一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用

1.本发明属于高分子材料技术领域，具体涉及一种多功能金纳米点(aunds)作为纳米药物通过双模式成像进行诊断和修复脊髓损伤部位的应用。


背景技术：

2.全球约有300万人患有创伤性脊髓损伤(spinal cord injury,sci)，sci是一种严重的中枢神经系统外伤性疾病，表现为损伤部位以下节段的各种运动感觉功能障碍、排尿排便功能障碍。脊髓损伤的病理生理进展包括原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤后立即发生持续的继发性损伤级联反应，导致脊髓进一步损伤和神经功能障碍。研究表明，损伤脊髓中活性氧(ros)水平的显著增加在继发性损伤级联反应中起着至关重要的作用。过量的ros主要由损伤的线粒体、nadph氧化酶、炎症细胞以及继发性损伤的恶劣微环境引起的芬顿反应产生。过量产生的ros可引起严重的脂质过氧化，并对蛋白质和dna造成氧化损伤，导致损伤部位神经纤维变性脱髓鞘，甚至神经元细胞凋亡。此外，ros容易分布到损伤部位的邻近区域，往往引起损伤部位的扩张，导致继发性损伤加重。因此，清除活性氧被认为是减轻急性脊髓损伤治疗中继发性损伤的有效途径。
3.近年来，功能纳米材料为脊髓损伤的诊断和治疗开辟了新的途径。特别是金纳米颗粒(aunps)，由于其超小的尺寸，易于表面功能化，良好的生物相容性，有望成为内源性药物。aunps具有抗氧化能力，可抑制氧化应激的产生。此外，aunps还可以通过抑制炎症细胞因子达到良好的抗炎作用。因此，我们推测aunps可能通过抑制氧化应激促进脊髓损伤后的功能恢复。同时，aunps还具有良好的光学性能和x射线衰减能力，可用于荧光和ct成像。优异的成像效果能够及时准确地识别脊髓损伤部位，实现脊柱手术过程中脊髓完整性的实时可视化监测。综上所述，aunps有望成为一种双模式成像纳米探针，既能克服单一成像的局限性，又能准确区别病变部位并指导损伤后的治疗效果，同时又可以作为一种纳米药物，清除脊髓损伤部位过多的ros，修复损伤的脊髓。在脊髓损伤的诊疗一体化方面具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种多功能aunds作为纳米药物通过双模式成像进行诊断和修复脊髓损伤部位的应用。
5.该方法首先采用电化学交换法制备了具有生物相容性的超小尺寸金纳米点。该纳米点具有优异的荧光成像与ct成像性能，注射到脊髓处后可以快速准确地区分脊髓损伤部位；同时结合荧光/ct双模式成像以高空间分辨率、对比度和灵敏度实现检测脊髓损伤部位的应用，克服了单一技术的局限性。它能在脊柱手术过程中实时视觉监测脊髓完整性和及时识别脊髓损伤部位方面。多功能aunds可以作为纳米药物，通过清除活性氧(ros)、抑制氧化应激、抗炎症和抗细胞凋亡等机制，获得有效修复脊髓损伤的治疗效果。采用电生理检查、血脑屏障运动评定量表和免疫荧光染色评价治疗脊髓损伤后的功能恢复情况。结果表
明，这种纳米药物可以减少氧化应激损伤，抑制氧化应激导致的细胞凋亡。利用该纳米药物修复脊髓损伤的治疗结束后，动物的运动功能显著恢复。该aunds纳米药物可有效地修复损伤后的脊髓，同时还具有微创、高效、毒副作用小等优点。综上所述，具有集成荧光/ct双模式成像及指导精确治疗脊髓损伤于一体的多功能金纳米点，可以作为一种纳米药物，为脊髓损伤的临床诊断和治疗提供一种新的有效策略。
6.本发明所述的多功能aunds的制备方法，其具体步骤如下：
7.(1)制备模板剂银纳米点(agnds)：称取0.0845g agno3，再称取0.0768～0.3070g谷胱甘肽gsh(按照agno3和gsh的摩尔比为1:0.5～2的比例)，并混合溶解在10ml去离子水中(所得溶液中agno3的浓度为50mm)。然后将混合物在室温下搅拌反应30min后形成乳白色ag-gsh凝胶。调节ph值至6～7，向溶液中加入适量的naoh(1m)，使乳状凝胶变成清澈透明的溶液。然后加入1ml还原剂(可以是水合肼，硼氢化钠，柠檬酸钠，抗坏血酸，盐酸羟胺)，在避光条件下室温搅拌体系24～72h。反应结束后，产物变为澄清的橙红色溶液，形成银纳米点agnds溶液。将产物以8800rpm离心15分钟，过滤上清液以除去杂质。向溶液中加入过量的异丙醇获得橙红色浑浊液体，以6800rpm离心10min，获得橙红色沉淀再溶解在5ml去离子水中。将得到的产物用渗析袋在去离子水渗析24h后，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将得到的溶液取出，用减压蒸馏方式除去其中的水分，然后真空干燥形成固体样品，即得到固体的银纳米点agnds。
