一组多取代的喹啉类化合物及其用途

1.本发明属于医药生物技术领域，具体的，涉及一组多取代的喹啉类化合物及其用途。


背景技术：

2.代谢综合征是指人体的蛋白质、脂肪、碳水化合物等物质发生代谢紊乱的病理状态，是一组复杂的代谢紊乱症候群，是导致糖尿病和心脑血管疾病等的危险因素。代谢综合征是由物质或能量代谢异常引起代谢紊乱而导致的全身多系统异常的疾病，包括肥胖(obesity)、高脂血症(hyperlipidaemia)、非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,nafld，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)、肝纤维化、肝硬化以及肝癌等)、代谢相关脂肪性肝病、动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)、2型糖尿病(type 2diabetes mellitus,t2dm)、胰岛素抵抗、衰老、高血压、以及高尿酸等疾病[int j mol sci.2022jan 12；23(2):786.doi:10.3390/ijms23020786.]，导致代谢综合征的因素包括高热量的饮食、缺乏锻炼、遗传因素、个体衰老等，这些因素导致能量摄入大大超过能量消耗，使得代谢综合征的患病率逐年攀升，引发了全球范围的健康威胁。
[0003]
目前，治疗代谢综合征的药物主要针对糖脂代谢调节过程。虽然目前已上市的代谢综合征疾病治疗药物具有一定疗效，但大多数药物存在局限性和副作用，制约其临床应用。如临床上广泛应用的他汀类药物能够降低as相关的心血管事件，但其长期服用可能造成的肌痛、肝损伤和神经系统副作用也不容忽视[curr probl cardiol.2022dec；47(12):101342.doi:10.1016/j.cpcardiol.2022.101342.epub 2022jul 31.]。用于治疗t2dm的噻唑烷二酮类药物，通过激动过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,pparγ)调节糖代谢，但存在患者体重增加、水肿、组织损伤和脂质蓄积等副作用[curr diab rep.2019nov 27；19(12):151.doi:10.1007/s11892-019-1270-y.]。此外，目前还没有治疗nafld以及衰老的药物上市。因此，目前亟需开发新型的安全有效的治疗代谢综合征的药物。
[0004]
沉默信息调节因子1(silent information regulator type 1,sirt1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)依赖的去乙酰化酶，增加sirt1的活性或上调表达可以通过调节腺苷5
’‑
单磷酸激活的蛋白激酶(adenosine5
’‑
monophosphate-activated protein kinase alpha,ampkα)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1alpha，pgc-1α)、肝x受体α(liver x receptorα，lxrα)、atp结合盒转运体a1(atp-binding cassette transporter a1，abca1)等蛋白的活性，从而有效地调节肝脏脂质代谢、胆固醇代谢、炎症、氧化应激、线粒体功能、自噬、衰老等，从而发挥治疗高脂血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、nafld、代谢相关脂肪性肝病、抗as和延缓血管衰老(vascular ageing)、心血管衰老(cardiovascular ageing)等代谢综合征疾病的进程[circ res.2018sep 14；123(7):868-885.doi:10.1161/
circresaha.118.312498.]。因此，开发高效低毒的sirt1小分子激活剂，并利用其来调节脂代谢以及延缓血管衰老等病程是代谢综合征药物研发的重要策略，也是亟待解决的重要问题。
[0005]
基于此，提出本发明。


技术实现要素：

[0006]
本发明首先涉及一组具有如下式(1)所示结构的多取代的喹啉类化合物，
[0007][0008]
其中：
[0009]
r1为h原子，c1-c4的烷基，c1-c4的烷氧基，c1-c3的酰基或者卤素；
[0010]
r2为h原子，c1-c4的烷基，c1-c4的烷氧基，c1-c3的酰基或者卤素；
[0011]
r3为选自如下取代基的含氮杂环：
[0012]
