丁香假单胞菌噬菌体及其应用的制作方法

1.本公开属于微生物领域及生物防治领域，具体涉及一株丁香假单胞菌噬菌体及其应用。


背景技术：

2.植物细菌性疾病目前在全球范围内严重作物种植产业，对这类病原菌的防治往往局限在使用抗生素或化学农药，但容易产生具有耐药性的新的病原菌。
3.噬菌体是一类细菌病毒的总称，可特异性裂解宿主菌，但对非靶向的细菌和动植物无毒，不会破坏微生物的多样性，满足当代提倡的绿色无公害农业要求。因此噬菌体疗法在细菌性病害的生物防治中具有巨大潜力。目前噬菌体已经在人类疾病、水产动物疾病及植物病害中有少量应用。但应用噬菌体制剂防治由丁香假单胞菌引起的植物病害还较为欠缺。该噬菌体的开发不仅积极配合我国农药减量的战略目标，还能够有效推动相关种植产业绿色可持续发展。


技术实现要素：

4.本公开提供了一种能够有效杀灭丁香假单胞菌而可应用于植物病害特别是猕猴桃溃疡病生物防治的噬菌体。本公开的丁香假单胞菌噬菌体能够高效杀灭植物体内及果园环境中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，具有较高的紫外线稳定性与ph稳定性、对病原菌裂解性优秀、环境友好等特点，在植物病害特别是猕猴桃溃疡病的生物防治中有较好的应用前景。其易于制备喷洒液或淋洗液，能够广泛应用于农药添加剂、消毒剂和清洁剂等。
5.本公开的一方面提供了一种丁香假单胞菌噬菌体，所述丁香假单胞菌噬菌体为丁香假单胞菌噬菌体(pseudomonas phage)，于2023年5月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmcc 45569。
6.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体为rna噬菌体。
7.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体具有seq id no:1所示的表面蛋白基因。
8.本公开的丁香假单胞菌噬菌体在固体培养基上可以产生边缘清晰的透亮空斑，周围无晕环，培养18h后直径为2～4mm；经透射电子显微镜观察发现，该丁香假单胞菌噬菌体具有典型的球状结构，直径约80～100nm，经鉴定该丁香假单胞菌噬菌体属囊状噬菌体科，假单胞菌噬菌体phi 6(pseudomonas phage phi6)。
9.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体的感染复数为0.001，效价达到10
10
pfu/ml，具有较好的扩繁性能。
10.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体的潜伏期约为45min，爆发期约为60min，与同类噬菌体相比具有潜伏期短，爆发量大的优势。
11.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体在ph 4-11的环境下活性较为稳定。
12.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体在50℃以下的温度下活性较为稳
定。
13.在一些实施方式中，所述丁香假单胞菌噬菌体在紫外条件下保持30min以上的稳定活性。
14.本公开提供的上述丁香假单胞菌噬菌体是从土壤环境中分离得到的一株新的噬菌体，能够特异地感染并裂解丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，而不会杀死其他细菌，对正常菌群不会造成额外影响。噬菌体作为细菌病毒，不受细菌耐药性影响，在应用中也不引起药物残留等问题，具有安全性高和环境友好的特点。一般的噬菌体对于紫外线的耐受性较差，暴露在紫外光中超过15min就会引起效价的显著降低，并在60min左右降低2个数量级左右的效价，在日间紫外强度较高的田间环境中不够稳定。而上述丁香假单胞菌噬菌体则可以在相同的紫外条件中保持30min以上的高效价，具有良好的紫外耐受性。上述丁香假单胞菌噬菌体还具有良好的ph耐受性，其可以在4-11的ph环境中保持较高的效价。优秀的紫外耐受性和ph稳定性均有利于高浓度的该噬菌体在条件复杂的田间环境中维持更长时间的活性，将更稳定地持续裂解病原菌从而控制疾病的进程。
15.本公开的另一方面提供了一种生物制剂，其包括上述丁香假单胞菌噬菌体，作为生物制剂的活性成分。
16.在一些实施方式中，所述生物制剂可以是农业杀菌剂、消毒剂、清洁剂或其添加剂等。
17.在一些实施方式中，所述生物制剂可以是单一制剂，或复配制剂。作为优选，所述生物制剂是已纯化的丁香假单胞菌噬菌体制备的单一制剂，或是以纯化丁香假单胞菌噬菌体为主要成分制备的复配制剂，例如为抑制丁香假单胞菌污染的多种产品的主要成分，包括农药添加剂、果园消毒剂和农具清洁剂等。
