用于MDRV、GRV和NDRV鉴别检测的三重RT-PCR引物组及其试剂盒

用于mdrv、grv和ndrv鉴别检测的三重rt-pcr引物组及其试剂盒
技术领域
1.本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种用于番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒鉴别检测的三重rt-pcr引物组、试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.我国是养鸭、养鹅大国，水禽养殖的历史悠久。近年来，随着我国水禽养殖的技术、设备的更新以及规模、市场的扩张，水禽呼肠孤病毒(waterflow reovirus,wrv)成为制约水禽养殖业可持续发展不可忽视的一个危害，其引起的疾病对水禽养殖业造成了严重的威胁。水禽呼肠孤病毒可根据宿主以及基因型主要分为番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,mdrv)、新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,ndrv)和鹅呼肠孤病毒(goose reovirus,grv)三类。
3.番鸭呼肠孤病毒引起的番鸭呼肠孤病毒病于1950年首次报道于南非，上世纪90年代以来，我国番鸭群也出现了此病。该病主要感染雏番鸭，感染之后主要以有软脚，腹泻为临床病变特征，以肝、脾表面和切面有大量灰白色针尖状坏死点为主要病变，故俗称番鸭“肝白点病”或“花肝病”，在番鸭的养殖中有较高的发病率和死亡率，发病耐过鸭成为僵鸭，已经是影响其番鸭养殖业的重要疾病之一。
4.鹅呼肠孤病毒主要侵害3周龄以内雏鹅，患病鹅主要表现精神不振、软脚、排白色稀粪，发病率与死亡率与日龄密切相关，日龄越小发病越严重，剖检典型病变为肝脏、脾脏有大量白色或者黄白色针尖状坏死点，临床症状与番鸭呼肠孤病毒病非常类似，严重危害了我国养鹅业的健康发展。
5.新型鸭呼肠孤病毒病俗称鸭出血坏死性肝炎，是2005年以来在我国新出现的一种危害养鸭业的传染病，临床上以肝脏不规则坏死和出血混杂、心肌出血、脾脏肿大斑块状坏死、肾脏和法氏囊出血等为主要特征的疫病，各种品种鸭(如番鸭、半番鸭、麻鸭、北京鸭等)均可发生；发病日龄约为3～25日龄，其中以5～l0日龄居多，病程5～7d，发病率5％～20％、死亡率2％～15％，日龄愈小或并发感染时其发病率死亡率愈高，给养鸭业造成一定的经济损失，其在血清学、基因型、抗原性、致病性等方面均不同于番鸭呼肠孤病毒病。
6.聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)是一种体外快速扩增dna的技术，操作简单、便捷，3-5小时即可获得可靠结果，这些优势使得pcr技术已经成为病原检测最常用的技术。在水禽呼肠孤病毒的诊断领域也不例外，如林锋强等人在2005年建立了番鸭呼肠孤病毒rt-pcr检测方法(林锋强,胡奇林,欧阳岁东等.番鸭呼肠病毒的分离与rt-pcr鉴定[j].动物医学进展,2005(11):68-69.)，王劭等人在2011年建立了新型鸭呼肠孤病毒rt-pcr检测方法(王劭,陈少莺,陈仕龙等.新型鸭呼肠孤病毒rt-pcr方法的建立与应用[j].农业生物技术学报,2011,19(02):388-392.)。
[0007]
多重pcr(multiplex polymerase chain reaction，mpcr)又称复合pcr，有别于单一pcr，可以对单一样品同时进行多种不同病原的检测，具有灵敏性高、效率高、特异性强、
经济效益高等优点，在试验过程中多重pcr也会大大降低因样品、试剂或引物污染而产生假阳性的概率，以方便、快速、准确地进行相关流行病学监测。
[0008]
多重pcr具有其显著的技术优点，但建立多重pcr时需要克服的技术问题也较多，其不仅要考虑引物与对应的待检测病毒的特异性，还要考虑各引物间的互相干扰问题、引物互相之间不能结合、在退火温度和延伸时间接近的情况下，如果最后利用电泳分离，还要避免扩增产物间的大小不能太接近等等一系列问题。另外，由于mdrv、grv和ndr都是危害水禽的呼肠孤病毒，它们之间的核苷酸序列同源性较高，特别是mdrv和鹅源番鸭呼肠孤病毒之间的核苷酸同源性达90％以上。尽管目前已经报道过mdrv、grv和ndrv单一rt-pcr和针对mdrv和ndrv的双重rt-pcr的检测方法，但建立能同时鉴别诊断mdrv、grv和ndrv这三种水禽呼肠孤病毒的检测方法难度很大，三重检测方法至今仍未见报道，因此建立mdrv、grv和ndrv三重rt-pcr检测方法，可为水禽养殖中三种水禽呼肠孤病毒的病原监测以及疾病防控提供技术支持，具有较好的创新性和临床应用价值。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的在于提供一种检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr引物组及其试剂盒，同时利用所述三重rt-pcr引物组建立检测鉴别番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr检测方法，以解决上述现有的技术问题。本发明建立的三重rt-pcr检测方法可以对病原进行快速、准确的鉴别诊断，可为mdrv、grv和ndrv这三种病毒感染的流行病学调查及科学精准防控提供有效的检测手段，对后续这三种水禽呼肠孤病毒的研究提供帮助。