哌啶基或r4取代的哌啶基、含n螺环或r4取代的含n螺环、哌嗪基或r4取代的哌嗪基、氨基哌嗪基或r4取代的氨基哌嗪基；并且，当r1是甲基、r2是氢原子时候，r3不为乙酰基取代的哌嗪；
[0013]
r4为哌啶基，芳基，芳杂基，c1-c6的烷基或环烷基，c1-c3的酰基，酯基。
[0014]
优选的，r3的结构如下所示：
[0015][0016]
最优选的，所述的化合物是如下表所示的化合物
[0017]
[0018]
[0019]
[0020][0021]
本发明还涉及式(1)所示结构的化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下反应式所示，
[0022][0023]
具体包括如下步骤，
[0024]
(1)中间体化合物i-1的制备，
[0025]
1)化合物1溶于乙醇中，加入适量氢氧化钾溶液，搅拌均匀后，等当量加入化合2，回流反应12小时；
[0026]
2)旋干乙醇后，调节体系为酸性后，过滤固体，烘干，制备目标产物i-1。
[0027]
(2)目标产物i-2的制备，
[0028]
1)化合物i-1经缩合试剂与含氮杂环酰胺化，制备目标产物i-2。
[0029]
优选的，步骤(1)的详细步骤为，
[0030]
1)化合物1溶于乙醇中，加入3个当量的33％的氢氧化钾溶液，回流搅拌30分钟，然后等当量加入化合2，继续回流反应12小时；
[0031]
2)旋干乙醇后，加入10％的乙酸水溶液至体系为酸性，过滤固体，烘干，制备目标产物i-1。
[0032]
优选的，步骤(2)的详细步骤为，
[0033]
1)将化合物i-1溶于二氯甲烷中，加入1.2当量的三乙胺，然后加入1.2当量的2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hatu)，搅拌15分钟后，加入含n杂环，室温反应4-6小时；
[0034]
2)水洗，二氯甲烷层浓缩柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)制得目标产物i-2。
[0035]
本发明还涉及包含如通式(1)所示的化合物的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的通式(1)所示的化合物，以及一种或多种药学上可接受的载体。
[0036]
优选的，所述的药物组合物是口服制剂，更优选的，所述的口服制剂是口服片剂、胶囊、颗粒等。
[0037]
本发明还涉及通式(1)所示的化合物，以及化合物c41在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗如下代谢综合征疾病：
[0038]
(1)高脂血症；高胆固醇血症；高甘油三酯血症；和/或
[0039]
(2)动脉粥样硬化；和/或
[0040]
(3)代谢相关脂肪性肝病；和/或
[0041]
(4)非酒精性脂肪肝；和/或
[0042]
(5)衰老。
[0043]
优选的，所述的衰老指由代谢异常导致的内皮细胞衰老而产生的血管衰老(vascular ageing)、心血管衰老(cardiovascular ageing)。
[0044]
所述化合物c41的结构如下式(2)所示，
[0045][0046]
本发明还涉及通式(1)所示的化合物，以及化合物c41的如下应用，
[0047]
(1)制备激活sirt1活性的制剂；
[0048]
(2)制备激活apmkα活性的制剂；
[0049]
(3)制备上调abca1表达的制剂；
[0050]
(4)制备促进巨噬细胞胆固醇流出的制剂；
[0051]
(5)制备抑制肝脏脂质蓄积的制剂。
[0052]
本发明的有益效果在于，
[0053]
全球范围的代谢综合征疾病负担持续上升，对人类健康造成巨大负担。增加sirt1活性在血脂紊乱、as、代谢相关脂肪性肝病、非酒精性脂肪肝、血管衰老等多种代谢类疾病过程中表现出积极作用，已成为备受关注的治疗代谢综合征的潜在治疗靶标。开发新型
sirt1小分子激活剂，通过激活sirt1有效调节血脂异常、脂质代谢、胆固醇代谢、脂肪肝、炎症、氧化应激、线粒体功能、衰老等多种代谢综合征相关功能，进而防治脂代谢紊乱、nafld、代谢相关脂肪性肝病、as和血管衰老等代谢性疾病。
[0054]
本发明中，按照寻找高效低毒、成药性更好、给药方式更便捷的药物/前药分子的思路，设计优化了一系列全新的化合物并对其进行了批量合成，分子、细胞和动物模型的药效学研究结果显示，本发明所涉及的化合物具有进一步开发的潜力。
附图说明
[0055]
图1.多取代的喹啉类化合物激活sirt1的量效关系曲线
[0056]
图2.多取代的喹啉类化合物对巨噬细胞内胆固醇流出的影响