18.在一些实施方式中，所述生物制剂的剂型可以是液体制剂，或冻干制剂。在一些实施方式中，所述生物制剂可以采取溶液、混悬液、乳液、粉末、片剂、喷雾剂、注射剂等的形式。
19.在一些实施方式中，所述生物制剂还包括添加剂成分，例如稀释剂、辅药、表面活性剂、赋形剂、媒介物、分散剂、稳定剂、填料和溶剂等，具体使用的载体成分可以由本领域技术人员结合本公开以及实际的应用领域以及本领域常识进行确定。
20.本公开的又一方面提供了上述的丁香假单胞菌噬菌体或上述的生物制剂在防治丁香假单胞菌及其猕猴桃致病变种(pseudomonas syringae pv.actinidiae，psa)所致植物病害中的应用。
21.在一些具体实施方式中，所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种可以为psabj530(cgmcc1.19157)或丁香假单胞菌atcc 21781、atcc 19310、atcc 49211等。
22.在一些实施方式中，所述植物病害是丁香假单胞菌引起的细菌性疾病，例如为猕猴桃溃疡病、黄瓜细菌性角斑病、番茄细菌叶斑病、菜豆晕疫病和/或烟草野火病。在一些具体实施方式中，所述植物病害是猕猴桃溃疡病。
23.本公开的丁香假单胞菌噬菌体对丁香假单胞菌或丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(psa)有良好的裂解效果。该丁香假单胞菌噬菌体能够在显著降低植物体内病原菌浓度，治疗效果优于已报道的同类噬菌体，说明该丁香假单胞菌噬菌体可有效杀灭丁香假单胞菌致病菌，对其引起的植物病害具有较好的防治功能。
24.本公开的又一方面还提供了一种防治丁香假单胞菌所致植物病害的方法，其包括采用所述生物制剂对植物进行处理。
25.在一些实施方式中，所述处理包括对植物表面喷洒所述生物制剂。
26.在一些具体实施方式中，所述生物制剂为农业杀菌剂，所述处理包括将所述农业杀菌剂喷洒于猕猴桃叶面，用于防治猕猴桃溃疡病。
27.在一些实施方式中，所述处理包括将所述生物制剂注射于植物体内，例如以打吊瓶的方式注入植物体内。
28.本公开的又一方面还提供了一种防治果园环境中丁香假单胞菌的污染的方法，其包括采用所述生物制剂对果园环境进行处理。
29.在一些实施方式中，所述处理包括对环境表面喷洒所述生物制剂，或将所述生物制剂注射于植物体内。
30.在一些实施方式中，所述生物制剂为消毒剂或清洁剂，将所述消毒剂或清洁剂喷洒于果园环境，例如喷洒于植物表面、种植土壤、果园空气及地表水、农用器具等，或以打吊瓶的方式注入植物体内。
31.本公开的丁香假单胞菌噬菌体土壤消毒实验证实了使用106pfu/ml浓度的丁香假单胞菌噬菌体可有效的杀灭土壤环境中污染的宿主菌。
32.本公开的又一方面提供了一种试剂盒，其包括上述丁香假单胞菌噬菌体。
33.在一些实施方式中，所述试剂盒用于丁香假单胞菌的快速检测或对临床样本中的目标致病菌筛选。
34.本发明的丁香假单胞菌噬菌体可以应用于丁香假单胞菌的快速检测，包括但不限于以试纸、试纸盒等形式对丁香假单胞菌进行检测，或对临床样本中的目标致病菌进行筛选，有效确保检测的灵敏度。
35.本公开提供了一株新发现的丁香假单胞菌噬菌体，能够高效杀灭植物体内及果园环境中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，具有较高的紫外线稳定性与ph稳定性、对病原菌裂解性优秀、环境友好等特点，在猕猴桃溃疡病的生物防治中有较好的应用前景。其易于制备喷洒液或淋洗液，能够广泛应用于农药添加剂、消毒剂和清洁剂等。该噬菌体可制备成单一制剂使用，也具有与其他噬菌体复配制成噬菌体鸡尾酒的应用潜力。
36.生物材料保藏信息：
37.本公开的丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02，于2023年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为cgmcc)，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。其保藏编号为cgmcc 45569，分类命名为假单胞菌噬菌体(pseudomonas phage)。
附图说明
38.图1示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的噬菌斑照片。
39.图2示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02基因组的琼脂糖凝胶电泳结果。
40.图3示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的透射电镜照片。
41.图4示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的一步生长曲线。