[0010]
本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0011]
一种检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr引物组，所述引物组包括：
[0012]
扩增mdrv病毒的引物对序列：
[0013]
mdrv-f：5'-ttacccttcccatccgacctc-3'；
[0014]
mdrv-r：5'-gttcatagcgaagccctgct-3'；
[0015]
扩增grv病毒的引物对序列：
[0016]
grv-f：5'-tgaagtccgacaaccctacc-3'；
[0017]
grv-r：5'-cgtcattgtccacggatcca-3'；
[0018]
扩增ndrv病毒的引物对序列：
[0019]
ndrv-f：5'-atgtcgaggactgttggatg-3'；
[0020]
ndrv-r：5'-cagcacatgtaaagcacgac-3'。
[0021]
一种用于检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的检测试剂盒，其包括所述的引物组。
[0022]
采用诺唯赞公司的iii 1st strand cdnasynthesis kit(+gdnawiper)反转录试剂盒，参照反转录试剂盒说明书对病毒rna反转录成cdna样品。
[0023]
所述的检测试剂盒，其pcr反应体系为：
[0024]
在20μl总体系中含有以下成分：dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，浓度为10μmol/l的mdrv-f和mdrv-r混合引物0.55μl，浓度为10μmol/l的grv-f和grv-r混合引
物0.3μl，浓度为10μmol/l的ndrv-f和ndrv-r混合引物0.4μl，pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv质粒混合模板3μl(在具体的检测操作中，pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv质粒混合模板可以替换为待检测核酸模板，即待检测核酸模板3μl)，加双蒸水补足至20μl。
[0025]
所述的检测试剂盒，除了包括上述pcr反应体系，还包括阳性对照物；所述阳性对照物由分别含有mdrv、grv和ndrv基因组片段的阳性质粒pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv等量混合制得。
[0026]
所述的检测试剂盒，其优化后的pcr反应过程为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，57.7℃退火30sec，72℃延伸1min，共39个循环，72℃延伸5min。
[0027]
所述检测试剂盒可同时对番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒进行鉴别检测，其判定方法为：测试扩增产物的电泳图，通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断待测样品是否为番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的单一感染或混合感染；其中，mdrv病毒对应的扩增产物片段长度为708bp，grv病毒对应的扩增产物片段长度为324bp，ndrv病毒对应的扩增产物片段长度为198bp。
[0028]
本发明还提供所述的三重rt-pcr引物组在制备鉴别检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒检测试剂或检测试剂盒中的应用。
[0029]
本发明还提供一种利用所述的三重rt-pcr引物组鉴别检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr检测方法。该方法大致的过程为：待测样品参照反转录试剂盒说明书对病毒rna反转录成cdna样品，以反转录后的cdna样品为模板，利用所述引物组进行三重rt-pcr反应；之后，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述引物组中各引物对序列的添加量为：扩增mdrv病毒的引物对序列：扩增grv病毒的引物对序列：扩增ndrv病毒的引物对序列＝0.55：0.3：0.4。
[0030]
鉴别检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr检测方法，具体包括以下步骤：
[0031]
1)查找番鸭呼肠孤病毒mdrv、鹅呼肠孤病毒grv和新型鸭呼肠孤病毒ndrv的保守区序列：
[0032]
2)根据genbank上公布的mdrv病毒的σns基因、grv病毒的λap基因和ndrv病毒的σns基因序列信息，分别设计上下游引物对即所述的三重rt-pcr引物组，所述三重rt-pcr引物组包括：
