酚酸加水稀释至每1ml含丹酚酸b15mg，用5m盐酸调节转化液ph＝3，采用高温高压灭菌锅，135℃反应2h，真空冷冻干燥即得丹参茎叶转化产物。
73.实施例2一种具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞和心肌细胞减轻氧化损伤的转化产物及其制备方法，包括如下步骤：
74.(1)取丹参地上茎叶部分，50℃热风干燥，粉碎机粉碎后过药典3号标准筛，得到丹参茎叶粗粉。每次加10倍量60％乙醇，80℃低温回流提取3次，每次1h，合并3次提取液，真空减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味得到丹参茎叶提取液。
75.(2)上述丹参茎叶提取液加水稀释至每1ml含0.125g生药，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用2倍体积95％乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，树脂质量与上样量比为2:1，树脂柱径高比为1:15，先用5bv纯水洗至无醇味并除去杂质，5bv 20％乙醇洗脱部位和前1.5bv 30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品。
76.(3)将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释至每1ml含0.1g生药，5m盐酸调ph至2，两倍乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯部分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸。
77.(4)将得到的丹参茎叶酚酸加水稀释至每1ml含丹酚酸b15mg，用5m盐酸调节转化液ph＝4，采用高温高压灭菌锅，135℃反应2h，真空冷冻干燥即得丹参茎叶转化产物。
78.实施例3丹参茎叶总酚酸转化产物制备及分析方法
79.1.仪器与试药
80.仪器：waters acquity uplc系统(美国waters公司)；ditect-q5纯水制备仪(millipore公司)；ml105万分之一电子天平。
81.色谱柱：waters acquity uplc beh c
18
(2.1mm
×
100mm，1.7μm)。
82.试剂：超纯水由milli-q超纯水制备系统自制；乙醇95％购自南京晚晴化玻仪器有限公司；甲醇、乙腈购自德国默克公司；甲酸(美国acs公司，色谱级)。
83.化学对照品丹酚酸b、原儿茶酸；丹参素、紫草酸、丹酚酸a、丹酚酸c、迷迭香酸、咖啡酸均购自上海源叶生物科技有限公司；原儿茶醛购自南京春秋生物工程公司有限公司，质量分数均大于98％。
84.2.对照品溶液及供试品溶液的制备
85.2.1对照品溶液的制备：取丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、丹酚酸c各类对照品适量，精密称定于1ml棕色容量瓶中，90％甲醇定容到刻度线为混合对照品母液，吸取500μl到新的1ml容量瓶内，用90％甲醇定容到刻度线，其中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸a、丹酚酸c浓度分别为555、635、800、625、670、585、675、680、595μg/ml，用于后续含量测定。
86.2.2供试品溶液的制备：称取实施例1和实施例2制备得到的转化产物样品粉末5mg，精密称定于1ml容量瓶中，50％甲醇溶解完全，13000r/min离心10min，取上清液，过0.22μm微孔滤膜后，即得。
87.3.色谱条件与系统适用性试验
88.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长280nm；流速0.4ml/min；柱温35℃；理论塔板数按丹酚酸a计应不低于10000；
89.0～1分钟时，乙腈的比例保持在5％，0.1％甲酸水溶液的比例保持在95％；1～3分钟时，乙腈的比例由5％升至10％，0.1％甲酸水溶液的比例由95％降至90％；3～7分钟时，乙腈的比例由10％升至15％，0.1％甲酸水溶液的比例由90％降至85％；7～11分钟时，乙腈的比例由15％升至21％，0.1％甲酸水溶液的比例由85％降至79％；11～15分钟时，乙腈的比例由21％升至33％，0.1％甲酸水溶液的比例由79％降至66％；15～17分钟时，乙腈的比例由33％升至70％，0.1％甲酸水溶液的比例由66％降至30％；17～18分钟时，乙腈的比例由70％升至80％，0.1％甲酸水溶液的比例由30％降至20％；18～20分钟时，乙腈的比例保持在80％，0.1％甲酸水溶液的比例保持在20％；20～21分钟时，乙腈的比例由80％降至5％，0.1％甲酸水溶液的比例由20％升至95％。
90.上述条件下，9个对照品的色谱峰保留时间见表1，混合对照品uplc图谱见图1。
91.表1各对照品的色谱峰保留时间结果
92.组分保留时间(min)丹参素3.344原儿茶酸3.486原儿茶醛4.758咖啡酸6.603迷迭香酸13.646紫草酸13.939
丹酚酸b14.432丹酚酸a15.085丹酚酸c16.151
93.4.线性关系的考察
94.取混合对照品溶液，按2倍逐级稀释10次，获得不同浓度梯度的混合对照品溶液，经0.22μm微孔滤膜滤过，按“3.色谱条件与系统适用性试验”项下色谱条件依次进样分析，以峰面积积分值为纵坐标(y)，对照品的质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表2。