42.图5示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的ph稳定性曲线。
43.图6示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的热稳定性测曲线。
44.图7示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的紫外线稳定性曲线。
45.图8示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的体外裂解效果图。
46.图9示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的体内安全性测试结果。
47.图10示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02对猕猴桃溃疡病的体内治疗实验结果。
48.图11示出了丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的土壤消毒实验结果。
具体实施方式
49.本公开提供了一种能够有效杀灭丁香假单胞菌，可应用于植物病害例如猕猴桃溃疡病生物防治的丁香假单胞菌噬菌体。通过实验测定上述丁香假单胞菌噬菌体的生物学特性，结果如下：
50.1.通过最佳感染复数测定实验得出，该丁香假单胞菌噬菌体的感染复数为0.001，具较好的扩繁性能；
51.2.通过一步生长曲线测定得出，该丁香假单胞菌噬菌体的潜伏期约为45min，爆发期约为60min；
52.3.ph、温度及紫外线稳定性实验结果表明，与同类噬菌体相比该丁香假单胞菌噬菌体具有更好的环境稳定性，在ph 4-11的环境下性能较为稳定、当温度在40℃以下时活性稳定、对较长时间的紫外线照射有较好的耐受力；
53.4.通过体外裂解实验得出，该丁香假单胞菌噬菌体对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(psa)有良好的裂解效果；
54.5.通过猕猴桃组培苗体内实验得出，叶片感染丁香假单胞菌12h后滴加106pfu/ml噬菌体zcpsa02，36h后能够显著降低病原菌浓度，治疗效果优于已报道的同类噬菌体。结果说明该丁香假单胞菌噬菌体可有效杀灭猕猴桃叶片所感染致病菌，对猕猴桃溃疡病具有较好的防治功能；
55.6.通过丁香假单胞菌噬菌体土壤消毒实验得出，使用106pfu/ml浓度的丁香假单胞菌噬菌体可有效的杀灭土壤环境中污染的宿主菌。
56.为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本公开进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
57.定义
58.除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
59.除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
60.本文所用的术语“约”表示其后的数值的
±
20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的
±
10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的
±
5％的范围。
61.如本文所用，术语“感染复数(moi)”是噬菌体数量与细菌数量的比值，是研究噬菌体感染细菌与产出噬菌体子代量效关系的重要依据。本公开的丁香假单胞菌噬菌体只需添加少量，即可侵染丁香假单胞菌增殖增殖获得大量子代噬菌体。
62.用作本文的生物制剂的活性成分的对丁香假单胞菌有毒的噬菌体还通过噬菌体组合提供，如两种、三种、四种、五种、六种或更多种有毒噬菌体分离株或类型的混合物，其可以同时或先后提供，包括与载体一起。术语“载体”是指噬菌体与其一起施用的稀释剂、辅药、表面活性剂、赋形剂或媒介物(vehicle)。所述载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物和合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液，包括磷酸盐溶液，如磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，葡萄糖水溶液和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于注射液。适当的赋形剂可以包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩(chalk)、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，本文的生物制剂还可以包含少量的湿润剂或乳化剂，或ph缓冲剂。如果需要，还可以向本文的生物制剂中加入保护剂，包括基于酪蛋白的制剂、基于面粉的制剂、蔗糖、刚果红、和基于木质素的制剂等。