[0057]
图3.化合物c2、c14、c23和c41剂量依赖性促进巨噬细胞内胆固醇流出
[0058]
图4.多取代的喹啉类化合物对ffa诱导aml12细胞脂质蓄积的影响
[0059]
图5.化合物c2、c23剂量依赖性减少aml12细胞脂质蓄积
[0060]
图6.化合物c2、c23和c41对hfd饮食诱导的金黄地鼠血浆中tc和tg的影响
[0061]
图7.化合物c2、c23和c41对肝脏组织病理学的影响
[0062]
图8.化合物c2、c23和c41对肝脏tc和tg含量的影响
[0063]
图9.化合物c2、c23和c41对粪便tc含量的影响
[0064]
图10.c2对hfd饮食诱导的高脂血症金黄地鼠肝脏中sirt1和其他脂质代谢调节蛋白的影响
[0065]
图11.c23对hfd饮食诱导的高脂血症金黄地鼠肝脏中sirt1和其他脂质代谢调节蛋白的影响
[0066]
图12.c41治疗hfhc饮食诱导的nafld小鼠的肝脏h&e染色及nafld活动性评分
[0067]
图13.c41对hfhc饮食诱导的nafld小鼠肝脏纤维化的影响
[0068]
图14.c41对hfhc饮食诱导的nafld小鼠的肝脏脂质蓄积的影响
[0069]
图15.c41对hfhc饮食诱导的nafld小鼠血浆中血脂指标的影响
[0070]
图16.c41对hfhc饮食诱导的nafld小鼠肝脏中sirt1和其他脂质代谢调节蛋白的影响
[0071]
图17.化合物c2、c5、c9、c23和c41对衰老标志物p53转录水平的影响
[0072]
图18.化合物c2、c5、c9和c41对衰老相关分泌表型(sasp)相关炎症因子il1β转录水平的影响
[0073]
图19.化合物c2、c5、c9和c41对lamin b1的蛋白质水平的影响
[0074]
图20.化合物c5、c9和c41对ec衰老细胞sa-β-gal染色的改善作用
具体实施方式
[0075]
实施例1、多取代的喹啉类化合物的合成路线及确认数据
[0076]
典型化合物的合成路线如下反应式所示：
[0077][0078]
具体操作如下：
[0079]
1、中间体化合物i-1的制备
[0080]
(1)化合物1溶于乙醇中，加入3个当量的33％的氢氧化钾溶液，回流搅拌30分钟，然后等当量加入化合2，继续回流反应12小时；
[0081]
(2)旋干乙醇，然后加入10％的乙酸水溶液至体系为酸性，过滤固体，烘干，制备目标产物i-1。
[0082]
2、目标产物i-2的制备路线为，化合物i-1经市售的缩合试剂如hatu等与含氮杂环酰胺化制备化合物i-2，具体而言，
[0083]
(1)将化合物i-1溶于二氯甲烷中，加入1.2当量的三乙胺，然后加入1.2当量的hatu，搅拌15分钟后，加入含n杂环，室温反应4-6小时；
[0084]
(2)后处理，水洗，二氯甲烷层浓缩柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)制得目标产物i-2。
[0085]
按照以上所述路线和方法，替换不同的底物，即能够稳定、可重复的合成本发明所涉及的全部化合物。
[0086]
依照上述反应通式，合成的各个化合物的确认数据如下：
[0087]
1、化合物1-(4-(6-溴-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙烷-1-酮)(化合物c1)，收率41％，exact mass:441.0688；
[0088]1h nmr(600mz,cdcl3):δ7.93(d,j＝9.0hz,1h),7.84
–
7.81(m,1h),7.73(dd,j＝9.0,2.2hz,1h),7.66(d,j＝6.3hz,1h),7.12(d,j＝3.4hz,1h),6.16(d,j＝2.9hz,1h),3.98
–
3.71(m,3h),3.62(t,j＝5.3hz,1h),3.55
–
3.27(m,1h),3.26
–
3.17(m,2h),2.40(s,3h),2.11(s,1.88h),2.01(s,1.41h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ169.22,169.05,166.70,166.49,165.72,155.40,155.36,151.25,149.08,147.06,147.03,141.18,141.01,134.02,131.51,126.47,123.84,120.90,120.87,115.06,115.03,112.75,112.73,109.14,47.08,46.82,46.55,46.00,41.92,41.70,41.17,21.35,21.29,14.04.