95.表2混合对照品溶液线性关系考察结果
[0096][0097][0098]
5、含量测定结果
[0099]
实施例1制备得到的转化产物中丹酚酸a含量为7.34％，丹参素含量为15.36％，原儿茶醛含量1.24％，迷迭香酸含量13.70％，紫草酸含量1.03％，丹酚酸b含量3.94％。
[0100]
实施例2制备得到的转化产物中丹酚酸a含量为8.16％，丹参素含量为16.80％，原儿茶醛含量1.41％，迷迭香酸含量14.91％，紫草酸含量1.73％，丹酚酸b含量3.56％。
[0101]
6.精密度试验
[0102]
精密吸取对照品溶液2μl，按照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下条件连续进样6次，计算各对照品峰面积的相对标准偏差(rsd)，考察仪器的精密度。结果显示精密度良好。
[0103]
表3精密度试验结果
[0104][0105]
7.稳定性试验
[0106]
取丹参茎叶总酚酸样品中的1份供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样，按照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下条件进行测定，记录峰面积，计算各组分峰面积的rsd值。结果显示各化合物在24h内具有良好的稳定性。
[0107]
表4稳定性试验结果
[0108][0109]
8.重复性试验
[0110]
平行取丹参茎叶总酚酸转化产物，加50％甲醇制成供试品溶液6份，按照“3.色谱条件与系统适用性试验”项下条件测定，记录峰面积，计算各组分峰面积的rsd值。结果显示该方法重复性良好。
[0111]
表5重复性试验结果
[0112][0113]
9.回收率试验
[0114]
取9份已知含量的丹参茎叶总酚酸转化产物，精密称定，按照100％样品+50％标品、100％样品+100％标品及100％样品+150％标品，平行3份，加入对应含量的标准品。“2.2”项下的操作制备待测样品溶液，按照“3.色谱条件与系统适用性试验”进行测定，记录峰面积，计算加样回收率和rsd值。结果说明回收率良好。
[0115]
表6回收率试验结果
[0116]
加样回收率平均值(％)丹参素迷迭香酸紫草酸丹酚酸b丹酚酸a丹酚酸c100％样品+50％标品99.84％101.44％103.87％106.76％101.94％99.75％100％样品+100％标品98.86％103.65％103.62％97.03％95.34％96.67％100％样品+150％标品103.03％104.58％99.33％102.55％97.81％97.90％平均值100.58％103.22％102.28％102.11％98.36％98.11％rsd(％)2.17％1.56％2.50％4.78％3.39％1.58％
。
[0117]
实施例4制备丹参茎叶总酚酸转化产物的实验研究
[0118]
1.1评价指标：将丹参茎叶总酚酸作为转化底物，转化后的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸c含量明显减少，针对以上4种减少的单体成分，在相同转化条件下反应，结果表明丹酚酸a主要由丹酚酸b转化而生成，故转化率计算公式如下所示，a(sal a1)、a(sal a0)分别为转化后、转化前丹酚酸a的峰面积，a(sal b0)，a(sal b1)分别为转化前和转化后丹酚酸b的峰面积。以丹酚酸a转化率为指标，单因素考察调ph溶剂、ph值、转化温度、转化时间、转化底物浓度对转化的影响。
[0119][0120]
1.2调节ph溶剂的确定
[0121]
取3份浓度以丹酚酸b计约10mg/ml的丹参茎叶总酚酸溶液作为供试品溶液，用磷酸、盐酸、磷酸盐缓冲液或氢氧化钠调节ph＝5，分别为实验1、实验2、实验3，蒸汽灭菌锅中120℃，反应4h用uplc检测丹酚酸b及丹酚酸a转化前后的峰面积，计算转化率，如表7所示，结果表明用盐酸调节ph最利于转化得到丹酚酸a，因此，后续单因素试验均采用盐酸作为调节ph值的溶剂。
[0122]
表7调节ph溶剂种类对丹酚酸a转化率的影响
[0123]
组别调节ph的溶剂丹酚酸a转化率(％)
实验1盐酸104.69实验2磷酸83.22实验3磷酸盐缓冲液66.1
[0124]
1.3ph值
[0125]
配制浓度以丹酚酸b计约10mg/ml的丹参茎叶总酚酸溶液作为供试品溶液。取5份样品液，每份2ml，用盐酸或氢氧化钠分别调ph为1、3、5、7、9放入蒸汽灭菌锅，分别为实验1～5，120℃反应4h取出，uplc检测丹酚酸b及丹酚酸a转化前后的峰面积，计算转化率。如表8所示，酸性条件下丹酚酸a转化率高，且随ph值升高呈逐渐升高趋势，而碱性条件下丹酚酸a转化率极低，故选择ph为3、5、7三水平进行正交试验。
[0126]
表8 ph值对丹酚酸a转化率的影响
[0127]
组别ph值丹酚酸a转化率(％)实验1112.65实验2373.29实验35104.69实验4712.33实验598.16
[0128]
1.4转化温度
[0129]
取5份浓度以丹酚酸b计约为10mg/ml的丹参茎叶总酚酸溶液，每份2ml，用盐酸及氢氧化钠调ph＝5，分别在75℃、90℃、105℃、120℃、135℃条件下反应，分别为实验1～5，在蒸汽灭菌锅中反应4h后取出，uplc检测丹酚酸b及丹酚酸a转化前后的峰面积，计算转化率，100℃以上用蒸汽灭菌锅反应，以下用水浴锅反应。如表9所示，温度对丹酚酸a转化率具明显影响，100℃以上高温利于丹酚酸a转化，转化率随温度升高而逐渐下降，故选择105℃、120℃、135℃进行正交试验。
[0130]