63.如本文所用，术语“防治”包括预防和治疗。
64.如本文所用，术语“治疗”定义为用试剂作用在疾病、病症或病况上以减少或减轻所述疾病、病症或病况的生理学作用和/或其症状。用于本文时，“治疗”覆盖对宿主(例如，植物物种，包括农业目的的那些，如食用植物或用于产生食用产品的那些，以及观赏植物物种)中疾病的任何治疗，并且包括：(a)减少在植物中发生所述疾病的危险，(b)阻止所述疾病的进展，和(c)减轻所述疾病，即，引起所述疾病的消退和/或减轻一种或多种疾病症状。
65.有效的病害控制所需要的噬菌体浓度没有限制，但是，例如，可以是1
×
10～1
×
10
12
pfu/ml，1
×
104～1
×
10
11
pfu/ml或1
×
107～1
×
10
10
pfu/ml。
66.施用所述生物制剂的时间没有限制，例如，可以是每天一次、每周一次、或每周两次、每月一次、每两月一次或每季度一次。
67.施用所述生物制剂可以采取溶液、混悬液、乳液、粉末、片剂、喷雾剂、注射剂等的形式。
68.下面提供实施例和附图以帮助理解本发明。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本发明，但不构成任何限制。本发明的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
69.实施例1：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的分离纯化
70.1.实验材料：
71.猕猴桃枝条及果园土壤样品采集自四川省广元市苍溪县猕猴桃果园，噬菌体宿主菌为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种psabj530(cgmcc1.19157)，由本实验室从猕猴桃溃疡病发病枝条中分离、鉴定并保存。
72.宿主菌psabj530菌液制备：挑取纯化的psabj530菌落于20mltsb液体培养基中，置于25℃，180rpm/min振荡培养16h。
73.tsb液体培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb培养基)(oxiod，英国)，30g/l。
74.tsb半固体培养基：tsb液体培养基中添加7.5g/l琼脂。
75.tsb固体培养基：tsb液体培养基中添加15g/l琼脂。
76.2.实验方法：
77.将1g果园土壤样品加入10ml无菌水，混匀后5000rpm离心20min，吸取上清液分别用0.45μm和0.22μm滤器过滤备用。取200μl上述滤液与200μl psabj530菌液混合，加入10ml融化的半固体tsb培养基，混匀后倒在预先准备的tsb固体培养基平皿，制成双层平板。培养皿于25℃倒置培养16-18h，产生的空斑即含有可裂解psabj530的噬菌体。挑取空斑置于20ml tsb液体培养基并加入100μl psabj530菌液，25℃培养12h，离心过滤培养液再次使用双层平板法挑取单一空斑纯化该噬菌体。噬菌体的纯化需重复3次。纯化获得的噬菌体在固体培养基上可形成清晰规则的空斑(图1)。
78.该噬菌体命名为丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02，于2023年5月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：中国科学院微生物研究所，分类命名为假单胞菌噬菌体，保藏号为cgmcc 45569。
79.实施例2：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的大量增殖
80.噬菌体zcpsa02原液的制备：挑取实施例1获得的单个噬菌斑接种于对数期宿主菌psabj530菌液中，25℃，200rpm振荡培养12h后于8000rpm离心3min，0.22μm微孔滤器过滤上清液，将滤液稀释至合适倍数加入宿主菌与10ml的tsb半固体混合倾注在tsb平板上，冷却后25℃培养至出现噬菌斑，重复上述步骤2-3次后，此时获得噬菌体zcpsa02原液。
81.将3ml噬菌体zcpsa02原液和3ml宿主菌psabj530菌液加入200ml tsb液体培养基中，25℃震荡培养12h，12000rpm离心30min，取上清，用0.22μm滤膜抽滤获得噬菌体的大量增殖液。用双层平板法检测噬菌体效价，结果显示效价达到10
10
pfu/ml左右。