[0089]
2、化合物1-(4-(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙烷-1-酮(化合物c2)，收率47％，exact mass:377.1739；
[0090]1h nmr(600mz,cdcl3):δ7.95(d,j＝8.6hz,1h),7.60(d,j＝3.9hz,1h),7.49(d,j＝8.7hz,1h),7.40(d,j＝8.1hz,1h),7.05(d,j＝3.3hz,1h),6.12(d,j＝2.7hz,1h),3.96
–
3.81(m,2h),3.77-3.73(m,1h),3.59(t,j＝5.3hz,1h),3.52
–
3.38(m,1h),3.33
–
3.07(m,3h),2.45(s,3h),2.37(s,3h),2.08(s,1.74h),1.97(s,1.48h).
113
c nmr(150mhz,cdcl3)δ169.22,169.05,166.70,166.49,165.72,155.40,155.36,151.25,149.08,147.06,147.03,141.18,141.01,134.02,131.51,126.47,123.84,120.90,120.87,115.06,115.03,112.75,112.73,109.14,47.08,46.82,46.55,46.00,41.92,41.70,41.17,21.35,21.29,14.04.
[0091]
3、化合物1-(4-(1-(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌啶-4-基)哌嗪-1-基)
乙烷-1-酮(化合物c3)，收率56％，exact mass:446.2318；
[0092]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.13(d,j＝8.4hz,1h),7.87(s,1h),7.84-7.79(m,2h),7.64(t,j＝7.6hz,1h),7.33(d,j＝3.3hz,1h),6.33(dd,j＝3.5,1.1hz,1h),4.53(d,j＝13.0hz,1h),4.02-3.87(m,3h),3.32-3.28(m,1h),3.25-3.23(m,1h),3.12-3.07(m,1h),2.83-2.75(m,2h),2.66-2.52(m,3h),2.49(s,3h),2.44-2.40(m,1h),2.12(s,3h),1.92-1.85(m,2h),1.49-1.34(m,2h),.
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ171.27,168.22,156.68,152.35,150.08,149.14,144.54,132.03,129.78,128.35,125.72,124.01,115.47,114.04,110.08,62.44,50.41,49.85,47.89,46.68,42.96,41.91,29.55,28.91,21.18,13.75.
[0093]
4、化合物(4-苯甲酰基哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c4)，收率52％，exact mass:425.1739；
[0094]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.09(d,j＝8.5hz,1h),7.71-7.67(m,3h),7.47(t,j＝7.5hz,1h),7.35(brs,5h),7.13(s,1h),6.17(s,1h),3.90
–
3.24(m,8h),2.41(s,3h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ170.68,167.27,155.03,151.54,148.89,148.34,142.13,134.91,130.54,130.20,129.95,128.66,127.04,127.01,124.15,122.68,114.28,112.26,108.96,47.13,41.84,14.03.
[0095]
5、化合物n-(4-(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙酰胺(化合物c5)，收率48％，exact mass:392.1848；
[0096]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.00(dd,j＝8.6,2.7hz,1h),7.63(s,1h),7.53(ddd,j＝8.7,4.6,1.9hz,1h),7.45(s,1h),7.10-7.07(m,1h),6.17(s,1h),4.05
–
4.03(m,1h),3.33
–
3.32(m,3h),3.07
–
3.00(m,2h),2.75
–
2.73(m,2h),2.49(d,j＝3.7hz,3h),2.42(s,3h),2.10(s,1.89h),1.87(s,1.32h).
113
c nmr(150mhz,cdcl3)δ174.01,167.92,167.24,154.78,154.74,151.66,151.63,148.06,146.93,146.90,141.55,137.16,137.10,132.80,132.75,129.62,129.57,123.18,123.08,122.74,122.71,114.21,114.19,111.72,108.82,108.79,56.07,55.22,54.76,53.43,46.43,46.39,41.16,41.12,29.68,21.75,21.64,19.80,14.02.
[0097]
6、化合物n-(4-乙酰哌嗪-1-基)-2-(呋喃-2-基)喹啉-4-甲酰胺(化合物c6)，收率59％，exact mass:364.1535；
[0098]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.18-8.14(m,2h),8.03-8.02(m,1h),7.86-7.83(m,2h),7.69-7.65(m,1h),7.47-7.45(m,1h),6.75-6.73(m,1h),3.84-3.78(m,4h),3.10-3.02(m,4h),2.18(s,3h).
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ170.32,166.04,152.60,148.44,147.99,144.88,141.51,130.49,128.48,127.10,124.73,123.40,115.44,112.30,111.08,54.49,54.09,45.40,40.68,19.77.