表9温度对丹酚酸a转化率的影响
[0131]
组别转化温度(℃)丹酚酸a转化率(％)实验1753.23实验29013.91实验3105119.07实验4120104.69实验513531.09
[0132]
1.5转化时间
[0133]
取4份浓度以丹酚酸b计约为10mg/ml的丹参茎叶总酚酸溶液，每份2ml，用盐酸或氢氧化钠调ph＝5，在120℃分别反应2、4、6、8、10h，分别为实验1～5，uplc检测转化前后丹酚酸b和丹酚酸a的峰面积，计算转化率，见表10，长时间高温不利于丹酚酸a稳定存在，故选择反应时间为2、4、6h进行正交试验。
[0134]
表10转化时间对丹酚酸a转化率的影响
[0135]
组别转化时间(h)丹酚酸a转化率(％)实验1295.1
实验24104.69实验3619.07实验4811.28实验51046.54
[0136]
1.6样品浓度的影响
[0137]
制备底物浓度以丹酚酸b计约为2、5、10、15、20mg的丹参茎叶总酚酸溶液，取5份样品溶液，每份2ml，用盐酸调ph＝5，分别为实验1～5，放蒸汽灭菌锅120℃，反应4h，uplc检测转化前后丹酚酸b和丹酚酸a的峰面积，计算转化率。如表11所示，选择底物中丹酚酸b浓度为10、15、20mg/ml三水平进行正交试验。
[0138]
表11底物丹酚酸b浓度对丹酚酸a转化率的影响
[0139]
组别丹酚酸b浓度(mg/ml)丹酚酸a转化率(％)实验1238.01实验2530.07实验310104.69实验41556.61实验52063.19。
[0140]
2.1正交试验法优选转化工艺
[0141]
精密称取9份丹参茎叶总酚酸冻干粉，根据以上实验结果，选用l9(34)正交表进行正交试验，以丹酚酸a转化率为评价指标，选择样品液的ph值(a)、底物浓度(b)、反应时间(c)、反应温度(d)为考察因素，各选取3个水平，优选化学转化最优工艺。
[0142]
正交试验结果以极差最小的c(底物浓度)为误差项进行方差分析，各因素对丹酚酸a转化率的影响大小为a(ph值)》b(时间)》d(温度)》c(底物浓度)，主要影响因素为ph值(p《0.05)、转化时间(p《0.05)。根据极差结果及各因素的k值，依据各因素对应的k最高值的水平确定丹参茎叶总酚酸最佳的化学转化工艺为a1b1c2d3，即用盐酸调节ph值为3，底物浓度(以丹酚酸b计)15mg/ml，135℃，2h。结果见表12、表13。
[0143]
表12 l9(34)正交试验设计及分析
[0144][0145]
表13方差分析
[0146]
方差来源离差平方和自由度均方f值p值显著性a0.077320.038629.17970.0331p《0.05b0.059320.029622.38290.0428p《0.05c0.002620.00131.00000.5000\d0.017620.00886.65830.1306p》0.05。
[0147]
实施例5丹参茎叶总酚酸转化产物的抗氧化活性实验研究
[0148]
一、实验材料与药物
[0149]
1.实验仪器
[0150]
ditect-q5纯水制备仪(millipore公司)；tomy sx-500蒸汽灭菌锅；ml105万分之一电子天平；大龙d3024r高速冷冻离心机；enspire多功能酶标仪(美国perkinelmer公司)。
[0151]
2.药物与试剂
[0152]
超纯水由milli-q超纯水制备系统自制；乙醇95％购自南京晚晴化玻仪器有限公司；dpph购自索莱宝公司、abts及三吡啶三嗪(tptz)测试试剂盒购自南京建成公司，丹参茎叶转化前的后酚酸部位为实验室自制。96孔酶标板。
[0153]
二、实验方法
[0154]
1.样品提取与制备
[0155]
样品来自实施例1和2的丹参茎叶转化前的丹参茎叶总酚酸和丹参茎叶转化后的转化产物。
[0156]
2.体外抗氧化活性评价方法
[0157]
分别精密称取干燥后的样品，复溶于80％乙醇溶液，配制成1mg/ml的溶液，按2倍
依次稀释得到8个浓度梯度的供试品溶液，用酶标仪按下述方法分析抗氧化能力。
[0158]
dpph自由基清除率评价：在孔板中加入50μl供试品溶液和100μl的0.05mg/ml dpph乙醇溶液(无水乙醇配制)，混匀后在室温下避光反应30min，在517nm下测得吸光度a
样品
；以80％乙醇分别代替dpph溶液和供试品溶液按上述方法分别测得吸光度a
对照
和a
空白
。按下式计算dpph自由基清除率。维生素c做阳性对照。
[0159]
dpph自由基清除率(％)＝1-(a
样品-a
对照
)/a
空白
，计算ic
50
。
[0160]
abts清除活性评价：按试剂盒说明书操作，将abts溶液、氧化剂溶液1:1配制得abts工作母液，室温避光存放12-16小时后使用，用时将abts工作母液用80％乙醇稀释成abts工作液。在96孔板中加入200μl abts工作液和10μl供试品溶液混匀，室温孵育2～6min后，在734nm波长下测得吸光度a
样品
，以80％乙醇分别代替abts工作液和供试品溶液按上述方法分别测得吸光度a
对照
和a
空白
。按下式计算abts自由基清除率。
[0161]
abts自由基清除率(％)＝1-(a
样品-a
对照
)/a
空白
，计算ic
50
。
[0162]
还原fe
3+
能力测定(frap法)：按还原fe
3+
能力测定试剂盒说明书操作，将tptz稀释液与tptz溶液按10:1充分混匀后再加入与tptz等体积的检测缓冲液，37℃孵育得frap工作液。在96孔板检测孔中加入180μl frap工作液和5μl供试品溶液，混匀后在593nm波长下测得a样品。称取27.8mg feso4·
7h2o定容于1ml容量瓶中，得100mmol/mlfeso4·