82.实施例3：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的基因组提取
83.使用30kd的超滤离心管浓缩噬菌体，8000rpm，4℃，离心20min，吸取滤膜上的培养液即为浓缩噬菌体纯培养液。使用病毒核酸提取试剂盒(geneaid biotech)提取浓缩噬菌体基因组。提取噬菌体基因组进行琼脂糖凝胶电泳，发现其基因组有三条带(图2，泳道1)，是典型的phi6噬菌体的特征。phi6是囊病毒科的代表成员，phi6的三个基因组片段分别为l(6374bp)，m(4063bp)和s(2948bp)。
84.提取的基因组分别使用dnase i酶和rnase a酶进行处理，同时设置不使用消化酶处理的对照组，加入6
×
dnaloading buffer于1％琼脂糖混合的凝胶中进行电泳，20min后观察结果，若dnase i处理组未见条带，rnase a及对照组有条带则该基因组核酸类型为dna，反之则为rna，基因组电泳图如图2所示。图2中m为dnamarker8000(生工生物)，泳道1为原基因组，泳道2为dnase i处理，泳道3为rnase a处理，可判断zcpsa02为rna噬菌体，经测序zcpsa02具有seq id no:1(atggcccagtcact gagcgcatacggcgcgaaaatgttcgcggccctgcaggtcgccctggctgaatcctatggcgtcgagctggccagcaagacgttcagcgtcgagccctcgattgcccaggaacttaacgaggcgatcacccacaagtccgatttcctgcagcgcatcaacgtcatcggcgtgaccgagatcaagggtcaaaaggtgttcctgggtgtgtcgggtcctgtgaccggtcgcacgaacaccaagactaccgatcgcgaagccaaggacgcatcggcgcttgatgacagcatctacgagctgttttccaccgagtccgacgtcagcctgccttacgcgaaaatcgacgcctgggccaagttccccgactttcagcagcgctactccgccgcggtgcaaaagcagatcgcactcgaccgtctgatgatcggcttccatggcctcaaacaagtccgagcaactggaagaagcggcgcgtcaggccctggcagaacagatgaagccatgcgcgttgcattggacccggcacgcggatttgccgctgaatcgtttgccgggattcgttga)所示的表面蛋白基因。
85.采用phi6噬菌体特异引物6f(5
′‑
tctcggtatctgaccgacca-3
′
，seq id no:2)和6r(5
′‑
tggacggatcacccaacaac-3
′
，seq id no:3)对提取的基因组进行反转录pcr，扩增出目的条带，可进一步鉴定zcpsa02为phi6噬菌体。
86.实施例4：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的透射电镜形态观察
87.取10μl(109pfu/ml)纯化的噬菌体zcpsa02滴于铜网上，静置20min，滤纸吸去多余液体。在铜网上滴加15μl的2％的磷钨酸(pta)染色5min，用滤纸吸去残液，干燥后用透射电子显微镜观察。
88.丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的透射电镜结果如图3所示，该噬菌体呈球形，直径约为80～100nm。根据国际病毒分类委员会(ictv)《病毒分类-国际病毒分类委员会第十次报告》为标准，鉴定该噬菌体属于囊状噬菌体科，假单胞菌噬菌体。
89.实施例5：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的最佳感染复数测定
90.首先制备丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02增殖液及对数期宿主菌psabj530菌液，分别进行计数测定浓度。按感染复数0.001、0.01、0.1、1、10和100的比例混合噬菌体及宿主菌，置于终体积为10ml的tsb培养液中。25℃震荡培养8h，12000rpm离心30min，取上清，用0.22μm滤器过滤，获得噬菌体增殖液。用双层平板法检测噬菌体效价，根据测定结果判定最佳感染复数。
91.结果如表1所示，感染复数为0.001时，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02效价最高，为5.12
±
0.0
×
10
10
pfu/ml。因此该噬菌体最佳感染复数为0.001。
