1-氯-4-肼基酞嗪反应性基质在单糖MALDIMSI原位分析中的应用

1-氯-4-肼基酞嗪反应性基质在单糖maldi msi原位分析中的应用
技术领域
1.本发明属于质谱检测技术领域，具体涉及在maldi msi检测领域中，1-氯-4-肼基酞嗪作为反应性基质用于单糖的原位分析。


背景技术：

2.基质辅助激光解吸电离(maldi)质谱成像(msi)是功能强大的分析技术，可用于众多组分的可视化分析，可用于揭示内源性生物分子及外源性药物分子在组织中的空间分布情况，进而为疾病机理等研究提供重要信息。在该技术中，基质决定了被分析物检测的灵敏度，是该技术的关键，所以，为了提高maldi msi分析性能，科研工作者一直致力于新型基质的发展。
3.单糖是生物体中的一类简单的糖类分子，其具有多种生物学功能和作用，包括：一、作为细胞代谢的能量来源；二、作为生物体内重要的结构组分；三、参与细胞间的信号传递；四、在疾病进展中起重要作用。生物组织中单糖在不同区域中的分布以及功能存在差异，因此，对单糖在生物组织上的空间分布进行可视化是有意义的，可以用于揭示单糖在生物体内的作用和生物过程中的功能机制。比如葡萄糖与果糖都是己糖，其分子式相同(c6h
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o6)，但是它们的分子结构不同，葡萄糖是醛糖，而果糖是酮糖，因此它们的化学性质和生物学功能也截然不同。原位检测生物体内中单糖能够帮助我们了解糖在生物体内的代谢和作用，从而更深刻地理解相关生理功能。
4.目前质谱技术中最常用的分析单糖的方式是液相色谱电喷雾质谱联用技术(lc-esi ms)，比如，利用1-苯-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)衍生化单糖，将单糖转化为具有高质谱信号响应的衍生化产物，从而提高lc-esi ms的检测灵敏度和选择性。然而，该技术不能提供原位信息。基于maldi msi分析技术，科研人员开发了吉拉德试剂t、吉拉德试剂p等糖的衍生基质，其使用肼基作为反应基团与糖中的醛基或羰基发生反应以进行衍生化，引入了电荷中心以提高电离的效率，原位分析了单糖。但是在这些分析中，吉拉德试剂本身不具有基质效应，需要另外引入基质，这可能会导致质谱图复杂化。hirofumi等人将maldi msi技术应用于草莓分析，揭示了水果各个部位的不同物质的分布，实验结果表明，己糖(如葡萄糖和果糖)分布在整个草莓切片上。在该工作中使用dhb作为基质，由于葡萄糖和果糖具有相同的分子量，并且也不存在特征的碎片离子，因此无法通过maldi msi单独识别，单糖异构体的原位检测仍然存在困难。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供1-氯-4-肼基酞嗪(1-chloro-4-hydrazinyl-phthalazine，chp)的新用途。
6.本发明所提供的1-氯-4-肼基酞嗪(1-chloro-4-hydrazinyl-phthalazine，chp)的新用途为1-氯-4-肼基酞嗪(1-chloro-4-hydrazinyl-phthalazine，chp)作为反应性基
质在单糖基质辅助激光解吸电离质谱成像maldi msi原位分析中的应用。
7.所述应用中，所述单糖包括葡萄糖、果糖、岩藻糖和阿拉伯糖。
8.本发明还提供一种单糖基质辅助激光解吸电离质谱成像maldi msi原位分析方法。
9.本发明所提供的单糖基质辅助激光解吸电离质谱成像maldi msi原位分析方法，包括如下步骤：
10.1)将1-氯-4-肼基酞嗪配制成反应性基质溶液；
11.2)将所得反应性基质1-氯-4-肼基酞嗪溶液喷涂到生物样本切片上，真空干燥，之后进行maldi-msi检测，得到生物样本切片的maldi成像结果，根据chp衍生化单糖标准品的maldi-ms/ms的质谱图成像结果原位确定所述生物样本切片的单糖分布组成并原位区分各单糖异构体，揭示单糖及单糖异构体在生物体内不同的空间的分布。
12.上述方法步骤1)中，所述1-氯-4-肼基酞嗪以4mg/ml的浓度溶解在乙腈/乙酸(7:3,v/v)的溶剂中，得到反应性基质溶液；
13.步骤2)中，所述生物样本切片具体可为胡萝卜切片、党参切片、甘草切片、山楂切片、枣切片、草莓切片、苹果切片中至少一种。
14.所述喷涂采用基质喷涂仪喷涂到生物样本切片上，基质喷涂仪的参数为：喷涂模式为cc(纵横循环)，喷嘴流速为50ml/min，载玻盘温度为45℃，喷嘴温度为25℃，喷嘴压力为0.15mpa，喷嘴速度为1500mm/min，喷涂电压为5000v；
15.maldi质谱成像在正离子模式下进行，质量检测范围是m/z 50-1000，分辨率为200μm,每个像素点的成像数据由频率2000hz的激光，激光扫描200次得到；