[0099]
7、化合物1-(4-(2-(呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙烷-1-酮(化合物c7)的合成，收率62％，exact mass:349.1426；
[0100]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.16-8.14(m,1h),7.98(d,j＝4.5hz,1h),7.87-7.82(m,3h),7.68-7.65(m,1h),7.44(t,j＝3.9hz,1h),6.73-6.72(m,1h),4.04-3.93(m,2h),3.85-3.80(m,2h),3.60-3.46(m,2h),3.50-3.27(m,2h),2.21(s,1.5h),2.09(s,1.5h).
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ170.58,167.36,152.67,148.72,147.86,144.89,143.00,130.78,128.71,127.38,124.31,122.85,114.43,112.28,111.13,46.77,46.44,46.07,45.50,
41.60,41.43,41.25,40.77,19.85,19.80.
[0101]
8、化合物n-(4-(2-(呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙酰胺(化合物c8)，收率47％，exact mass:364.1535；
[0102]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.16-8.14(m,1h),7.93(s,1h),7.87-7.82(m,3h),7.68-7.65(m,1h),7.43(dd,j＝3.4,0.8hz,1h),6.72(dd,j＝3.5,1.7hz,1h),4.15-4.12(m,1h),4.02-3.99(m,1h),3.45-3.38(m,2h),3.02-2.99(m,2h),2.77-2.67(m,2h),1.92(s,3h).
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ169.56,167.14,152.65,148.71,147.85,144.89,143.06,130.78,128.71,127.31,124.31,122.85,114.27,112.28,111.10,54.54,54.05,46.51,46.20,40.85,19.54.
[0103]
9、化合物n-(4-(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙酰胺(化合物c9)，收率53％，exact mass:378.1692；
[0104]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.13(d,j＝8.4hz,1h),7.88(s,1h),7.85-7.82(m,1h),7.66-7.63(m,1h),7.32(d,j＝3.3hz,1h),6.33(d,j＝2.2hz,1h),4.16-4.12(m,1h),4.03-3.99(m,1h),3.45-3.39(m,2h),3.04-2.98(m,2h),2.77-2.75(m,1h),2.71-2.67(m,1h),2.49(s,3h),1.92(s,3h).
13
c nmr(150mhz,cd3od)170.93,168.57,156.70,152.39,150.14,149.21,144.29,132.08,129.85,128.38,125.66,123.99,115.48,114.02,110.09,55.91,55.43,47.56,42.19,20.94,13.75.
[0105]
10、化合物(4-(环己基甲基)哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c10)，收率64％，exact mass:417.2416；
[0106]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.10(d,j＝8.5hz,1h),7.73(d,j＝8.3hz,1h),7.70
–
7.65(m,2h),7.50
–
7.44(m,1h),7.12(d,j＝3.1hz,1h),6.17(d,j＝2.9hz,1h),4.06
–
3.93(m,1h),3.86(d,j＝8.9hz,1h),3.23-3.16(m,2h),2.60
–
2.47(m,2h),2.43(s,3h),2.29
–
2.17(m,2h),2.13(d,j＝7.2hz,2h),1.77
–
1.59(m,5h),1.46
–
1.40(m,1h),1.25
–
1.08(m,3h),0.86-0.80(m,2h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ166.91,154.99,151.77,148.95,148.37,143.04,130.39,129.86,126.82,124.63,122.99,114.35,112.14,108.90,65.40,54.13,53.40,47.29,41.91,35.06,31.79,26.80,26.11,14.11.
[0107]
11、化合物1-(4-(1-(2-(呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌啶-4-基)哌嗪-1-基)乙烷-1-酮(化合物c11)，收率67％，exact mass:432.2161；
[0108]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.16(d,j＝8.5hz,1h),7.94(s,1h),7.87-7.82(m,3h),7.68-7.65(m,1h),7.44(t,j＝3.5hz,1h),6.73-6.72(m,1h),4.55(d,j＝13.4hz,1h),4.02-3.94(m,3h),3.35-3.27(m,2h),3.15-3.09(m,1h),2.86-2.84(m,2h),2.68-2.49(m,4h),2.12(s,3h),1.96-1.89(m,2h),1.51-1.38(m,2h).
13
cnmr(150mhz,cd3od)δ169.95,166.89,152.67,148.70,147.85,144.92,143.27,130.77,128.69,127.32,124.40,122.90,114.32,112.30,111.14,61.28,49.11,48.58,46.50,45.35,41.56,40.56,28.21,27.51,19.84.
