一种日勾维多细菌源菌检验用培养基及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于化妆品微生物检验领域，涉及一种日勾维多细菌源菌检验用培养基及其制备方法和应用，特别涉及化妆品中日勾维多细菌源菌检验用培养基及其检验方法。


背景技术：

2.日勾维多细菌源菌(pluralibacter gergoviae)在2013年之前被称为日沟维肠杆菌(enterobacter gergoviae)，是兼性厌氧的革兰氏阴性菌，为肠道正常菌群，属于条件致病菌，在人体免疫力低下时能引起泌尿系统、呼吸系统感染以及菌血症，是常见的院内感染致病菌。日勾维多细菌源菌对多种化妆品防腐剂(如：三氯生、对羟基苯甲酸酯类防腐剂)均具有较强的耐受性，在面膜、面霜以及淋洗类化妆品中较常见，其检出率远高于《化妆品安全技术规范》(2015年版)中的条件致病菌(控制菌)：大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌。近年来，美国fda以及欧盟非食品类消费品快速预警系统(eu rapid alert system)发布了多批化妆品因污染日勾维多细菌源菌被召回的事件，且德国已经明确规定化妆品中不能含有日勾维多细菌源菌。
3.目前，日勾维多细菌源菌的研究主要集中在临床研究、防腐剂耐受性及抗生素耐受性等方面，各国化妆品微生物检验方法中均没有针对日勾维多细菌源菌的检验方法，只有澳大利亚的sy-lab公司声称开发了针对日勾维多细菌源菌的快速检测试剂盒riboflow p/en，但该方法针对的是整个肠杆菌科的细菌，不具有专一性。由于日勾维多细菌源菌潜在的危害性，欧美等多个国家已经禁止化妆品中检出日勾维多细菌源菌，然而目前国内外均未报道化妆品中日勾维多细菌源菌检验方法，因此有必要建立化妆品中日勾维多细菌源菌的检验方法。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种日勾维多细菌源菌检验用培养基及其制备方法和应用。
5.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种日勾维多细菌源菌检验用培养基，所述日勾维多细菌源菌检验用培养基包括双倍葡萄糖胆盐培养基和卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基；
7.所述双倍葡萄糖胆盐培养基包括蛋白胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、猪胆盐、葡萄糖、磷酸氢二钾、溴甲酚紫、卵磷脂和吐温80；
8.所述卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基包括卵磷脂吐温80琼脂培养基、柠檬酸铁和七叶苷。
9.本发明开发选择性培养日勾维多细菌源菌的培养基和能与日勾维多细菌源菌产生特异性颜色变化的鉴别培养基，建立相应的日勾维多细菌源菌检验方法，可有效的检出化妆品中的日勾维多细菌源菌，操作简便，准确性高。
10.优选地，所述双倍葡萄糖胆盐培养基以质量浓度计包括蛋白胨15-19g/l、大豆木
瓜蛋白酶水解物4-8g/l、猪胆盐10-14g/l、葡萄糖18-22g/l、磷酸氢二钾4-6g/l、溴甲酚紫0.02-0.03g/l、卵磷脂2-3g/l和吐温80 12-16g/l。
11.所述蛋白胨的质量浓度可以选择15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l等，所述大豆木瓜蛋白酶水解物的质量浓度可以选择4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l等，所述猪胆盐的质量浓度可以选择10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l等，所述葡萄糖的质量浓度可以选择18g/l、19g/l、20g/l、21g/l、22g/l等，所述磷酸氢二钾的质量浓度可以选择4g/l、4.5g/l、5g/l、5.5g/l、6g/l等，所述溴甲酚紫的质量浓度可以选择0.02g/l、0.021g/l、0.022g/l、0.023g/l、0.024g/l、0.025g/l、0.026g/l、0.027g/l、0.028g/l、0.029g/l、0.03g/l等，所述卵磷脂的质量浓度可以选择2g/l、2.1g/l、2.2g/l、2.3g/l、2.4g/l、2.5g/l、2.6g/l、2.7g/l、2.8g/l、2.9g/l、3g/l等，所述吐温80的质量浓度可以选择12g/l、12.5g/l、13g/l、13.5g/l、14g/l、14.5g/l、15g/l、15.5g/l、16g/l等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