16.分别将1-氯-4-肼基酞嗪和单糖标准品配制成溶液，混匀，反应，将所得混合物移到maldi靶上，干燥，进行maldi-ms和maldi-ms/ms检测，得到chp衍生化单糖标准品的maldi-ms和maldi-ms/ms质谱图。
17.在maldi msi实验中，反应性基质1-氯-4-肼基酞嗪不仅作为maldi的基质，而且也作为分析物的衍生化试剂，与分析物的官能团反应，得到的衍生化产物有更高的离子化效率。使用反应性基质简化了质谱成像的工作流程，不需要另外喷涂基质，解决了样品前处理繁琐的问题，优点如下:(1)减少了由于多次喷涂导致的组织中的分子的弥散和损失。(2)多次喷涂可能造成切片上结晶较厚，无法获得切片的质谱信号，反应性基质可以减少这种情况的发生。(3)衍生化试剂与基质相互作用会产生复杂的质谱图难以解析，反应性基质衍生化的质谱图往往比较干净，便于分析。
18.综上，1-氯-4-肼基酞嗪有助于糖类的衍生化，提高检测的灵敏度，另外省略了进一步基质的喷涂步骤，简化了样品前处理过程，产生了干净的质谱图，再者，能够区分葡萄糖和果糖，毋庸置疑，该工作将极大提高maldi msi在分析单糖的性能。
19.本发明开发了1-氯-4-肼基酞嗪(1-chloro-4-hydrazinyl-phthalazine，chp)作为反应性基质，对生物组织中的单糖进行衍生化以及对单糖的异构体进行原位区分。以胡萝卜作为模型，对胡萝卜组织上的单糖进行衍生化，并进行maldi-msi实验，值得注意的是衍生化产物的二级质谱产生的特征碎片可以继续用于区分醛糖与酮糖，从而对单糖异构体进行区分，揭示单糖异构体在生物体内不同的空间的分布。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中chp衍生化单糖标准品的maldi-ms质谱图(chp自身作为基质)，在正离子模式下，不加入其他基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
21.图2为吉拉德试剂t衍生化单糖标准品的maldi-ms质谱图，在正离子模式下，dhb(2,5-二羟基苯甲酸)作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
22.图3为吉拉德试剂t衍生化单糖标准品的maldi-ms质谱图，在正离子模式下，不加入其他基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
23.图4没有进行衍生化的单糖标准品的maldi-ms质谱图，在正离子模式下，dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
24.图5为chp化学衍生化单糖标准品的反应机理和ms/ms碎裂机理。
25.图6为chp衍生化单糖标准品[m+na]
+
的maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下自身作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0026]
图7为吉拉德试剂t衍生化单糖[m]
+
的maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下，dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0027]
图8为单糖[m+na]
+
的maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下，使用dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0028]
图9为chp原位衍生胡萝卜切片的maldi ms原位检测质谱图。
[0029]
图10为chp原位衍生胡萝卜切片的maldi-ms/ms质谱图。
[0030]
图11为chp原位衍生胡萝卜切片的maldi成像结果。(a)胡萝卜切片的组织结构。(b)胡萝卜切片的照片。(c)葡萄糖诊断离子m/z 143的离子图像。(d)果糖诊断离子m/z 110的离子图像。
具体实施方式
[0031]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0032]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]
下述实施例所用质谱仪为maldi-tof-ms(bruker ultraflex,bremen,germany)，该质谱仪配备了固态nd:yag/355nm smartbeam激光器作为离子源。maldi-ms实验在正离子模式下进行，使用flexanalysis和fleximaging软件(bruker daltonics)记录和处理数据。