[0033]
扩增mdrv病毒的引物对序列：
[0034]
mdrv-f：5'-ttacccttcccatccgacctc-3'
[0035]
mdrv-r：5'-gttcatagcgaagccctgct-3'；
[0036]
扩增grv病毒的引物对序列：
[0037]
grv-f：5'-tgaagtccgacaaccctacc-3'；
[0038]
grv-r：5'-cgtcattgtccacggatcca-3'；
[0039]
扩增crv病毒的引物对序列：
[0040]
ndrv-f：5'-atgtcgaggactgttggatg-3'；
[0041]
ndrv-r：5'-cagcacatgtaaagcacgac-3'。
[0042]
3)进行三重rt-pcr反应：以待测样品为模板，以上述三组序列为引物，进行三重rt-pcr反应，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；反应体系中，三组引物的添加量符合扩增
mdrv病毒的引物对：扩增grv病毒的引物对：扩增ndrv病毒的引物对＝0.55：0.3：0.4。
[0043]
其中，优化后，步骤3)pcr反应过程为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，57.7℃退火30sec，72℃延伸1min，共39个循环，72℃延伸5min；
[0044]
步骤3)中所述pcr反应体系总体积为20μl，包括：dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，浓度为10μmol/l的mdrv-f和mdrv-r混合引物0.55μl；浓度为10μmol/l的grv-f和grv-r混合引物0.3μl；浓度为10μmol/l的ndrv-f和ndrv-r混合引物0.4μl；pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv质粒混合模板3μl(在具体的检测操作中，pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv质粒混合模板可以替换为待检测核酸模板，即待检测核酸模板3μl)，加双蒸水补足至20μl。
[0045]
进一步，步骤3)中对所述mdrv病毒的扩增产物片段长度为708bp，grv病毒的扩增产物片段长度为324bp，ndrv病毒的扩增产物片段长度为198bp。通过观察扩增产物电泳图是否包含相应病毒对应的预期条带，来判断待测样品是否为番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的单一感染或混合感染。
[0046]
另外，步骤2)中所述mdrv病毒的gene bank序列号为dq066923.1；
[0047]
步骤2)中所述grv病毒的gene bank序列号为mz546418.1。
[0048]
步骤2)中所述ndrv病毒的gene bank序列号为om930743.1。
[0049]
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
[0050]
1.本发明建立了对三种水禽呼肠孤病毒(mdrv、grv和ndrv)的三重rt-pcr检测方法，引物设计及反应条件的优化是在多重pcr成功建立的关键技术，而多重pcr主要存在的问题是扩增效率不均衡。本发明在引物选择上尽量将片段大小的差距缩小，在引物筛选环节，设计了多对引物用于扩增mdrv、grv和ndrv，最后筛选出扩增片段大小相近的3对引物，从而有效减少了扩增效率不均衡的影响，电泳结果表明目的条带准确、清晰、区分度强。
[0051]
2.本发明通过构建三种病原的阳性标准质粒，对反应体系进一步优化，提供了合适的反应体系，该方法可以对单一样品同时进行三种不同病原的检测，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，另外，三重pcr在试验过程中也会降低因为污染而造成的假阳性率。
[0052]
3.在水禽疫病的流行病学监测中发现，mdrv、grv和ndrv在我国各地的水禽养殖场均有不同程度的感染，且水禽呼肠孤病毒感染会对禽类免疫器官造成损伤，从而会继发引起其他病原体混合感染，因此，本研究建立的三重rt-pcr体系可以很好地适用于临床检测，为水禽养殖中三种病毒的病原监测以及疾病防控提供技术支持。
[0053]
4.本发明设计了多对引物用于扩增mdrv、grv和ndrv，最后筛选出扩增片段大小相近的3对引物，从而有效减少了扩增效率不均衡的影响。
[0054]
5.利用本发明，可以对单一样品同时进行三种水禽呼肠孤病毒(mdrv、grv和ndrv)的检测，目的条带准确、清晰、区分度强，具有灵敏性高、特异性强、省时省力等优点，也会降低因为污染而造成的假阳性率。
[0055]
6.利用本发明，当多种疫病同时混合感染时，多重pcr检测方法使得混合感染的诊断变得方便可行，同时对病毒含量较低的病原也能够达到快速准确的检测。
附图说明
[0056]
图1为本发明实施例中退火温度57.7℃时，三重rt-pcr条件优化电泳图，其中，m：