92.表1丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的最佳感染复数测定结果
93.感染复数噬菌体效价(pfu/ml)0.00014.12
±
0.12
×
1090.0015.12
±
0.09
×
10
10
0.014.37
±
0.17
×
1090.13.12
±
0.13
×
10911.77
±
0.21
×
108103.18
±
0.15
×
10894.实施例6：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的一步生长曲线
95.将丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02与宿主菌psabj530各100μl按最佳感染复数0.001比例混匀，25℃孵育5min，12000rpm离心30s后使用tsb液体培养基清洗两遍，弃上清。加入10ml tsb液体培养基重悬沉淀，25℃震荡培养。每过15min取200μl培养液，通过双层平板法测定噬菌体效价，绘制一步生长曲线，分析该噬菌体的潜伏期、爆发期及裂解量。
96.结果如图4所示，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的潜伏期约为45min，爆发期约为60min，zcpsa02可以在田间环境中裂解病原菌，有效降低病原菌的密度，控制疾病。
97.实施例7：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的ph稳定性
98.将丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02分别置于10ml ph值为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的tsb液体培养基，噬菌体终浓度为10
10
pfu/ml。25℃放置1h后取200μl培养液，通过双层平板法测定噬菌体效价，实验设置三次重复，绘制噬菌体zcpsa02的ph稳定性柱状图。
99.结果如图5所示，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02效价在ph4-11范围内无明显变化。当ph《4或ph》11时，噬菌体zcpsa02效价随酸碱度的增加显著下降。因此丁香假单胞菌噬菌
体zcpsa02在ph 4-11的环境下较稳定，适用性明显比其他同类噬菌体更宽。良好的ph耐受性是zcpsa02的优点，zcpsa02可以在4-11的ph环境中保持较高的效价，有利于高浓度的zcpsa02噬菌体在条件复杂的田间环境中维持更长时间的活性。将更稳定地持续裂解病原菌从而控制疾病的进程。
100.实施例8：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的热稳定性
101.使用tsb液体培养基稀释丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02，使噬菌体终浓度为10
10
pfu/ml。分别吸取10ml噬菌体稀释液，置于4℃、25℃、40℃、50℃水浴中孵育24h，每隔3h取200μl培养液，通过双层平板法测定噬菌体zcpsa02效价，实验设置三次重复，绘制噬菌体zcpsa02的热稳定性曲线。
102.结果如图6所示，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02效价在低于40℃环境下无明显变化。当温度超过40℃，该噬菌体的效价开始下降，说明噬菌体zcpsa02具有一定的温度稳定性，可以在田间环境中保持一定的活性。
103.实施例9：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的紫外线稳定性
104.将浓度为10
10
pfu/ml的丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02置于一次性平皿，放置在距紫外灯(20w,50cm,700mw/m2)下方40cm处照射。分别在照射处理后3min、15min、30min、45min、60min取200μl噬菌体溶液，于黑暗环境静置30min后通过双层平板法测定噬菌体zcpsa02效价，实验设置三次重复，绘制噬菌体zcpsa02的紫外线稳定性曲线。