[0034]
吉拉德试剂t与dhb购于sigma-aldrich公司(st.louis，mo，usa)。
[0035]
实施例1
[0036]
反应性基质1-氯-4-肼基酞嗪与单糖标准品分别以10mm和5mm的浓度溶解在乙腈/乙酸(7:3,v/v)的溶剂中。将5μl反应性基质溶液与5μl单糖溶液混合，涡旋混匀，反应3min，取1μl混合物移到maldi靶(mtp 384target plate ground steel，bruke,bremen,germany)上，自然干燥，用于maldi-ms和maldi-ms/ms实验。
[0037]
图1为chp衍生化单糖标准品的maldi-ms质谱图(chp自身作为基质)，在正离子模
式下，不加入其他基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0038]
由图可知：chp可以对单糖进行衍生化，提高了单糖检测的灵敏度，并且不需要另外添加基质，谱图干净利于解析。
[0039]
衍生化试剂吉拉德试剂t与单糖标准品分别以10mm和5mm的浓度溶解在乙腈/乙酸(7:3,v/v)的溶剂中，maldi基质dhb(2,5-二羟基苯甲酸)以25mg/ml的浓度溶解在乙腈/水(7:3,v/v)的溶剂中。将5μl吉拉德试剂t溶液与5μl单糖溶液混合，涡旋混匀，反应3min，取1μl混合物移到maldi靶上，自然干燥，再加1μl的dhb基质溶液到分析物的结晶上，干燥后用于maldi-ms和maldi-ms/ms实验。
[0040]
图2为吉拉德试剂t衍生化单糖标准品的maldi-ms质谱图，在正离子模式下，dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0041]
衍生化试剂吉拉德试剂t与单糖标准品分别以10mm和5mm的浓度溶解在乙腈/乙酸(7:3,v/v)的溶剂中，maldi基质dhb以25mg/ml的浓度溶解在乙腈/水(7:3,v/v)的溶剂中。将5μl吉拉德试剂t溶液与5μl单糖溶液混合，涡旋混匀，反应3min，取1μl混合物移到maldi靶上，自然干燥，干燥后用于maldi-ms实验。
[0042]
图3为吉拉德试剂t衍生化单糖标准品的maldi-ms质谱图，在正离子模式下，不加入其他基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0043]
单糖标准品以5mm的浓度溶解在乙腈/乙酸(7:3,v/v)的溶剂中，maldi基质dhb以25mg/ml的浓度溶解在乙腈/水(7:3,v/v)的溶剂中。将5μldhb溶液与5μl单糖溶液混合，涡旋混匀，取1μl混合物移到maldi靶上，自然干燥，干燥后用于maldi-ms和maldi-ms/ms实验。
[0044]
图4没有进行衍生化的单糖标准品的maldi-ms质谱图，在正离子模式下，dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0045]
实施例2
[0046]
在maldi-tof-ms上对用lift技术对获得的衍生化产物进行ms/ms实验。maldi ms/ms实验在正离子模式下进行，前体离子检测范围是m/z 50-1000，隔离窗口设置为前体的
±
2da。使用2000hz的激光打5000次得到ms/ms质谱图，使用flexanalysis软件(bruker daltonics)记录和处理成像数据。
[0047]
图6为chp衍生化单糖标准品[m+na]
+
的maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下自身作为基质。(a)葡萄糖((b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0048]
图7为吉拉德试剂t衍生化单糖[m]
+
的maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下，dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0049]
图8为单糖[m+na]
+
的maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下，使用dhb作为基质。(a)葡萄糖(b)果糖(c)岩藻糖(d)阿拉伯糖。
[0050]
实施例3
[0051]
以胡萝卜切片为模型进行maldi质谱成像实验。反应性基质1-氯-4-肼基酞嗪以4mg/ml的浓度溶解在乙腈/乙酸(7:3,v/v)的溶剂中，配制好的基质溶液超声15min以除去基质溶液中溶解的空气。