dna marker dl2000；1：mdrv；2：grv；3：ndrv；4～11：46.2℃、48.6℃、51℃、53.5℃、54.9℃、57.7℃、59.9℃、61℃；12：阴性对照。
[0057]
图2为本发明实施例中特异性鉴定电泳图，其中，m：dna marker dl2000；1：mdrv、grv、ndrv混合液；2：mdrv；3：grv；4：ndrv；5：cgpv；6：mdpv；7：mdgpv；8：sbdsv；9：dadv b2；10：aiv h9亚型；11：dev；12：dtmuv；13：阴性对照
[0058]
图3为本发明实施例中的敏感性鉴定电泳图。m：dna marker dl2000；1～9：分别为3个阳性质粒依次从109～101进行倍比梯度稀释后的拷贝数，其中，
[0059]
1.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：6.72
×
109copies
·
μl-1
、6.68
×
109copies
·
μl-1
、6.11
×
109copies
·
μl-1
；
[0060]
2.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：6.72
×
108copies
·
μl-1
、6.68
×
108copies
·
μl-1
、6.11
×
108copies
·
μl-1
；
[0061]
3.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：6.72
×
107copies
·
μl-1
；6.68
×
107copies
·
μl-1
；6.11
×
107copies
·
μl-1
；
[0062]
4.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：6.72
×
106copies
·
μl-1
；6.68
×
106copies
·
μl-1
；6.11
×
106copies
·
μl-1
；
[0063]
5.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：：6.72
×
105copies
·
μl-1
；6.68
×
105copies
·
μl-1
；6.11
×
105copies
·
μl-1
；
[0064]
6.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：：6.72
×
104copies
·
μl-1
；6.68
×
104copies
·
μl-1
；6.11
×
104copies
·
μl-1
；
[0065]
7.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：：6.72
×
103copies
·
μl-1
；6.68
×
103copies
·
μl-1
；6.11
×
103copies
·
μl-1
；
[0066]
8.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：：6.72
×
102copies
·
μl-1
；6.68
×
102copies
·
μl-1
；6.11
×
102copies
·
μl-1
；
[0067]
9.mdrv、grv、ndrv对应的拷贝数分别为：：6.72
×
101copies
·
μl-1
；6.68
×
101copies
·
μl-1
；6.11
×
101copies
·
μl-1
；
[0068]
10：阴性对照。
具体实施方式
[0069]
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
[0070]
病毒rna抽提试剂盒fastpure viral dna/rna mini kit、反转录试剂盒iii 1st strand cdnasynthesis kit(+gdnawiper)、dna片段胶回收试剂盒fastpure gel dna extraction mini kit和rnase-free ddh2o购自诺唯赞公司；dream taq green pcr master mix(2
×
)购自thermo生物公司；核酸分子量标准物marker(dl-2000)、pmd18-t vector cloning kit购自takara公司；小量质粒抽提试剂盒购自axygen公司；琼脂糖购自biowest公司；无水乙醇购自西陇科学股份有限公司；lb液体培养基及含氨苄的lb固体培养基由实验室按照本领域常规配比配制。
[0071]
实施例建立番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr检测方法，包括以下步骤：
[0072]
1.设计引物
[0073]
根据genbank上公布的mdrv病毒的σns基因，gene bank序列号为dq066923.1；grv病毒的λap基因，gene bank序列号为mz546418.1和ndrv病毒的σns基因，gene bank序列号为om930743.1的序列信息，分别设计引物并合成，参见表1。
[0074]
表1
[0075][0076]
2.提取rna、合成cdna .