12.优选地，所述卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基以质量浓度计包括七叶苷0.8-1.2g/l和柠檬酸铁0.4-0.5g/l。
13.所述七叶苷的质量浓度可以选择0.8g/l、0.85g/l、0.9g/l、0.95g/l、1g/l、1.05g/l、1.1g/l、1.15g/l、1.2g/l等，所柠檬酸铁的质量浓度可以选择0.41g/l、0.42g/l、0.43g/l、0.44g/l、0.45g/l、0.46g/l、0.47g/l、0.48g/l、0.49g/l、0.5g/l等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
14.第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基的制备方法，所述双倍葡萄糖胆盐培养基的制备方法包括：将蛋白胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、猪胆盐、葡萄糖、磷酸氢二钾、卵磷脂、吐温80、溴甲酚紫与水混合；
15.所述卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基的制备方法包括：将七叶苷、柠檬酸铁与卵磷脂吐温80琼脂培养基混合。
16.优选地，卵磷脂、吐温80与水混合前，还包括将卵磷脂和吐温80分别加热至溶解。
17.优选地，所述双倍葡萄糖胆盐培养基的ph为7.2-7.6，例如7.2、7.3、7.4、7.5、7.6等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
18.第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基在检验化妆品日勾维多细菌源菌污染中的应用。
19.优选地，所述日勾维多细菌源菌检验用培养基的使用方法包括：
20.(1)将供试液与双倍葡萄糖胆盐培养基混合培养，得到培养液；
21.(2)若步骤(1)所述培养基未发生颜色变化、未产生气体，则供试液中不含日勾维多细菌源菌，终止实验；
22.若步骤(1)所述培养基发生颜色变化且产生气体，取培养液于卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基培养，若培养基上的菌落为灰色至深褐色，菌落周围的培养基为褐色至深褐色，则供试液中存在日勾维多细菌源菌。
23.采用上述方法检验日勾维多细菌源菌操作简便，且准确性高。
24.优选地，步骤(1)所述混合培养的温度为35-37℃，时间为46h-50h。
25.所述混合培养的温度可以选择35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃等，时间可以选择46h、46.5h、47h、47.5h、48h、48.5h、49h、49.5h、50h等，上述数值范围内其他具体点值均可
选择，在此便不再一一赘述。
26.优选地，步骤(2)所述培养的温度为35-37℃，时间为46h-50h。
27.所述混合培养的温度可以选择35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃等，时间可以选择46h、46.5h、47h、47.5h、48h、48.5h、49h、49.5h、50h等，上述数值范围内其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
28.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
29.本发明开发选择性培养日勾维多细菌源菌的培养基和能与日勾维多细菌源菌产生特异性颜色变化的鉴别培养基，建立相应的日勾维多细菌源菌检验方法，可有效的检出化妆品中的日勾维多细菌源菌，操作简便，准确性高。
附图说明
30.图1是日勾维多细菌源菌检验方法流程图。
31.图2是化妆品中常见致病菌/条件致病菌在双倍葡萄糖胆盐培养基中的生长情况。
32.图3是日勾维多细菌源菌、大肠埃希氏菌和阴沟肠杆菌在卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上，36℃培养48h后的生长情况。
33.图4是日勾维多细菌源菌、大肠埃希氏菌和阴沟肠杆菌在改良emb培养基上的生长情况。
34.图5是日勾维多细菌源菌、大肠埃希氏菌和阴沟肠杆菌混合菌在同一个卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上的生长情况，数字1、2和3为挑选鉴定的菌落。
具体实施方式