105.结果如图7所示，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02在紫外线照射7min后，效价开始下降。当紫外线连续照射60min后，噬菌体效价下降至大约109pfu/ml，只下降了约1个数量级。该结果表明丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02对短时间紫外线照射有优秀的耐受力。一般的噬菌体对于紫外线的耐受性较差，暴露在紫外光中超过15min就会引起效价的显著降低，并在60min左右降低2个数量级左右的效价，在日间紫外强度较高的田间环境中不够稳定。zcpsa02则可以在相同的紫外条件中保持30min以上的高效价，具有良好的紫外耐受性。优秀的紫外耐受性有利于高浓度的zcpsa02噬菌体在条件复杂的田间环境中维持更长时间的活性。将更稳定地持续裂解病原菌从而控制疾病的进程。
106.实施例10：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的裂解谱检测
107.选择丁香假单胞菌猕猴桃致病变种psabj530(cgmcc1.19157)及3株分离自猕猴桃果园的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种菌株(psacx1、psawf1、psajs1)对丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的裂解谱进行测定。分别取待测宿主菌200μl均匀涂抹于tsb固体培养基平板，待菌液完全吸收后，滴加5μl噬菌体增殖液(109pfu/ml)于平板上，对照组滴加tsb液体培养基，待吸收后置于25℃恒温培养箱中倒置培养12h，观察是否产生噬菌斑。
108.结果表明待测的4株丁香假单胞菌于tsb平板上生长良好，滴加噬菌体zcpsa02区域无细菌生长，形成透明的空斑，裂解率为100％。
109.实施例11：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的体外裂解实验
110.将丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02分别与丁香假单胞菌psabj530、psacx1、psawf1、psajs1各100μl按最佳感染复数0.001混匀，25℃孵育5min，12000rpm离心30s后使用tsb培养液清洗两遍，弃上清。加入10ml tsb培养液重悬沉淀(噬菌体终浓度为10
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pfu/ml)，25℃震荡培养。培养后0h、2h、4h、6h、8h、12h和16h检测培养液丁香假单胞菌的浓度值，绘制噬菌体zcpsa02的体外裂解曲线。
111.结果如图8所示，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02在16h内能够有效裂解4株丁香假单胞菌，有效降低病原菌的菌密度，缓解溃疡病的发生，具有较好的应用前景。
112.实施例12：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02的体内安全性实验
113.将6cm高猕猴桃组培苗分为3组，每组8株，每株组培苗选取3-5个叶片用无菌手术刀划出1cm左右伤口。高剂量组于叶片伤口滴加2μl浓度为108pfu/ml的噬菌体zcpsa02；低剂量组于叶片伤口滴加2μl浓度为106pfu/ml的噬菌体zcpsa02；对照组滴加2μl无菌tsb培养液。各处理组在滴加噬菌体后0h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h剪下3个叶片，取伤口周围1cm2叶片组织，加入1.5ml生理盐水研磨，12000rpm离心3min，取上清分别通过0.45μm和0.22μm滤器过滤。吸取200μl滤液，双层平板法测定噬菌体zcpsa02效价，实验设置三次重复。
114.与对照组相比，组培苗经过噬菌体处理后叶片组织状态正常，对组培苗生长无负面影响。噬菌体效价检测结果如图9所示，高低剂量组噬菌体zcpsa02在叶片上均能够较稳定存在72h左右，72h后效价开始明显下降，120h降至0。结果表明，丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02对猕猴桃组培苗具有良好的安全性，72h内能够在叶片上保持活性，120h后噬菌体残留完全清除。
115.实施例13：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02对猕猴桃溃疡病的体内治疗实验
116.使用6cm高猕猴桃组培苗，每株组培苗选取3-5个叶片左右两侧用无菌手术刀划出1cm左右伤口。对照组(control组)于叶片右侧伤口滴加2μl浓度为108cfu/ml病原菌psabj530；治疗组(zcpsa02组)首先于叶片左侧伤口滴加2μl浓度为108cfu/ml病原菌psabj530，感染10h后再滴加2μl浓度为106pfu/ml的噬菌体zcpsa02治疗。为防止液滴流动，叶片伤口处覆盖1cm2无菌纱布。36h后观察叶片病变情况，并取伤口周围1cm2叶片组织，加入1.5ml无菌生理盐水研磨，匀浆液10倍稀释后进行菌落计数，对比两组叶片组织细菌浓度。实验设置三次重复。
