普拉梭菌在制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品中的应用的制作方法

1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种普拉梭菌在制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品中的应用。


背景技术：

2.急性胰腺炎(acutepancreatitis，ap)是临床上最常见的急性腹部疾病之一，表现为发病迅急并产生严重的腹痛感，其组织学特征是腺泡细胞损伤和实质性炎性浸润，临床表现从局部炎症到破坏性的全身性病理状况不等。急性胰腺炎的严重程度通常是轻度的，但高达20％的患者会发展为重度急性胰腺炎(severeacutepancreatitis，sap)，可能会引发多器官功能障碍综合症和全身炎症反应综合征，并伴有高达30％的死亡率。然而，目前临床上能有效改善和治疗ap的药物不多。
3.肠道免疫系统的建立在ap病程中发挥着重要的作用，而肠道菌群是构成肠粘膜免疫系统的生物学屏障，在一定程度上决定了ap的严重程度。肠道菌群主要由专性厌氧菌、兼性厌氧菌和需氧菌组成，其中专性厌氧菌占99％以上。普拉梭菌(faecalibacteriumprausnitzii)为严格的专性厌氧革兰氏阴性杆菌，主要分布在人和动物的肠道中，约占人体总菌群丰度的5％～15％，为人体肠道主要优势菌群之一。研究表明，补充普拉梭菌可调节机体免疫、缓解炎症性疾病，其具有抗炎、免疫调节、抗氧化、维护肠道黏膜屏障完整性等诸多益生功能，但普拉梭菌在急性胰腺炎中是否具有缓解和治疗作用仍尚不清楚，也未见有任何相关研究的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种普拉梭菌的新用途——用于制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品，以克服现有改善和治疗急性胰腺炎的药物不足的问题。所述普拉梭菌的保藏号为atcc27766，该菌株对雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠发挥保护作用，缓解胰腺组织损伤和回肠组织损伤程度，可作为有效成分应用到防治急性胰腺炎的药物、保健食品等产品的制备中。
5.为达到上述目的，本发明首先提供了一种普拉梭菌在制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品中的应用，所述普拉梭菌的保藏号为atcc27766。
6.优选地，所述产品包括(1)～(4)作用中的至少一种：
7.(1)缓解胰腺水肿、腺泡细胞损伤及炎症细胞浸润；
8.(2)下调促炎因子il-1β、il-6和tnf-α的表达水平，上调抑炎因子il-10的表达水平；
9.(3)缓解回肠组织损伤；
10.(4)减轻肠道屏障功能损伤。
11.优选地，所述产品包括药物、保健食品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料
添加剂。
12.本发明另一方面还提供了一种预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，所述药物包括普拉梭菌atcc27766。
13.优选地，所述药物还包括药学上可接受的药用载体和/或药用辅料。
14.优选地，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。
15.优选地，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
16.本发明另一方面还提供了一种预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的食品或饲料，所述食品或饲料包括普拉梭菌atcc27766。
17.本发明另一方面还提供了一种普拉梭菌在制备改善肠屏障功能的产品中的应用，所述普拉梭菌的保藏号为atcc27766。
18.相对于现有技术，本发明的有益效果至少包括：
19.本发明通过雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型实验，验证了普拉梭菌atcc27766对急性胰腺炎的缓解和改善作用，该菌株能有效缓解急性胰腺炎小鼠胰腺组织损伤程度(水肿，炎症渗出和腺泡细胞损伤)、回肠组织损伤程度，还能够减轻肠道屏障功能损伤，改善肠屏障功能。所述普拉梭菌atcc27766可用于制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物等产品，具有广泛的应用前景。