35.下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
36.实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
37.下述实施例涉及的产品中包含的功效成分来源方式如下(仅体现功效成分，其他市售原料中含有的必要辅料成分不再赘述)：
38.蛋白胨来源于购自oxoid公司的商品名为tryptone的产品；
39.大豆木瓜蛋白酶水解物来源于购自山东拓普生物工程有限公司的商品名为大豆木瓜蛋白水解物的产品；
40.猪胆盐来源于购自广东环凯微生物科技有限公司公司的商品名为猪胆盐的产品；
41.吐温80来源于购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司的商品名为吐温80 的产品；
42.卵磷脂来源于购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司的商品名为卵磷脂的产品；
43.卵磷脂吐温80琼脂培养基来源于购自广东环凯微生物科技有限公司公司的商品名为卵磷脂吐温80营养琼脂的产品；
44.七叶苷来源于购自生工生物(上海)股份公司的商品名为七叶苷的产品。
45.下述内容中涉及的双倍葡萄糖胆盐培养基以质量浓度计包括蛋白胨17g/l、大豆
木瓜蛋白酶水解物6g/l、猪胆盐10g/l、葡萄糖20g/l、磷酸氢二钾5g/l、5ml 0.4％溴甲酚紫水溶液，卵磷脂2g/l、吐温80 14g/l，调节ph至7.4，混匀后分装试管，每管10ml(每支试管中加入一个倒置的小管)，115℃高压灭菌20min。
46.下述内容中涉及的卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基以质量浓度计包括七叶苷1.0g/l、柠檬酸铁0.5g/l，121℃高压灭菌15min。
47.日勾维多细菌源菌检验方法：
48.(1)选择性培养：取1:10(g(ml)/ml)供试液10ml加入10ml双倍葡萄糖胆盐培养基中，于36℃静置培养48h，观察产酸、产气情况。若双倍葡萄糖胆盐培养基的颜色从紫色变成黄色且产气，表明化妆品中可能存在日勾维多细菌源菌；
49.(2)鉴别性培养：取1:10供试液10ml加入10ml双倍葡萄糖胆盐培养基，于36℃静置培养48h后，用10μl接种环取一环，采用4区划线法划线于卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基，于36℃静置培养48h，观察菌落及菌落周围培养基的颜色变化。日勾维多细菌源菌在卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上的典型菌落为灰色至深褐色，菌落周围的培养基为褐色至深褐色。
50.日勾维多细菌源菌检验方法流程图如图1所示。
51.实施例1
52.日勾维多细菌源菌在双倍葡萄糖胆盐培养基中的生长情况
53.实验方法：向10ml双倍葡萄糖胆盐培养基中加入9.9ml生理盐水，然后加入100μl(100cfu)日勾维多细菌源菌atcc 33028、化妆品中分离的日勾维多细菌源菌3526和6286、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102、金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003、铜绿假单胞菌cmcc(b)10104、阴沟肠杆菌cmcc(b)43501和洋葱伯克霍尔德菌atcc 25416，置于36℃培养48h，观察产酸、产气情况。
54.实验结果：如图2所示，日勾维多细菌源菌(atcc 33028、3526和6286)、大肠埃希氏菌和阴沟肠杆菌在双倍葡萄糖胆盐培养基中产酸、产气，金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌以及洋葱伯克霍尔德菌atcc 25416在双倍葡萄糖胆盐培养基中既不产酸、也不产气。因此，可利用双倍葡萄糖胆盐培养基初步选择化妆品中的日勾维多细菌源菌、大肠埃希氏菌或阴沟肠杆菌等耐胆盐革兰氏阴性菌。
55.实施例2
56.日勾维多细菌源菌在卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基中的生长情况
57.实验方法：日勾维多细菌源菌atcc 33028、3526和6286、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102、金黄色葡萄球菌cmcc(b)26003、铜绿假单胞菌cmcc(b)10104、阴沟肠杆菌cmcc(b)43501和洋葱伯克霍尔德菌atcc 25416在tsb培养基中于36℃培养过夜，采用4区划线法划线于卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基上，于36℃培养48h，观察菌落及菌落周围培养基颜色变化。