[0077]
2.1样品处理
[0078]
福建、江苏等地鹅场、鸭场采集病料，采集的脏器研磨后，用hank’s液进行稀释，反复冻融3次，漩涡震荡1min，经3000r
·
min-l
离心10min，取200μl上清液放-20℃保存，供rna提取用。
[0079]
2.2提取rna
[0080]
用诺唯赞fastpure viral dna/rna mini kit试剂盒提取。上述样品中的病毒总rna，参照试剂盒说明书，本实施例过程中均使用无rna酶的ep管和枪头。具体操作为：
[0081]
1)取200μl样品，加入500μl的buffer vl，涡旋混匀15-30sec，将混合液瞬时离心收集至管底；
[0082]
2)转移混合液至fastpure rna columns中，12000rpm(13400
×
g)离心1min，弃滤液；
[0083]
3)加入600μl buffer rw，12000rpm(13400
×
g)离心30sec；
[0084]
4)弃滤液，重复步骤3，空柱12000rpm(13400
×
g)离心2min；
[0085]
5)取50μl rnase-free ddh2o，室温放置1min，12000rpm(13400
×
g)离心2min，洗脱rna；
[0086]
2.3合成cdna
[0087]
按诺唯赞iii 1st strand cdnasynthesis kit(+gdnawiper)反转录试剂盒说明书反转录为cdna样品，操作步骤如下：
[0088]
1)rna模板变性：在rnase-free离心管中配制如下混合液：取8μl病毒rna，65℃加热5min，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2min。
[0089]
2)基因组dna去除：上一步的rna溶液中加入2μl 5x gdnawiper mix，用移液器轻轻吹打混匀。42℃加热2min。
[0090]
3)配制第一链cdna合成反应液：上一步的混合液10μl；10
×
rt mix 2μl；hiscriptⅲenzyme mix 2μl；random hexamers 1μl；rnase-free ddh2o 5μl，用移液器轻轻吹打混匀。按下列条件进行第一链cdna合成反应：25℃5min；37℃45min；85℃5sec。所得产物即为cdna。
[0091]
3.构建病毒阳性质粒标准品
[0092]
以上述cdna为模板，利用表1中的引物进行pcr扩增，回收pcr扩增产物，将回收的目的片段克隆入pmd-18-t载体，并转化dh5α感受态；挑取单个菌落进行菌液pcr鉴定，将疑似阳性质粒送公司测序；在ncbi数据库内进行序列比对，将测序正确的阳性质粒于-20℃保存备用。
[0093]
其中，pcr反应体系20μl，dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，上、下游引物各0.5μl，1μl模板，用ddh2o补至20μl。pcr反应条件：预变性95℃3min；变性95℃15sec；退火56℃30sec；延伸72℃1min共39个循环；彻底延伸72℃5min；
[0094]
用微量核酸浓度分析仪分别检测含有mdrv、grv和ndrv基因组片段的阳性质粒pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv的浓度，浓度分别为250ng
·
μl-1
、210.5ng
·
μl-1
、202ng
·
μl-1
，根据公式：质粒拷贝数(copies/μl)＝c
×
10-9
×
6.02
×
10
23
/(m
×
660)，其中c为质粒浓度(ng/μl)，m为质粒的碱基数，计算出质粒标准品拷贝数分别为6.72
×
10
10
copies
·
μl-1
、6.68
×
10
10
copies
·
μl-1
与6.11
×
10
10
copies
·
μl-1
。将3个质粒标准品溶液10倍稀释成109、108、107、106、105、104、103、102、101copies/μl-1
，再将其等量混合即为阳性对照质粒标准品。
[0095]
4.优化pcr反应体系
[0096]