7h2o溶液，将原液稀释成系列浓度，按上述方法测得吸光度，得到标准曲线。样品抗氧化活性以达到相同吸光度所需feso4的物质的量(mmol)表示，其标准方程为y＝0.2446x+0.099，r2＝0.9937，测得的吸光度a值越高，表明还原fe
3+
的能力越强。
[0163]
三、实验结果
[0164]
3.1dpph自由基清除率结果
[0165]
由表14、表16可知，丹参茎叶转化产物、丹参茎叶总酚酸低浓度条件下的dpph自由基清除能力强弱大小为转化产物》丹参茎叶总酚酸》维生素c，且测定范围内其抗氧化能力均与质量浓度呈现出明显的剂量依赖关系，随浓度的增加而增加。丹参茎叶总酚酸转化后(ic
503±
0.16mg/ml)较丹参茎叶总酚酸(ic
50 3.4
±
0.08mg/ml)的抗氧化能力明显提高。
[0166]
表14各样品组dpph自由基清除率(n＝3)
[0167]
反应物浓度(μg/ml)转化产物丹参茎叶总酚酸维生素c31.2593.88
±
0.7795.73
±
0.2596.5
±
0.1515.6393.96
±
0.5192.98
±
1.1493.48
±
1.887.8180.65
±
3.9572.56
±
4.368.47
±
5.983.9150.61
±
0.4145.12
±
2.3541.72
±
2.71.9533.56
±
1.8431.84
±
4.8128.09
±
5.050.9825.39
±
2.5322.72
±
2.2121.4
±
4.3
[0168]
3.2abts清除活性评价
[0169]
从表15、表16可知，转化产物、丹参茎叶总酚酸的abts清除能力与维生素c相当，测定范围内抗氧化能力均与质量浓度呈现出正相关性的剂量依赖关系，结果表明总酚酸转化后(ic
50 16.88
±
0.32mg/ml)的抗氧化能力优于丹参茎叶总酚酸(ic
50 20.25
±
0.48mg/ml)。
[0170]
表15各样品组对abts自由基清除率(n＝3)
[0171]
反应物浓度(μg/ml)转化产物丹参茎叶总酚酸维生素c125.0098.95
±
0.4698.92
±
0.7598.66
±
1.3362.5098.35
±
0.9897.51
±
1.8596.41
±
4.2731.2564.65
±
2.7352.15
±
3.0849.56
±
1.9515.6333.2
±
1.0629.42
±
4.0825.46
±
0.77.8119.28
±
1.4615.93
±
0.6414.68
±
1.953.9112.41
±
1.539.57
±
0.7710.01
±
0.631.958.26
±
1.286.33
±
1.37.89
±
0.53
[0172][0173]
3.3还原fe
3+
能力测定(frap法)
[0174]
结果见表，丹参茎叶总酚酸转化后(1.15
±
0.03mmol feso4)较丹参茎叶总酚酸(0.98
±
0.06mmol feso4)的抗氧化能力有所提高。
[0175]
表16丹参茎叶酚酸部位转化前后抗氧化活性(n＝3)
[0176]
样本dpph(ic
50
，mg/ml)abts(ic
50
，mg/ml)frap(mmol feso4)转化产物3.4
±
0.0820.25
±
0.481.154
±
0.03丹参茎叶总酚酸3
±
0.1616.88
±
0.320.977
±
0.059。实施例6转化产物对h2o2诱导huvec、h9c2氧化损伤模型的保护作用实验研究
[0177]
一、实验材料与药物
[0178]
1.实验仪器
[0179]
bws-10恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)，超纯水制备仪(milliq，millipore，美国)；高速离心机(backman公司)；forma seriesii water jacket型co2培养箱(thermo公司)；1300series a2超净工作台(thermo公司)；primostar倒置显微镜(zeiss公司)；tomy sx-500高压灭菌锅(南京基天生物技术有限责任公司)；enspire多功能酶标仪(美国perkineimer公司)；96孔酶标板购自美国corning公司，细胞培养皿(coming incorporated)。
[0180]
2.试剂
[0181]
高糖dmem培养基、抗生素p/s(青霉素10000u/ml，链霉素10000mg/ml)、胎牛血清fbs和胰蛋白酶-edta消化液均来自美国gibco公司；二甲基亚砜(dmso)、四甲基偶氮唑蓝(mtt)、双氧水购自上海沪试实验室器材有限公司；超纯水由milli-q超纯水制备仪制备；丹参茎叶总酚酸转化前后组分均为自制(实施例1)。超氧化歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、乳酸脱氢酶(ldh)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0182]
3.实验细胞
[0183]
人脐静脉内皮细胞huvec购自南京凯基生物科技发展有限公司、大鼠心肌细胞h9c2购自武汉普诺赛生命科技有限公司，本次实验均采用3～15代以内细胞进行实验。
[0184]
二、实验方法
[0185]
1.细胞培养
[0186]
huvec与h9c2细胞均培养在含10％ fbs+1％ p/s的高糖dmem培养基中，放置在温度
37℃、5％co2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2d换液1次，当培养皿中的细胞覆盖率达到80％-90％)，用胰蛋白酶消化传代。