58.实验结果：图3结果显示，日勾维多细菌源菌(atcc 33028、3526和6286)的菌落在卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基中呈现灰色至深灰色，菌落周围培养基的颜色呈褐色至深褐色；大肠埃希氏菌cmcc(b)44102的菌落为土黄色，菌落边缘不光滑且菌落周围培养基未变色；阴沟肠杆菌cmcc(b)43501的菌落和菌落周围培养基的颜色均为浅灰色。由此可见，卵磷脂吐温80-七叶苷培养基可有效的区分日勾维多细菌源菌、大肠埃希氏菌和阴沟肠杆
33028、3526和6286)和大肠埃希氏菌，但不能区分阴沟肠杆菌。
73.实施例5
74.化妆品中日勾维多细菌源菌检验方法验证
75.日勾维多细菌源菌检验方法：首先利用双倍葡萄糖胆盐培养基选择性富集化妆品中的日勾维多细菌源菌，然后利用卵磷脂吐温80-七叶苷培养基来区分日勾维多细菌源菌与化妆品中其它污染菌。
76.实验方法1：先向10ml双倍葡萄糖胆盐培养基中加入9.9ml生理盐水，然后分别接种100μl(100cfu)的日勾维多细菌源菌atcc 33028、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102和阴沟肠杆菌cmcc(b)43501于双倍葡萄糖胆盐培养基中；另取一管双倍葡萄糖胆盐培养基作为对照。将加入菌的双倍葡萄糖胆盐培养基置于36℃培养48h，观察产酸产气情况。然后划线于卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基中，置于36℃培养48h，观察菌落及菌落周围培养基颜色变化。该部分结果与实施例2的结果一致，结果未展示。
77.实验方法2：为了更好地说明该方法可有效的检出化妆品中的日勾维多细菌源菌，将两批化妆品样品制成1:10供试液，然后取10ml供试液加入10ml双倍葡萄糖胆盐培养基中，再分别同时接入100cfu的日勾维多细菌源菌atcc 33028、大肠埃希氏菌cmcc(b)44102和阴沟肠杆菌cmcc(b)43501，培养48h后，划线至卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上。
78.结果如图5所示，根据菌落以及菌落周围培养基的颜色可知，样品1和样品2的卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上，1号菌落为深灰色且菌落周围培养基为褐色，可知1号菌落为日勾维多细菌源菌；2号菌落为浅灰色且菌落周围培养基未变色，可知2号菌落为阴沟肠杆菌；3号菌落为土黄色且菌落周围培养基未变色，可知3号菌落为大肠埃希氏菌。
79.实施例6
80.化妆品样品中日勾维多细菌源菌的检测
81.日勾维多细菌源菌检验方法：取10批化妆品样品，用生理盐水制成1:10(g(ml)/ml)供试液，取10ml供试液加入到10ml双倍葡萄糖胆盐培养基中，置于36℃培养48h，观察产酸、产气。然后划线于卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上，置于36℃培养48h，观察菌落的生长及培养基颜色变化。将卵磷脂吐温80-七叶苷培养基中生长的细菌进行分离纯化，然后利用质谱进行鉴定，验证分离的细菌是否为日勾维多细菌源菌，结果如表3所示。
82.表3
83.化妆品样品双倍葡萄糖胆盐培养基卵磷脂吐温80-七叶苷培养基黄皮肤护理膏产酸、产气菌落及培养基均为深褐色修护面膜——鱼子酱去屑洗发水——香水沐浴露——氨基酸洁面乳——沐浴露——保湿护手霜——控油保湿面膜——洁净沐浴皂液——精华水乳液——
84.实验结果：利用建立的日勾维多细菌源菌检验方法，探究化妆品中日勾维多细菌源菌的污染情况。选取10批化妆品为试验样品，将1:10(g(ml)/ml)供试液接入10ml双倍葡萄糖胆盐培养基中，36℃培养48h，划线于卵磷脂吐温80-七叶苷培养基上。结果显示有一批化妆品(黄皮肤护理膏)在双倍葡萄糖胆盐培养基中产酸、产气；在卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基上的菌落和菌落周围培养基均为褐色，两个实验结果均呈现日勾维多细菌源菌的反应特征，经分离纯化后，经质谱鉴定为日勾维多细菌源菌。由此可见，本发明建立的日勾维多细菌源菌检验方法可准确的检测出化妆品中的日勾维多细菌源菌。
85.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种日勾维多细菌源菌检验用培养基及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