8.(2)制备金纳米点(aunds)：将上述agnds用去离子水配制成浓度为50mm溶液并取1000μl，再量取500～1000μlhaucl4(50mm)溶液，上述溶液依次加入到5～15ml去离子水中。然后在溶液中加入适量的naoh(1m)溶液，调节溶液的ph值至6～7。将混合物在连续搅拌下在60～80℃下孵育4～12h。然后，将产物以8800rpm离心15min，过滤获得上清液，向上清液中加入过量的异丙醇获得黄色浑浊液体，再次以8000rpm离心12min获得黄色沉淀。将该沉淀物溶解在5ml去离子水中，得到淡黄色透明溶液。将淡黄色透明溶液在去离子水中渗析24h，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将渗析袋中溶液取出，通过旋转蒸发仪除去部分水分，然后冷冻液体，通过真空干燥形成固体样品，即得到aunds。
9.本发明优点如下：1.制备的aunds具有优异的生物相容性，纳米尺寸小，可穿过血脑屏障，易于功能化，可作为一种纳米药物应用于生物体内；2.制备过程简单便捷，绿色安全无污染；3.aunds具有优异的荧光/ct双模式成像功能，可以弥补单一成像的局限性，提高空间分辨率和对比度，注射到脊髓处后能点亮脊髓部位，并差异性检测脊髓正常组织和损伤组织，实现可视化地精准检测脊髓损伤部位的应用；4.将aunds纳米药物注射到脊髓损伤部位后，可有效清除ros，抑制氧化应激，减少炎症细胞的浸润，达到修复脊髓继发性损伤的良好效果，促进损伤脊髓功能的恢复；5.aunds纳米药物具有集成荧光/ct双模式成像、指导精确检测和治疗脊髓损伤等多功能于一体，可差异性点亮和区分脊髓正常组织和损伤组织，实现可视化手术导航和精确定位脊髓损伤的部位，并能精准修复脊髓损伤部位，为脊髓损伤的临床诊断和治疗提供一种新的有效策略。
附图说明
10.图1：(a)为实施例1所制备的aunds的荧光光谱图。(b)为实施例1所制备的不同浓度的aunds的计算机断层扫描(ct)图像。结果表明aunds具有良好的荧光/ct双模式成像性
能，可提供多重信息，差异性点亮和区分脊髓正常组织和损伤组织，实现可视化导航和精确定位脊髓损伤的部位。
11.图2：为实施例1所制备的aunds通过dcf染色检测pc12细胞内ros水平。表明aunds具有高效清除ros的能力，能抑制氧化应激，减少炎症细胞的浸润，有效地修复脊髓继发性损伤的治疗效果。
12.图3：(a)为实施例1所制备的aunds，在动物脊髓损伤部位处进行注射前后的ct图像对比，图像为正中矢状面(左上)、冠状面(左下)和横切面(右)。(b)为实施例1所制备的aunds在动物脊髓损伤部位处进行注射前后的荧光图像对比。结果表明，aunds分别利用荧光和ct双模式成像方法，能够准确定位和检测脊髓损伤部位，而且荧光/ct双模成像的结合呈现具有较高的空间分辨率、对比度和灵敏度。它在脊髓完整性的实时可视化监测和脊柱手术中及时识别脊髓损伤组织方面具有很大的潜力。
13.图4：(a)为实施例1所制备的aunds在动物脊髓损伤部位进行治疗前后的脊髓躯体感觉诱发电位(ssep)对比。(b)为实施例1所制备的aunds在动物脊髓损伤部位进行治疗前后的皮质运动诱发电位(cmep)对比。结果表明，aunds显著改善了脊髓损伤急性期后肢运动功能的恢复，在修复脊髓损伤方面具有极大的应用潜力。
具体实施方式
14.实施例1：