[0187]
2.细胞种板
[0188]
huvec与h9c2细胞种板：当培养皿中的细胞覆盖率达到80％-90％时，用胰蛋白酶消化细胞2min左右，光学显微镜下，细胞形态变圆，此时可用移液枪从培养皿上将细胞吹打混匀，用完全dmem高糖培养液稀释后配制成浓度为6
×
104个/ml的细胞悬液，再接种于96孔板中，每孔加100μl的完全培养基，放入孵育箱，培养条件为5％ co2，37℃。
[0189]
3.过氧化氢细胞损伤模型建立
[0190]
细胞换液后培养24h，吸弃培养细胞的培养基，pbs清洗3遍，加入新培养基(10％fbs)90μl孵育3h后加入10μl不同浓度的过氧化氢。过氧化氢损伤huvec细胞组孵育2h，h9c2氧化损伤组孵育4h，孵育在37℃、5％ co2培养箱中。氧化损伤造模结束后弃去旧培养基，每孔加入90μl新10％fbs培养基，10μl mtt溶液(5mg/ml)培养箱孵育3h，孵育结束后吸弃孔内培养基，每孔加入dmso 150μl，37℃恒温振荡30min，酶标仪测定570nm下各孔吸光度。根据mtt实验结果，确定后续实验中造模浓度，计算公式如下。
[0191]
细胞存活率/％＝(模型组od值/空白组od值)
×
100％
[0192]
4.实验分组
[0193]
实验分为空白组、模型组、维生素c组、各模型+给药组(丹参茎叶总酚酸组、转化产物组)，丹参茎叶总酚酸及转化产物以新培养基(10％ fbs)溶解稀释，最高浓度设置为1mg/ml；以2倍逐级稀释6个浓度，以mtt法测定不同浓度各给药组的细胞存活率。
[0194]
5.形态学观察及mtt法测各组细胞存活率情况
[0195]
将huvec、h9c2细胞以6
×
104个/ml密度接种于96孔板，每孔100μl培养液，将96孔板放入孵育箱，培养条件为5％ co2，37℃。过氧化氢损伤组，2000μmol/l过氧化氢诱导细胞损伤2h，同时给予药物干预，倒置显微镜下观察各组细胞形态。h9c2细胞过氧化氢损伤组，800μmol/l过氧化氢诱导细胞损伤4h，同时给予药物干预。
[0196]
6.细胞培养液中sod、mda、ldh水平测定
[0197]
将huvec、h9c2细胞(5
×
105个细胞/孔)接种于6孔细胞培养板中，经造模给药后，收集培养上清和细胞，按照试剂盒说明书的操作步骤，分别测定超氧化歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、乳酸脱氢酶(ldh)水平。
[0198]
7.统计学处理
[0199][0200]
实验结果采用spss 21.0进行统计分析，数据以平均数
±
标准差()表示，组间比较采用单因素方差分析(avona)，p《0.05时差异具有统计学意义。
[0201]
三、实验结果
[0202]
1.造模浓度筛选结果
[0203]
氧化损伤模型发现细胞损伤程度随着造模浓度的上升而增加。经造模浓度的筛选，选择细胞存活率约为50％时为细胞最佳造模浓度。结果以过氧化氢2000μmol/l造模2h为huvec细胞最佳造模剂量，过氧化氢800μmol/l造模4h为h9c2细胞的最佳造模剂量。
[0204]
2.对过氧化氢损伤的huvec细胞的保护作用
[0205]
空白组huvec细胞生长状态良好，呈铺路石样，排列紧密；模型组经氧化损伤后，细
胞形态皱缩，间隙增大，大小分布不均且排列紊乱；较模型组，给药组细胞状态有轻微皱缩，间隙微大，排列较紧密，边界清晰，边界形态整体趋向空白组，高剂量较低剂量组细胞形态更趋近正常细胞。各给药组对氧化损伤的huvec细胞存活率的影响结果如图2所示，模型组mtt结果显著低于空白组(p《0.0001)，显示造模成功。与模型组相比，各给药组对h2o2损伤的huvec具有明显的保护作用(p《0.05)，在一定浓度范围内呈正相关性，剂量越大，对氧化损伤的细胞保护作用越好；各给药组在相同质量浓度下转化产物的保护作用与维生素c作用相当，且优于丹参茎叶总酚酸。
[0206]
huvec细胞氧化损伤后如图3、4、5所示，与对照组相比，模型组分泌的sod明显降低(p《0.001)，ldh、mda水平明显升高(p《0.0001)，给药后，与模型组相比，各给药组高、中、低剂量组的细胞及上清中分泌的sod水平升高(p《0.05)，mda、ldh水平降低(p《0.01)，均呈现一定的量效关系，剂量越大，保护作用越显著。维生素c能显著提高sod水平，转化产物可显著降低mda、ldh水平(p《0.01)。
[0207]
综上，丹参茎叶总酚酸转化后在相同质量浓度下对氧化损伤的huvec细胞的保护作用与维生素c保护作用相当，转化产物优于丹参茎叶总酚酸。
[0208]
3.对过氧化氢损伤的h9c2细胞的保护作用
[0209]
空白组h9c2细胞生长状态良好，细胞呈梭形或多角形，排列紧密；模型组经氧化损伤后，细胞形态皱缩，边界模糊，间隙增大，排列紊乱；较模型组，给药组细胞状态有皱缩，但皱缩程度较轻，边界较清晰，但排列较紧密，整体趋向空白组，各给药组中高剂量较低剂量组细胞形态更趋近正常细胞。各给药组对氧化损伤的h9c2细胞存活率的影响结果如图6显示，模型组mtt显著低于空白组(p《0.0001)，造模成功。与模型组相比，各给药组对h2o2损伤的h9c2细胞有保护作用，在一定浓度范围内呈正相关性，剂量越大，对氧化损伤的细胞保护作用越好，维生素c组保护效果最佳，高、中、低剂量组均能显著保护氧化损伤的h9c2细胞。给药组在相同质量浓度下转化产物对氧化损伤的h9c2细胞保护作用强于丹参茎叶总酚酸，实验发现，当转化产物低于62.5μg/ml给药剂量，丹参茎叶总酚酸低于250μg/ml时对氧化损伤的h9c2细胞几乎未见明显的保护作用。
[0210]