117.如图10所示，感染后36h菌落计数的结果显示噬菌体zcpsa02治疗后，细菌cfu显著下降。因此丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02在组培苗实验中，对病原菌psabj530引起的溃疡病有很好的治疗效果。
118.实施例14：丁香假单胞菌噬菌体zcpsa02土壤消毒实验
119.在100g灭菌土壤中分别加入10ml丁香假单胞菌猕猴桃致病变种psabj530、丁香假单胞菌atcc 21781、atcc 19310、atcc 49211(浓度为108cfu/ml)，适当混匀后喷入10ml噬菌体zcpsa02(浓度为106pfu/ml)，对照组喷入等量无菌tsb培养液。25℃放置2h后每组取1g土壤溶解于100ml无菌水进行菌落计数，检测细菌浓度。
120.如图11所示，土壤中psabj530、丁香假单胞菌atcc 21781、atcc 19310、atcc 49211经噬菌体zcpsa02处理2h后，细菌浓度均低于3lg cfu/ml，而对照组则大于4lg cfu/ml。结果表明106pfu/ml浓度的噬菌体zcpsa02可有效杀灭土壤环境中污染的丁香假单胞菌及其猕猴桃致病变种。
121.本公开的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本公开的技术方案做出的技术变形，均落入本公开的保护范围之内。

技术特征：
1.一种丁香假单胞菌噬菌体，所述丁香假单胞菌噬菌体的分类命名为假单胞菌噬菌体(pseudomonas phage)，于2023年5月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为cgmcc 45569。2.根据权利要求1所述的丁香假单胞菌噬菌体，其特征在于，所述丁香假单胞菌噬菌体为rna噬菌体，优选地，所述丁香假单胞菌噬菌体具有seq id no:1所示的表面蛋白基因。3.一种生物制剂，包括权利要求1或2所述的丁香假单胞菌噬菌体。4.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂为农业杀菌剂、消毒剂、清洁剂或其添加剂，优选地，所述生物制剂的剂型为液体制剂或冻干制剂，所述生物制剂的剂型为溶液、混悬液、乳液、粉末、片剂、喷雾剂或注射剂。5.根据权利要求3所述的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂还包括添加剂成分，优选地，所述添加剂成分包括稀释剂、辅药、表面活性剂、赋形剂、媒介物(vehicle)、分散剂、稳定剂、填料和溶剂中的至少一种。6.权利要求1或2所述的丁香假单胞菌噬菌体或权利要求3-5中任一项所述的生物制剂在防治丁香假单胞菌及其猕猴桃致病变种所致植物病害中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物病害为丁香假单胞菌引起的细菌性疾病，优选为猕猴桃溃疡病、黄瓜细菌性角斑病、番茄细菌叶斑病、菜豆晕疫病和/或烟草野火病，更优选为猕猴桃溃疡病。8.一种防治丁香假单胞菌所致植物病害的方法，包括采用权利要求3-5中任一项所述的生物制剂对植物进行处理，优选地，所述处理包括对植物表面喷洒所述生物制剂，或将所述生物制剂注射于植物体内，优选地，所述生物制剂为农业杀菌剂，所述处理包括将所述农业杀菌剂喷洒于猕猴桃叶面，用于防治猕猴桃溃疡病。9.一种防治果园环境中丁香假单胞菌的污染的方法，包括采用权利要求3-5中任一项所述的生物制剂对果园环境进行处理，优选地，所述处理包括对环境表面喷洒所述生物制剂，或将所述生物制剂注射于植物体内，优选地，所述生物制剂为消毒剂或清洁剂，所述处理包括将所述消毒剂或清洁剂喷洒于果园环境，例如喷洒于植物表面、种植土壤、果园空气及地表水或农用器具，或注射入植物体内。10.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述的丁香假单胞菌噬菌体，优选地，所述试剂盒用于丁香假单胞菌的快速检测或对临床样本中的目标致病菌筛选。

技术总结
本公开提供了一株新的丁香假单胞菌噬菌体，能够高效杀灭植物体内及果园环境中的丁香假单胞菌猕猴桃致病变种，具有较高的紫外线稳定性与pH稳定性、对病原菌裂解性优秀、环境友好等特点，在猕猴桃溃疡病的生物防治中有较好的应用前景。的应用前景。


技术研发人员：金一 夏勉 刘成
受保护的技术使用者：安禾博雅（山东）生物技术有限公司
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/9/9