pcr反应体系为20μl，其中加入dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv阳性混合质粒模板3μl，引物的起始浓度均为10μmol/l，引物体积在0.5μl-1.0μl之间调整，以确定最适宜的引物体积；在最佳引物量确定的基础上，进一步优化反应的退火温度，退火温度选择在46.2℃-61℃范围内进行优化，以确定最适宜的退火温度。
[0097]
退火温度57.7℃，可以扩增到目的条带，且可以清晰区分三个目的条带，参见图1。
[0098]
通过对引物浓度和退火温度的优化，最终确定的pcr反应体系为：dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，mdrv-f/mdrv-r(10μmol/l)混匀后加0.55μl，grv-f/grv-r(10μmol/l)混匀后加0.3μl，ndrv-f/ndrv-r(10μmol/l)混匀后加0.4μl，模板3μl，加双蒸水补足至20μl；
[0099]
最佳反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性30sec，57.7℃退火30sec，72℃延伸1min，共39个循环，72℃延伸5min。
[0100]
5.特异性试验
[0101]
按照2.2步骤，提取小鹅瘟病毒(cgpv)、番鸭细小病毒(mdpv)、番鸭小鹅瘟病毒(mdgpv)、鸭短喙矮小综合征病毒(sbdsv)、鸭瘟病毒(dev)、鸭腺病毒b2型(dadv b2)的病毒dna；利用2.3步骤，提取番鸭呼肠孤病毒(mdrv)、鹅呼肠孤病毒(grv)、新型鸭呼肠孤病毒(ndrv)、禽流感病毒h9亚型(aiv h9)、鸭坦布苏病毒(dtmuv)的病毒核酸，并按诺唯赞iii 1st strand cdna synthesis kit(+gdna wiper)反转录试剂盒说明书反转录为cdna样品。
[0102]
利用步骤4优化后的pcr反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30sec，57.7℃退火30sec，72℃延伸1min，共39个循环，72℃延伸5min，检测pmd18-mdrv、pmd18-grv、pmd18-ndrv阳性质粒模板和cgpv、mdpv、mdgpv、sbdsv、dev、dadv b2病毒dna模板以及aiv h9、dtmuv的cdna模板。以检测所建立的三重rt-pcr体系的特异性，结果参见图2。
[0103]
由图2可见，检测pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv阳性混合质粒，均能得到预期的条带；而对cgpv、mdpv、mdgpv、sbdsv、dev、dadv b2的病毒dna检测没有条带出现，aiv h9、dtmuv的cdna模板检测也没有条带出现，说明该方法具有较好的特异性。
[0104]
6.敏感性试验
[0105]
将步骤3中稀释后等量混合的阳性对照质粒标准品溶液pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv，加入到步骤4的pcr体系，利用最佳引物体积和最适宜反应温度分别进行扩增，以检测pcr体系的敏感性，结果参见图3。
[0106]
从图3中可以看出，利用该三重rt-pcr扩增体系，pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv阳性质粒模板稀释至6.72
×
103copies
·
μl-1
、6.68
×
103copies
·
μl-1
与6.11
×
103copies
·
μl-1
后，仍能扩增出相应的目的条带，表明具有较好的敏感性。
[0107]