附图说明
20.图1表示普拉梭菌atcc27766菌株对急性胰腺炎小鼠胰腺组织损伤的改善作用；其中：
21.a为各组小鼠胰腺组织he染色结果对比图；
22.b为各组小鼠胰腺组织he染色评分对比。
23.图2表示普拉梭菌atcc27766菌株对急性胰腺炎小鼠胰腺组织中炎症因子的调节作用；其中：
24.a为各组小鼠胰腺组织中il-1βmrna表达水平对比图；
25.b为各组小鼠胰腺组织中il-6mrna表达水平对比图；
26.c为各组小鼠胰腺组织中tnf-αmrna表达水平对比图；
27.d为各组小鼠胰腺组织中il-10mrna表达水平对比图。
28.图3表示普拉梭菌atcc27766菌株对急性胰腺炎小鼠回肠组织损伤的改善作用；其中：
29.a为各组小鼠回肠组织he染色结果对比图；
30.b为各组小鼠回肠组织he染色评分对比。
31.图4表示普拉梭菌atcc27766菌株对急性胰腺炎小鼠肠道屏障功能损伤的改善作用；其中：
32.a为各组小鼠肠道紧密连接蛋白occludin的免疫荧光检测对比图；
33.b为各组小鼠肠道紧密连接蛋白claudin-1的免疫荧光检测对比图。
34.其中，con表示正常对照组，fp表示普拉梭菌atcc27766灌胃组，ap表示急性胰腺炎模型组，ap+fp表示急性胰腺炎模型+普拉梭菌atcc 27766治疗组；
35.数据展示为平均值
±
标准误差。p《0.05，**：p《0.01，***：p《0.001表示采用anova
检验方法。
具体实施方式
36.以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
37.如前所述，急性胰腺炎是一种炎症性胰腺疾病，是全世界最常见的消化系统疾病之一，目前临床上缺乏有效的治疗药物。为解决该问题，寻找一种有效预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，本发明课题组经过大量的研究，分析比较了健康人群与复发性急性胰腺炎患者的肠道微生物群落组成。宏基因组的结果显示，急性胰腺炎患者肠道中的普拉梭菌相对丰度显著下降，与此相对应的，急性胰腺炎的复发频率也与普拉梭菌的相对丰度成明显的负相关性，这提示普拉梭菌可能对急性胰腺炎具有潜在的保护作用。基于前述研究，本发明课题组通过雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型实验，评价并验证了普拉梭菌对急性胰腺炎的防治作用。
38.基于上述，本发明第一个目的是提供普拉梭菌的新用途——在制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品中的应用，所述普拉梭菌的保藏号为atcc 27766。
39.一些实施例中，所述产品包括药物、保健食品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。
40.本发明另一个目的是提供一种预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，所述药物的活性成分包括普拉梭菌atcc27766。
41.一些实施例中，所述药物还包括药学上可接受的药用载体和/或药用辅料。所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒、脂质体；所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、赋形剂、附加剂、释放阻滞剂中的一种或几种。
42.一些实施例中，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
43.一些实施例中，所述保健食品还包括食品添加剂，所述食品添加剂选自：酸度调节剂、抗结剂、消泡剂、抗氧化剂、漂白剂、膨松剂、着色剂、护色剂、酶制剂、增味剂、营养强化剂、防腐剂、甜味剂、增稠剂、香料。
44.本发明另一个目的是提供一种预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的食品或饲料，所述食品或饲料的活性成分包括普拉梭菌atcc27766。
45.本发明另一个目的是提供一种普拉梭菌在制备改善肠屏障功能的产品中的应用，所述普拉梭菌的保藏号为atcc27766。
46.本发明通过雨蛙素诱导急性胰腺炎小鼠模型实验验证了普拉梭菌atcc27766在缓解和改善急性胰腺炎的作用。下面将结合附图和具体实验过程详细讲述。
47.下述实施例中所使用的实验方法或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
48.(一)实验材料
49.1、菌株