15.(1)制备模板剂银纳米点(agnds)：称取0.0845g agno3，再称取0.0768g谷胱甘肽gsh(agno3和gsh的摩尔比为1:0.5)，并混合溶解在10ml去离子水中(所得溶液中agno3的浓度为50mm)。然后将混合物在室温下搅拌反应30min后形成乳白色ag-gsh凝胶。调节ph值至6，向溶液中加入适量的naoh(1m)，使乳状凝胶变成清澈透明的溶液。然后加入1ml还原剂水合肼，在避光条件下室温搅拌体系24h。反应结束后，产物变为澄清的橙红色溶液，形成银纳米点agnds溶液。将产物以8800rpm离心15分钟，过滤上清液以除去杂质。向溶液中加入过量的异丙醇获得橙红色浑浊液体，以6800rpm离心10min，获得橙红色沉淀再溶解在5ml去离子水中。将得到的产物用渗析袋在去离子水渗析24h后，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将得到的溶液取出，用减压蒸馏方式除去其中的水分，然后真空干燥形成固体样品，即得到固体的银纳米点agnds。
16.(2)制备金纳米点(aunds)：将上述agnds用去离子水配制成浓度为50mm溶液并取1000μl，再量取500μlhaucl4(50mm)溶液，上述溶液依次加入到5ml去离子水中。然后在溶液中加入适量的naoh(1m)溶液，调节溶液的ph值至6。将混合物在连续搅拌下在60℃下孵育4h。然后，将产物以8800rpm离心15min，过滤获得上清液，向上清液中加入过量的异丙醇获得黄色浑浊液体，再次以8000rpm离心12min获得黄色沉淀。将该沉淀物溶解在5ml去离子水中，得到淡黄色透明溶液。将淡黄色透明溶液在去离子水中渗析24h，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将渗析袋中溶液取出，通过旋转蒸发仪除去部分水分，然后冷冻液体，通过真空干燥形成固体样品，即得到aunds。
17.实施例2：
18.(1)制备模板剂银纳米点(agnds)：称取0.0845g agno3，再称取0.1535g谷胱甘肽gsh(按照agno3和gsh的摩尔比为1:1的比例)，并混合溶解在10ml去离子水中(所得溶液中
agno3的浓度为50mm)。然后将混合物在室温下搅拌反应30min后形成乳白色ag-gsh凝胶。调节ph值至6.5，向溶液中加入适量的naoh(1m)，使乳状凝胶变成清澈透明的溶液。然后加入1ml还原剂柠檬酸钠，在避光条件下室温搅拌体系72h。反应结束后，产物变为澄清的橙红色溶液，形成银纳米点agnds溶液。将产物以8800rpm离心15分钟，过滤上清液以除去杂质。向溶液中加入过量的异丙醇获得橙红色浑浊液体，以6800rpm离心10min，获得橙红色沉淀再溶解在5ml去离子水中。将得到的产物用渗析袋在去离子水渗析24h后，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将得到的溶液取出，用减压蒸馏方式除去其中的水分，然后真空干燥形成固体样品，即得到固体的银纳米点agnds。
19.(2)制备金纳米点(aunds)：将上述agnds用去离子水配制成浓度为50mm溶液并取1000μl，再量取1000μlhaucl4(50mm)溶液，上述溶液依次加入到15ml去离子水中。然后在溶液中加入适量的naoh(1m)溶液，调节溶液的ph值至7。将混合物在连续搅拌下在80℃下孵育12h。然后，将产物以8800rpm离心15min，过滤获得上清液，向上清液中加入过量的异丙醇获得黄色浑浊液体，再次以8000rpm离心12min获得黄色沉淀。将该沉淀物溶解在5ml去离子水中，得到淡黄色透明溶液。将淡黄色透明溶液在去离子水中渗析24h，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将渗析袋中溶液取出，通过旋转蒸发仪除去部分水分，然后冷冻液体，通过真空干燥形成固体样品，即得到aunds。
20.实施例3：