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr引物组，其特征在于：所述引物组包括：扩增mdrv病毒的引物对序列：mdrv-f：5'-ttacccttcccatccgacctc-3'；mdrv-r：5'-gttcatagcgaagccctgct-3'；扩增grv病毒的引物对序列：grv-f：5'-tgaagtccgacaaccctacc-3'；grv-r：5'-cgtcattgtccacggatcca-3'；扩增ndrv病毒的引物对序列：ndrv-f：5'-atgtcgaggactgttggatg-3'；ndrv-r：5'-cagcacatgtaaagcacgac-3'。2.一种用于检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的检测试剂盒，其特征在于：其包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：其pcr反应体系为：在20μl总体系中含有以下成分：dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，浓度为10μmol/l的mdrv-f和mdrv-r混合引物0.55μl，浓度为10μmol/l的grv-f和grv-r混合引物0.3μl，浓度为10μmol/l的ndrv-f和ndrv-r混合引物0.4μl，pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv质粒混合模板3μl，加双蒸水补足至20μl。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：它还包括阳性对照物；所述阳性对照物由分别含有mdrv、grv和ndrv基因组片段的阳性质粒pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv等量混合制得。5.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：其pcr反应过程为：95℃预变性3min，95℃变性30s，57.7℃退火30s，72℃延伸1min，共39个循环，72℃延伸5min。6.一种利用权利要求1所述的三重rt-pcr引物组鉴别检测番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒的三重rt-pcr检测方法，该方法不以诊断为目，其特征在于：以待测样品为模板，利用所述引物组进行三重rt-pcr反应；之后，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测；其中，所述引物组中各引物对序列的添加量为：扩增mdrv病毒的引物对序列：扩增grv病毒的引物对序列：扩增ndrv病毒的引物对序列＝0.55：0.3：0.4。7.根据权利要求6所述的三重rt-pcr检测方法，其特征在于：所述pcr反应的反应体系总体积为20μl，包括：dream taq green pcr master mix(2
×
)10μl，浓度为10μmol/l的mdrv-f和mdrv-r混合引物0.55μl；浓度为10μmol/l的grv-f和grv-r混合引物0.3μl；浓度为10μmol/l的ndrv-f和ndrv-r混合引物0.4μl；pmd18-mdrv、pmd18-grv和pmd18-ndrv质粒混合模板3μl，加双蒸水补足至20μl；pcr反应过程为：95℃预变性3min，95℃变性30s，57.7℃退火30s，72℃延伸1min，共39个循环，72℃延伸5min。8.根据权利要求6所述的三重rt-pcr检测方法，其特征在于：所述三重rt-pcr反应对mdrv病毒的扩增产物片段长度为708bp，grv病毒的扩增产物片段长度为324bp，ndrv病毒的
扩增产物片段长度为198bp。

技术总结
本发明涉及用于番鸭呼肠孤病毒、鹅呼肠孤病毒和新型鸭呼肠孤病毒鉴别检测的三重RT-PCR引物组及其试剂盒，引物组的序列如SEQ ID NO.1-6。本发明的三重PCR反应，3组引物的添加量比为0.55：0.3：0.4。本发明建立了对三种水禽呼肠孤病毒的三重RT-PCR检测方法，引物设计及反应条件的优化是多重PCR成功建立的关键技术，多重PCR主要存在的问题是扩增效率不均衡。本发明在引物选择上将片段大小的差距缩小，在引物筛选环节，设计了多对引物用于扩增MDRV、GRV和NDRV，最后筛选出扩增片段大小相近的3对引物，从而有效减少了扩增效率不均衡的影响，电泳结果表明目的条带准确、清晰、区分度强。区分度强。区分度强。


技术研发人员：陈仕龙 胥焯然 陈少莺 程晓霞 王劭 郑敏 肖世峰
受保护的技术使用者：福建省农业科学院畜牧兽医研究所
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/9