50.本发明普拉梭菌atcc27766购自美国典型培养物保藏中心atcc(manassas，va，usa)，产品名称：faecalibacteriumprausnitziiatcc27766。
51.2、实验动物
52.本发明使用的实验动物为spf级6到8周龄雄性c57bl/6小鼠。由上海交通大学医学院附属第一人民医院实验动物中心向上海公共卫生临床中心订购并统一饲养于实验动物中心spf级区域。本动物实验已通过医院伦理审批，伦理(iacuc)号为(2020aw095)。
53.(二)实验方法
54.1、普拉梭菌的培养
55.普拉梭菌atcc27766被严格厌氧培养在添加2％琼脂(m/v)的m2gsc培养基中。收集对数生长期的菌液，4℃、8000g离心10分钟，去上清，用无菌生理盐水将菌泥洗涤2次，重悬菌泥于体积分数为30％(v/v)的甘油中，备用；也可于-80℃冰箱保存。
56.2、雨蛙肽诱导的小鼠急性胰腺炎模型的建立及实验分组
57.8周龄左右的20～23g雄性c57bl/6j小鼠随机分为3组(每组6只)，分别为正常对照组(con)、普拉梭菌组(fp)、急性胰腺炎模型组(ap)和急性胰腺炎模型+普拉梭菌治疗组(fp+ap组)。采用腹腔注射雨蛙素的方式诱导急性胰腺炎模型：造模当天，将雨蛙素溶于生理盐水中，ap组和fp+ap组小鼠每小时注射一针雨蛙素(100g/kg体重)，连续注射10针，最后一次注射雨蛙素溶液的同时注射5mg/kg的脂多糖；con组和fp组小鼠注射等体积生理盐水。造模前7天每天采用灌胃的方式给予fp组和fp+ap组每只小鼠含3％甘油的5
×
109cfu/ml的普拉梭菌活菌菌液200ml，其余两组小鼠灌胃等量含3％甘油的生理盐水。
58.最后一针注射完成后，向小鼠注射致死剂量的戊巴比妥钠并快速收集回肠和胰腺等组织样品。
59.(三)实验结果
60.1、普拉梭菌atcc27766缓解急性胰腺炎小鼠胰腺组织水肿及炎症浸润程度
61.用h&e染色的方法，将con组、fp组、ap组和fp+ap组小鼠胰腺经固定、脱水、染色、脱蜡透明和封片等主要过程，观察胰腺组织的组织完整性、胰腺水肿程度和炎症细胞浸润程度。
62.结果如图1中a-b图所示，con组和fp组小鼠胰腺组织结构紧密，无明显裂纹；ap组小鼠胰腺组织观察到明显的腺泡细胞空泡和死亡、大量炎症细胞浸润和导管扭曲阻寒等情况，胰腺组织损伤明显。而相较于ap组，fp+ap组小鼠胰腺组织损伤状况有了明显改善，组织学评分显著升高(p《0.05)。
63.上述实验结果表明，经普拉梭菌atcc27766处理后，能够对急性胰腺炎小鼠的胰腺损伤发挥明显的保护和缓解作用。
64.2、普拉梭菌atcc27766调节急性胰腺炎小鼠胰腺组织中炎症因子的释放
65.采用荧光定量pcr法测定小鼠胰腺中促炎因子il-6、tnf-α和il-1β，以及抑炎因子il-10的mrna表达相对含量。具体包括：各组小鼠胰腺组织样品通过使用高通量组织研磨机在trizo1中进行破碎后，使用氯仿等进行抽提，离心吸取上清，加入等体积的异丙醇进行沉淀rna，离心弃上清，用75％乙醇洗涤所得rna；对得到的rna进行浓度和纯度的测量后，使用takara反转录试剂盒将组织样品中的rna反转到cdna，根据mrna设计的引物在正式实验前需进行qpcr测试其特异性和扩增效率，得到结果后，首先根据熔解曲线判断引物特异性，选
择标准为单峰，峰形偏窄，无明显引物二聚体熔解曲线峰，引物验证结果良好后进行正式实验。使用sybrgreen mix进行相关基因的扩增检测，扩增程序为：55℃预热30秒；95℃、30秒；接下来循环45次；95℃10秒；60℃30秒。之后进行引物特异性检测，从65℃保持5秒之后每秒上升0.1℃至95℃，观察引物特异性。
66.实验结果如图2中a-d图所示，与con组和fp组相比，ap组小鼠胰腺组织中的促炎因子tnf-α(p《0.001)、il-6(p《0.001)和il-1β(p《0.001)的表达水平明显上升，抑炎因子il-10(p《0.05)的表达水平显著下降，而相较于ap组，fp+ap组小鼠胰腺组织中il-6(p《0.001)、tnf-α(p《0.001)和il-1β(p《0.001)的表达水平均明显下降，il-10(p《0.001)的表达水平明显上升。
67.上述实验结果表明，经过普拉梭菌atcc27766处理后，能够抑制急性胰腺炎小鼠胰腺组织中促炎因子的产生，促进抑炎因子的释放。
68.3、普拉梭菌atcc27766缓解急性胰腺炎小鼠回肠组织损伤
69.用h&e染色的方法，将con组、fp组、ap组和fp+ap组小鼠回肠组织经固定、脱水、染色、脱蜡透明和封片等主要过程，观察回肠组织固有层炎性细胞浸润情况、上皮细胞完整性和水肿程度。