h9c2细胞氧化损伤后如图7、8、9所示，与对照组相比，模型组分泌的sod明显降低(p《0.0001)，mda、ldh水平明显升高(p《0.0001)；给药后，与模型组相比，各给药组高、中剂量组的细胞及上清中分泌的sod水平升高(p《0.01)，mda、ldh水平降低(p《0.001)，均呈现一定的量效关系，剂量越大，保护作用越显著。整体而言，转化产物的保护作用最佳，高剂量下能显著提高sod水平，降低mda水平(p《0.001)；维生素c可显著降低ldh水平(p《0.0001)；转化产物在相同质量浓度下对氧化损伤的h9c2细胞的保护作用优于丹参茎叶总酚酸。
[0211]
实施例4保护心肌功能的实验研究
[0212]
一、实验材料与药物
[0213]
1.药物和试剂
[0214]
盐酸异丙肾上腺素(罗恩，cas 51-30-9)；色谱级乙腈(默克，德国)；色谱级甲酸(acs公司，美国)；超纯水(millipore)；医用生理盐水；异氟烷(瑞沃德)；乳酸脱氢酶(ldh)检测试剂盒、肌酸激酶(ck)检测试剂盒、肌酸激酶同工酶(ck-mb)检测试剂盒、谷草转氨酶(ast)检测试剂盒由强盛生物科技有限公司提供。受试药物：本发明实施例2制备得到的丹参茎叶总酚酸及转化产物。
[0215]
2.实验仪器
[0216]
生理记录仪(ad instruments pl3508)；microfuge 22r centrifuge离心机(美国beckman coulter公司)；mx-s可调式混匀仪(大龙兴创实验仪器有限公司)；全自动生化分析仪(au480，beckman公司)；小动物麻醉剂机(吉泰)。
[0217]
3.实验动物
[0218]
spf级sd雄性小鼠200
±
20g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号scxk(沪)2022-0004。
[0219]
二、实验方法
[0220]
1.急性心肌缺血大鼠模型的建立与给药
[0221]
spf级雄性sd大鼠适应性喂养一周后，按体重分层分组法随机将大鼠分成8组，每组10只，连续灌胃给药5天。空白组和模型组：灌胃生理盐水；普萘洛尔组(阳性药组1)：20mg/kg/day；复方丹参滴丸组(阳性药组2)：75mg/kg/day；丹参茎叶总酚酸低剂量组(低剂量组1)：50mg/kg/day；丹参茎叶总酚酸高剂量组(高剂量组1)：200mg/kg/day；丹参茎叶总酚酸转化产物低剂量组(低剂量组2)：50mg/kg/day；丹参茎叶总酚酸转化产物高剂量组(高剂量组2)：200mg/kg/day。第6天开始连续3天的iso诱导造模，灌胃给药半小时后进行iso造模。iso造模方法：用生理盐水配制iso浓度20mg/ml，按50mg/kg造模剂量于大鼠颈背部多点皮下注射诱导急性心肌缺血模型，空白组用生理盐水。
[0222]
2.心肌电生理指标测定
[0223]
皮下注射iso两小时后将大鼠用异氟烷气麻，背位固定于解剖台，采用生理记录仪皮下ⅱ导联测定大鼠心电图指标，连续监测各组大鼠心电图变化2min。仪器所记录数据使用labchart分析。
[0224]
3.药效评价方法
[0225]
给大鼠灌胃给药及造模时，观察大鼠精神、活动、毛色等情况，同时在第5、6、7、8天，使用生理记录仪对给药造模前后大鼠的心电图变化进行记录。造模3天后，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取全血，室温静置2h后于低温超速离心机进行离心(4℃，3000rpm/min，10min)，分离得到的血清用于测定ldh、ck、ck-mb、ast；取血结束后，迅速取出心脏，用生理盐水清洗干净，滤纸吸干后称重，装入塑封袋后放液氮速冻，每组按随机数表法随机选取1只心脏用多聚甲醛进行固定，后进行he、masson染色用于病理切片分析。
[0226]
4.统计学处理
[0227]
实验结果采用spss 21.0进行统计分析，数据以平均数
±
标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(avona)，p《0.05时差异具有统计学意义。
[0228]
三、实验结果
[0229]
iso造模后，大鼠流涎、胸腔收缩较频繁、扎堆、少动且反应迟钝。经三天连续造模，模型组及w组死亡3只，p组死亡4只，d组死亡1只，死亡原因可能是由于注射iso后，血管收缩过于强烈引起心肌急性缺血及肺血管收缩强烈，造成急性心肌梗死所致。根据死亡情况，各给药组对iso诱导的急性心肌缺血均有良好的保护作用。长时间心肌缺血、缺氧，为减缓心肌供血不足情况，非坏死区心室发生代偿性肥大，以增强心肌功能，图10空白组和模型组在心的脏器系数上有显著差异(p《0.01)。转化产物给药组较丹参茎叶总酚酸给药组对心脏保护作用佳，低剂量优于高剂量。图11、12、13结果显示大鼠造模后心率显著增加，st段显著降
低(p《0.0001)，大鼠发生心内膜缺血。较模型组，各给药组心率值、st段降低均得到不同程度改善(p《0.01)，心率减缓、st段有所调高，转化产物给药组的保护效果优于丹参茎叶总酚酸。
[0230]
动物实验结束后，迅速取出心脏组织，生理盐水清洗干净血液后，滤纸吸干多余液体，再使用多聚甲醛进行固定，进行he和masson染色。图14结果模型组心脏组织出现明显缺血性损伤，排列紊乱，间质充血，细胞肿胀，炎细胞浸润明显。给药组中转化产物给药组的低、高剂量组的大鼠心脏组织心肌缺血损伤明显减轻，心肌纤维断裂情况及炎细胞浸润情况明显改善，细胞肿胀、排列紊乱等情况有所减轻，改善心肌细胞损伤效果优于丹参茎叶总酚酸给药组。图15结果表明模型组大鼠心脏心肌细胞排列紊乱，有大量呈蓝色的胶原纤维，缺血损伤明显，紫红色心肌组织明显减少；各给药组均能明显减少蓝染的胶原纤维，其中转化产物给药组镜下以紫红色的心肌细胞为主，蓝染的胶原纤维大量减少，改善心肌纤维化的效果优于丹参茎叶总酚酸组。