21.(1)制备模板剂银纳米点(agnds)：称取0.0845g agno3，再称取0.3070g谷胱甘肽gsh(按照agno3和gsh的摩尔比为1:2的比例)，并混合溶解在10ml去离子水中(所得溶液中agno3的浓度为50mm)。然后将混合物在室温下搅拌反应30min后形成乳白色ag-gsh凝胶。调节ph值至7，向溶液中加入适量的naoh(1m)，使乳状凝胶变成清澈透明的溶液。然后加入1ml还原剂抗坏血酸，在避光条件下室温搅拌体系72h。反应结束后，产物变为澄清的橙红色溶液，形成银纳米点agnds溶液。将产物以8800rpm离心15分钟，过滤上清液以除去杂质。向溶液中加入过量的异丙醇获得橙红色浑浊液体，以6800rpm离心10min，获得橙红色沉淀再溶解在5ml去离子水中。将得到的产物用渗析袋在去离子水渗析24h后，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将得到的溶液取出，用减压蒸馏方式除去其中的水分，然后真空干燥形成固体样品，即得到固体的银纳米点agnds。
22.(2)制备金纳米点(aunds)：将上述agnds用去离子水配制成浓度为50mm溶液并取1000μl，再量取800μlhaucl4(50mm)溶液，上述溶液依次加入到10ml去离子水中。然后在溶液中加入适量的naoh(1m)溶液，调节溶液的ph值至6.5。将混合物在连续搅拌下在70℃下孵育10h。然后，将产物以8800rpm离心15min，过滤获得上清液，向上清液中加入过量的异丙醇获得黄色浑浊液体，再次以8000rpm离心12min获得黄色沉淀。将该沉淀物溶解在5ml去离子水中，得到淡黄色透明溶液。将淡黄色透明溶液在去离子水中渗析24h，每隔4h换一次水，以除去未反应的离子和其它杂质。将渗析袋中溶液取出，通过旋转蒸发仪除去部分水分，然后冷冻液体，通过真空干燥形成固体样品，即得到aunds。

技术特征：
1.一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用，其特征在于：所述的纳米材料为aunds，能获得双模式成像并进行诊断和修复脊髓损伤部位方面的应用。2.根据权利要求1所述的一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用，其特征在于：aunds具有优异的生物相容性，尺寸小，可穿越血脑屏障，易于功能化，可作为一种安全无毒的纳米药物应用于生物体内。3.根据权利要求1所述的一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用，其特征在于：aunds具有优异的荧光/ct双模式成像功能，可以弥补单一成像的局限性，提高空间分辨率和对比度，注射到脊髓处后能点亮脊髓部位，并差异性检测脊髓正常组织和损伤组织，实现可视化地精准检测脊髓损伤部位的应用；可作为优良的成像探针应用于脊髓损伤部位的早期诊断。4.根据权利要求1所述的一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用，其特征在于：将aunds纳米药物注射到脊髓损伤部位后，可有效清除ros，抑制氧化应激，减少炎症细胞的浸润，达到修复脊髓继发性损伤的良好效果，促进损伤脊髓功能的恢复。5.根据权利要求1所述的一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用，其特征在于：aunds纳米药物具有集成荧光/ct双模式成像、指导精确检测和治疗脊髓损伤等多功能于一体，可差异性点亮和区分脊髓正常组织和损伤组织，实现可视化手术导航和精确定位脊髓损伤的部位，并能精准修复脊髓损伤部位，为脊髓损伤的临床诊断和治疗提供一种新的有效策略。

技术总结
本发明提供了一种多功能金纳米点在脊髓损伤检测和修复方面的应用，应用于双模式成像引导的精确检测和治疗脊髓损伤部位。该纳米材料具有优异的荧光光学特性和较高的X射线衰减系数，可实现荧光/CT双模式成像的功能，从而快速准确地识别脊髓损伤部位。AuNDs具有有效清除ROS的能力，可抑制氧化应激，减少炎症细胞的浸润，达到良好的脊髓损伤修复效果。该纳米点集成脊髓损伤诊断与治疗为一体，可在荧光/CT双模式成像的引导下，可视化检测脊髓的病灶部位，实现精确地修复脊髓损伤，提高治疗的准确性和安全性，可能为脊髓损伤的临床诊断和治疗提供一个有前景的策略。提供一个有前景的策略。提供一个有前景的策略。


技术研发人员：林权 刘安楠 王泽 李星辰
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/9/6