[0052]
使用基质喷涂仪viktor公司(beijing,cn)喷涂反应性基质到胡萝卜切片上，基质喷涂结束后将切片置于真空干燥器中干燥30min，之后用于maldi-msi实验。基质喷涂仪的参数为：喷涂模式为cc(纵横循环)，喷嘴流速为50ml/min，载玻盘温度为45℃，喷嘴温度为
25℃，喷嘴压力为0.15mpa，喷嘴速度为1500mm/min，喷涂电压为5000v。maldi质谱成像实验在正离子模式下进行，前体离子质量检测范围是m/z 50-1000，分辨率为200μm,每个像素点的成像数据由频率2000hz的激光，激光扫描200次得到。使用fleximaging(bruker daltonics)记录和处理成像数据。选用
±
1.0da的质量窗口生成成像结果，归一化方法采用tic方法。
[0053]
图9为chp原位衍生胡萝卜切片的maldi ms原位检测结果。直接将反应性基质喷涂到生物组织样本上即可完成衍生化，且不需要另外喷涂基质，这简化了样品繁琐的处理过程。此外，衍生化之后的质谱图干净，便于研究人员进行解析。
[0054]
图10为chp原位衍生胡萝卜切片的maldi-ms和maldi-ms/ms质谱图，在正离子模式下。
[0055]
图11为chp原位衍生胡萝卜切片的maldi成像结果。(a)胡萝卜切片的组织结构。(b)胡萝卜切片的照片。(c)葡萄糖诊断离子m/z 143的离子图像。(d)果糖诊断离子m/z 110的离子图像。
[0056]
由图11可知，采用本发明的1-氯-4-肼基酞嗪为反应性基质进行maldi-ms检测，能够对胡萝卜切片中的单糖异构体进行区分，从而揭示单糖异构体在胡萝卜内不同的空间的分布。
[0057]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

技术特征：
1.1-氯-4-肼基酞嗪作为反应性基质在单糖基质辅助激光解吸电离质谱成像maldi msi原位分析中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述单糖包括葡萄糖、果糖、岩藻糖和阿拉伯糖。3.一种单糖基质辅助激光解吸电离质谱成像maldi msi原位分析方法，包括如下步骤：1)将1-氯-4-肼基酞嗪配制成反应性基质溶液；2)将所得反应性基质1-氯-4-肼基酞嗪溶液喷涂到生物样本切片上，真空干燥，之后进行maldi-msi检测，得到生物样本切片的maldi成像结果，根据maldi-ms/ms的质谱成像结果原位确定所述生物样本切片的单糖分布并原位区分各单糖异构体，揭示单糖及单糖异构体在生物体内不同的空间的分布。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述1-氯-4-肼基酞嗪以4mg/ml的浓度溶解在乙腈/乙酸的溶剂中，得到反应性基质溶液。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤2)中，所述生物样本切片为胡萝卜切片、党参切片、甘草切片、山楂切片、枣切片、草莓切片、苹果切片中至少一种。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述喷涂采用基质喷涂仪喷涂到生物样本切片上，基质喷涂仪的参数为：喷涂模式为cc(纵横循环)，喷嘴流速为50ml/min，载玻盘温度为45℃，喷嘴温度为25℃，喷嘴压力为0.15mpa，喷嘴速度为1500mm/min，喷涂电压为5000v。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：maldi质谱成像在正离子模式下进行，质量检测范围是m/z 50-1000，分辨率为200μm,每个像素点的成像数据由频率2000hz的激光，激光扫描200次得到。

技术总结
本发明公开了1-氯-4-肼基酞嗪作为反应性基质在单糖MALDIMSI原位分析中的应用。所述单糖包括葡萄糖、果糖、岩藻糖和阿拉伯糖。本发明开发了1-氯-4-肼基酞嗪(CHP)作为反应性基质，对生物组织中的单糖进行衍生化以及对单糖的异构体进行原位区分。以胡萝卜作为模型，对胡萝卜组织上的单糖进行衍生化，并进行MALDI-MSI实验，值得注意的是衍生化产物的二级质谱产生的特征碎片可以继续用于区分醛糖与酮糖，从而对单糖异构体进行区分，揭示单糖异构体在生物体内不同的空间的分布。生物体内不同的空间的分布。生物体内不同的空间的分布。


技术研发人员：白承灵 李书沐 赵镇文
受保护的技术使用者：中国科学院化学研究所
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/31