86.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
87.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

技术特征：
1.一种日勾维多细菌源菌检验用培养基，其特征在于，所述日勾维多细菌源菌检验用培养基包括双倍葡萄糖胆盐培养基和卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基；所述双倍葡萄糖胆盐培养基包括蛋白胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、猪胆盐、葡萄糖、磷酸氢二钾、溴甲酚紫、卵磷脂和吐温80；所述卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基包括卵磷脂吐温80琼脂培养基、柠檬酸铁和七叶苷。2.根据权利要求1所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基，其特征在于，所述双倍葡萄糖胆盐培养基以质量浓度计包括蛋白胨15-19g/l、大豆木瓜蛋白酶水解物4-8g/l、猪胆盐10-14g/l、葡萄糖18-22g/l、磷酸氢二钾4-6g/l、溴甲酚紫0.02-0.03g/l、卵磷脂2-3g/l和吐温80 12-16g/l。3.根据权利要求1或2所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基，其特征在于，所述卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基以质量浓度计包括七叶苷0.8-1.2g/l和柠檬酸铁0.4-0.5g/l。4.根据权利要求1-3中任一项所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基的制备方法，其特征在于，所述双倍葡萄糖胆盐培养基的制备方法包括：将蛋白胨、大豆木瓜蛋白酶水解物、猪胆盐、葡萄糖、磷酸氢二钾、卵磷脂、吐温80、溴甲酚紫与水混合；所述卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基的制备方法包括：将七叶苷、柠檬酸铁与卵磷脂吐温80琼脂培养基混合。5.根据权利要求4所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基的制备方法，其特征在于，卵磷脂、吐温80与水混合前，还包括将卵磷脂和吐温80分别加热至溶解。6.根据权利要求4或5所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基的制备方法，其特征在于，所述双倍葡萄糖胆盐培养基的ph为7.2-7.6。7.根据权利要求1-6中任一项所述的日勾维多细菌源菌检验用培养基在检验化妆品日勾维多细菌源菌污染中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述日勾维多细菌源菌检验用培养基的使用方法包括：(1)将供试液与双倍葡萄糖胆盐培养基混合培养，得到培养液；(2)若步骤(1)所述培养基未发生颜色变化、未产生气体，则供试液中不含日勾维多细菌源菌，终止实验；若步骤(1)所述培养基发生颜色变化且产生气体，取培养液于卵磷脂吐温80-七叶苷琼脂培养基培养，若培养基上的菌落为灰色至深褐色，菌落周围的培养基为褐色至深褐色，则供试液中存在日勾维多细菌源菌。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述混合培养的温度为35-37℃，时间为46-50h。10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述培养的温度为35-37℃，时间为46-50h。

技术总结
本发明涉及一种日勾维多细菌源菌检验用培养基及其制备方法和应用，所述检验用培养基包括双倍葡萄糖胆盐培养基和卵磷脂吐温80-七叶苷培养基。日勾维多细菌源菌检验方法分为2步：第一步利用双倍葡萄糖胆盐培养基选择性培养日勾维多细菌源菌，第二步利用日勾维多细菌源菌代谢七叶苷产生的化合物与柠檬酸铁结合产生特异性的颜色反应，从而鉴别日勾维多细菌源菌与其它污染菌。本发明所述日勾维多细菌源菌检验用培养基的检验方法简便，准确性高。准确性高。准确性高。


技术研发人员：刘丰 周志 罗俊 王晓冲 王平 王冰 王晓炜 应国红
受保护的技术使用者：深圳市药品检验研究院（深圳市医疗器械检测中心）
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/31