[0231]
大鼠取血后依据试剂盒的操作方法，测量大鼠血清中ck、ck-mb、ast、ldh的含量。由图16、17、18、19可知，模型组大鼠心肌细胞受到损伤，血清中ldh、ck、ast显著升高(p《0.01)；给药组均能有效下调ldh、ck、ast活性，转化前后低剂量组均能显著降低ck-mb水平，对心肌损伤均具有保护作用，低剂量优于高剂量组，转化产物给药组较丹参茎叶总酚酸能有效降低ldh水平。表明本发明所提供的转化产物具有很好的心肌保护功能，可有效保护心肌细胞免受急性心肌缺血带来的损害。
[0232]
实施例5抗氧化实验研究
[0233]
一、实验材料与药物
[0234]
1.实验仪器
[0235]
酶标仪(美国perkin-elmer公司)；bt125型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；anke gl-16gii型离心机(上海安亭科学仪器厂)。
[0236]
2.药物与试剂
[0237]
盐酸异丙肾上腺素(罗恩，cas 51-30-9)；医用生理盐水；异氟烷(瑞沃德)；超氧化物歧化酶(sod)试剂盒、丙二醛(mda)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)试剂盒、过氧化氢酶(cat)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
[0238]
受试药物：本发明实施例2制备得到的丹参茎叶总酚酸及转化产物。
[0239]
3.实验动物
[0240]
spf级sd雄性小鼠200
±
20g，购自南京中医药大学实验动物中心，合格证号scxk(沪)2022-0004。
[0241]
二、实验方法
[0242]
1.急性心肌缺血大鼠模型的建立与给药
[0243]
spf级雄性sd大鼠适应性喂养一周后，按体重分层分组法随机将大鼠分组，每组10只，连续灌胃给药5天。空白组和模型组：灌胃生理盐水；普萘洛尔组(阳性药组1)：20mg/kg/day；复方丹参滴丸组(阳性药组2)：75mg/kg/day；丹参茎叶总酚酸低剂量组(低剂量组1)：50mg/kg/day；丹参茎叶总酚酸高剂量组(高剂量组1)：200mg/kg/day；转化产物低剂量组(低剂量组2)：50mg/kg/day；转化产物高剂量组(高剂量组2)：200mg/kg/day。
[0244]
第6天开始连续3天的iso诱导造模，灌胃给药半小时后进行iso造模。iso造模方
法：用生理盐水配制iso浓度20mg/ml，按50mg/kg造模剂量于大鼠颈背部多点皮下注射诱导急性心肌缺血模型，空白组用生理盐水。
[0245]
2.药效评价方法
[0246]
各组大鼠末次给药结束后，以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉取全血，取血结束后，迅速取出心脏，用生理盐水清洗干净，滤纸吸干后称重，装入塑封袋后放液氮速冻。
[0247]
制备心肌组织匀浆液，按照试剂盒说明书操作，检测sod、gsh-px、cat、mda含量。
[0248]
3.统计学处理
[0249]
实验结果采用spss 21.0进行统计分析，数据以平均数
±
标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(avona)，p《0.05时差异具有统计学意义。
[0250]
三、实验结果
[0251]
1.生化指标测定结果
[0252]
动物实验结束后，制备心肌组织匀浆液，依据试剂盒的操作方法，测量大鼠心肌中sod、mda、gsh-px、cat的含量。由图20、21、22、23可以看出造模后，gsh-px、sod、cat活性降低，mda含量升高(p《0.0001)；各给药组均能有效下调mda，提高sod活性(p《0.0001)；转化产物高剂量给药组能显著上调gsh-px(p《0.05)，保护效果与阳性药复方丹参滴丸组差不多；转化产物低剂量给药组显著升高cat活性(p《0.0001)。表明本发明所提供的转化产物可有效清除自由基，具有很好的抗氧化功效，能有效减轻急性心肌缺血造成的心肌细胞氧化损伤。

技术特征：
1.一种具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞、心肌细胞的丹参茎叶总酚酸转化产物，其特征在于，所述转化产物采用以下制备方法制得：取丹参地上茎叶部分，热风干燥，粉碎机粉碎后过筛，得到丹参茎叶粗粉。加乙醇，回流提取，合并提取液，真空减压浓缩回收乙醇，并浓缩至无醇味，得到丹参茎叶提取液；取上述丹参茎叶提取液加水稀释，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，先用纯水洗至无醇味并除去杂质，20％乙醇洗脱部位和30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品；将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释，用盐酸调ph，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯部分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸；将得到的丹参茎叶酚酸加水稀释，用盐酸调节转化液ph，采用高温高压灭菌锅反应，真空冷冻干燥即得转化产物。2.