70.结果如图3中a-b图所示，con组和fp组小鼠回肠组织的黏膜上皮细胞完整，隐窝正常，腺体排列整齐，无溃疡；ap组小鼠回肠组织固有层炎性细胞浸润，腺体紊乱，可见严重溃疡，黏膜糜烂严重，隐窝被破坏。而相较于ap组，fp+ap组小鼠回肠组织黏膜未显示明显糜烂，隐窝相对完整，腺体排列整齐，组织形态与con组相似，组织学评分明显升高(p《0.05)。
71.上述实验结果表明，经过普拉梭菌atcc27766处理后，能够缓解急性胰腺炎小鼠回肠组织损伤。
72.4、普拉梭菌atcc27766增加急性胰腺炎小鼠中肠道屏障蛋白的表达
73.使用免疫荧光的方法对小鼠回肠组织中紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达进行检测。细胞核使用dapi染料进行定位，显示为蓝色荧光，occludin和claudin-1显示为绿色荧光。
74.结果如图4中a-b图所示，con组和fp组小鼠的回肠组织中绿色荧光明显，肠道形态完整，说明occludin和claudin-1在正常状态的小鼠回肠中表达很高；ap组小鼠回肠组织中occludin和claudin-1的表达量很低，肠道屏障功能受损；而相较于ap组，fp+ap组小鼠组织中绿色荧光的荧光强度明显升高，occludin和claudin-1的表达量显著上调。
75.上述实验结果表明，经过普拉梭菌atcc27766处理后，可有效增加急性胰腺炎小鼠肠道内肠道紧密连接蛋白occludin和claudin-1的表达，改善肠屏障功能。
76.综上所述，本发明通过雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型实验，验证了普拉梭菌atcc27766对急性胰腺炎的缓解和改善作用，所述普拉梭菌atcc 27766可用于制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物等产品，具有广泛的应用前景。
77.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

技术特征：
1.普拉梭菌在制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品中的应用，其特征在于，所述普拉梭菌的保藏号为atcc27766。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括(1)～(4)作用中的至少一种：(1)缓解胰腺水肿、腺泡细胞损伤及炎症细胞浸润；(2)下调促炎因子il-1β、il-6和tnf-α的表达水平，上调抑炎因子il-10的表达水平；(3)缓解回肠组织损伤；(4)减轻肠道屏障功能损伤。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、保健食品、肠内营养制剂、膳食补充剂、兽药或者饲料添加剂。4.一种预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药物包括普拉梭菌atcc27766。5.如权利要求4所述的预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的药用载体和/或药用辅料。6.如权利要求5所述的预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药用辅料包含赋形剂和/或附加剂。7.如权利要求4所述的预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。8.一种预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的食品或饲料，其特征在于，所述食品或饲料包括普拉梭菌atcc27766。9.普拉梭菌在制备改善肠屏障功能的产品中的应用，其特征在于，所述普拉梭菌的保藏号为atcc27766。

技术总结
本发明公开了普拉梭菌在制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的产品中的应用，涉及益生菌领域。所述普拉梭菌的保藏号为ATCC27766。本发明通过雨蛙素诱导的急性胰腺炎小鼠模型实验，验证了普拉梭菌ATCC27766对急性胰腺炎的缓解和改善作用，该菌株能有效缓解急性胰腺炎小鼠胰腺组织损伤(水肿，炎症渗出和腺泡细胞损伤)和回肠组织损伤，还能够减轻肠道屏障功能损伤，改善肠屏障功能，可用于制备预防、改善和/或治疗急性胰腺炎的药物等产品，具有广泛的应用前景。泛的应用前景。泛的应用前景。


技术研发人员：曾悦 秦文飞 肖炜 许缤强 梅启享 黄春兰 范俊杰 黄则华 殷诺铭 黄慧珍
受保护的技术使用者：上海市第一人民医院
技术研发日：2023.05.31
技术公布日：2023/8/31