根据权利要求1所述的具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞、心肌细胞的丹参茎叶总酚酸转化产物，其特征在于，所述转化产物采用以下制备方法制得：取丹参地上茎叶部分，40～50℃热风干燥，粉碎机粉碎后过药典3号标准筛，得到丹参茎叶粗粉。每次加10～15倍量60％乙醇，80℃～85℃低温回流提取1～3次，每次1～2h，合并提取液，真空减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味得到丹参茎叶提取液；上述丹参茎叶提取液加水稀释至每1ml含0.125～1.5g生药，用ab-8大孔树脂进行纯化，使用前用2～3倍体积95％乙醇充分溶胀树脂，湿法装柱，树脂质量与上样量比为2～3:1，树脂柱径高比为1:5～1:20，先用3～5bv纯水洗至无醇味并除去杂质，然后用3～5bv 20％乙醇洗脱部位和前1.5～2bv 30％乙醇洗脱部位作为丹参茎叶总酚酸部位，将收集的洗脱液减压浓缩回收乙醇并浓缩至无醇味，获得丹参茎叶粗制品；将上述的丹参茎叶粗制品加水稀释至每1ml含0.1～0.3g生药，5m盐酸调ph至2～3，两倍乙酸乙酯萃取3～5次，合并乙酸乙酯部分，真空减压浓缩回收乙酸乙酯并浓缩至干，得到丹参茎叶总酚酸；将得到的丹参茎叶酚酸加水稀释至每1ml含丹酚酸b10～20mg，用5m盐酸调节转化液ph＝3～5，采用高温高压灭菌锅，105～135℃反应2～4h，真空冷冻干燥即得转化产物。3.根据权利要求1或2所述的具有抗氧化活性、保护血管内皮细胞、心肌细胞的丹参茎叶总酚酸转化产物，其特征在于，所述转化产物包括下列重量百分比的活性成分：丹酚酸a 7～9％，丹参素15％～17％，原儿茶醛1％～2％，迷迭香酸13～15％，紫草酸1％～2％，丹酚酸b 3～4％。4.权利要求3所述的丹参茎叶总酚酸转化产物的测定方法，其特征在于，采用超高效液相色谱法测定丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸和丹酚酸b的含量，测定条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；检测波长280nm；流速0.4ml/min；柱温35℃；理论塔板数按丹酚酸a计应不低于10000；对照品溶液的制备精密称取丹酚酸a、丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b、丹酚酸c对照品适量至容量瓶中，加甲醇制成混合对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密称取丹参茎叶总酚酸转化产物样品10mg到5ml容量瓶中，加50％甲醇溶解摇匀，并稀释至刻度线，即得；以乙腈为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，梯度洗脱；测定法：分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各1ml至液相小瓶，自动进样，每次吸取2μl，测定，计算丹酚酸a、丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸b的含量。5.根据权利要求4所述的丹参茎叶总酚酸转化产物的测定方法，其特征在于，梯度洗脱条件为：0～1分钟时，乙腈的比例保持在5％，0.1％甲酸水溶液的比例保持在95％；1～3分钟时，乙腈的比例由5％升至10％，0.1％甲酸水溶液的比例由95％降至90％；3～7分钟时，乙腈的比例由10％升至15％，0.1％甲酸水溶液的比例由90％降至85％；7～11分钟时，乙腈的比例由15％升至21％，0.1％甲酸水溶液的比例由85％降至79％；11～15分钟时，乙腈的比例由21％升至33％，0.1％甲酸水溶液的比例由79％降至66％；15～17分钟时，乙腈的比例由33％升至70％，0.1％甲酸水溶液的比例由66％降至30％；17～18分钟时，乙腈的比例由70％升至80％，0.1％甲酸水溶液的比例由30％降至20％；18～20分钟时，乙腈的比例保持在80％，0.1％甲酸水溶液的比例保持在20％；20～21分钟时，乙腈的比例由80％降至5％，0.1％甲酸水溶液的比例由20％升至95％。6.权利要求1～3任一项所述的丹参茎叶总酚酸转化产物在制备保护血管内皮细胞、心肌细胞的药物中的应用。7.权利要求1～3任一项所述的丹参茎叶总酚酸转化产物在制备改善急性心肌缺血损伤药物中的应用。8.权利要求1～3任一项所述的丹参茎叶总酚酸转化产物在制备抗氧化药物中的应用。9.权利要求1～3任一项所述的丹参茎叶总酚酸转化产物在制备增强免疫力药物中的应用。10.根据权利要求5～8任一项所述的应用，其特征在于，将丹参茎叶总酚酸转化产物和药学上可接受的载体制成片剂、丸剂、散剂、汤剂、颗粒剂、煎膏剂或浸膏剂的药物。

技术总结
本发明公开了一种具有心肌保护功能的丹参茎叶总酚酸转化产物及其制备方法与应用，其中所述的转化产物是由丹参茎叶总酚酸用盐酸调节pH，再采用高温高压灭菌锅反应得到。本发明的转化产物中，丹酚酸A7～9％，丹参素15％～17％，原儿茶醛1％～2％，迷迭香酸13～15％，紫草酸1％～2％，丹酚酸B3～4％。本发明提供的丹参茎叶总酚酸转化产物具有抗氧化活性、保护心肌减轻氧化损伤活性、保护血管内皮细胞和心肌细胞的活性，并且具有清除自由基，减轻氧化损伤的作用，疗效可靠，安全性好，不良反应低，可用于制备一种保护心血管的药物。用于制备一种保护心血管的药物。用于制备一种保护心血管的药物。


技术研发人员：宿树兰 段金廒 张雯 陈量量 刘海峰
受保护的技术使用者：南京中医药大学
技术研发日：2023.06.07
技术公布日：2023/9/9