[0109]
12、化合物n-(4-乙酰哌嗪-1-基)-6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-甲酰胺(化合物c12)，收率58％，exact mass:392.1848；
[0110]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.02-8.01(m,1h),7.90(s,2h),7.68(s,1h),7.29(s,1h),6.33(s,1h),3.92-3.74(m,4h),3.15-2.96(m,4h),2.58(s,3h),2.50(s,3h),2.19(s,3h)
.
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ171.74,167.66,156.43,152.41,149.10,147.90,142.09,138.60,133.92,129.33,124.87,124.55,116.60,113.47,109.98,55.87,55.45,46.78,42.08,21.76,21.08,13.71.
[0111]
13、化合物n-(4-乙酰哌嗪-1-基)-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-甲酰胺(化合物c13)，收率61％，exact mass:378.1692；
[0112]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.13-8.09(m,2h),7.92(s,1h),7.81-7.79(m,1h),7.62-7.60(m,1h),7.32(d,j＝3.3hz,1h),6.32(dd,j＝3.5,1.2hz,1h),3.81(t,j＝5.2hz,2h),3.77(t,j＝5.1hz,2h),3.07(t,j＝5.1hz,2h),3.01(t,j＝5.2hz,2h),2.48(s,3h),2.17(s,3h).
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ171.63,167.42,156.62,152.34,149.82,149.33,142.66,131.75,129.61,128.11,126.06,124.53,116.62,113.96,110.09,55.84,55.43,46.75,42.03,21.15,13.78.
[0113]
14、化合物(4-(环丙烷羰基)哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c14)，收率65％，exact mass:389.1739；
[0114]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.11(dd,j＝9.0,2.9hz,1h),7.75
–
7.59(m,3h),7.48(dt,j＝7.7,3.9hz,1h),7.14(t,j＝3.2hz,1h),6.18(s,1h),4.01
–
3.77(m,4h),3.64
–
3.40(m,2h),3.23(brs,2h),2.77(d,j＝3.0hz,1h),2.45(s,3h),1.76
–
1.49(m,1h),0.97-0.72(m,3h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ172.41,167.33,155.08,151.62,148.96,148.41,142.27,130.57,129.99,127.04,124.23,122.76,114.33,112.27,108.99,46.94,45.34,42.51,41.91,38.64,14.08,11.07,7.77.
[0115]
15、化合物1-(9-(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙烷-1-酮(化合物c15)，收率46％，exact mass:431.2209；
[0116]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.11(d,j＝8.5hz,1h),7.87(s,1h),7.81-7.78(m,2h),7.60(t,j＝7.6hz,1h),7.30(d,j＝3.3hz,1h),6.31(s,1h),3.95-3.88(m,2h),3.62-3.58(m,1h),3.52-3.46(m,2h),3.44-3.40(m,1h),3.25-3.19(m,2h),2.47(s,3h),2.08(s,3h),1.73(t,j＝6.0hz,2h),1.63-1.29(m,6h),.
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ171.38,168.31,156.68,152.44,150.16,149.20,145.03,132.03,129.81,128.28,125.73,124.08,115.22,113.94,110.08,44.36,43.25,38.63,38.37,36.61,35.96,35.70,35.57,31.70,21.20,13.76.
[0117]
16、化合物(4-(4-氟苯基)哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c16)，
[0118]
收率64％，exact mass:415.1696；
[0119]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.19
–
8.08(m,1h),7.79
–
7.74(m,1h),7.74
–
7.68(m,2h),7.50(ddd,j＝8.0,6.6,1.1hz,1h),7.15(d,j＝3.3hz,1h),6.97(t,j＝8.6hz,2h),6.89
–
6.81(m,2h),6.20(dd,j＝3.2,1.2hz,1h),4.18(ddd,j＝13.2,6.4,3.3hz,1h),4.01(ddd,j＝12.1,7.2,3.4hz,1h),3.38(dt,j＝10.7,5.1hz,2h),3.33
–
3.18(m,2h),2.99(dt,j＝10.2,5.0hz,1h),2.91(ddd,j＝11.8,6.9,3.6hz,1h),2.46(s,3h).
13
cnmr(150mhz,cdcl3)δ167.13,157.88(d,j＝240.9hz),155.15,151.75,149.03,148.48,147.53,142.67,130.58,130.03,127.04,124.51,122.96,118.87(d,j＝7.7hz),115.97,115.82,114.45,112.29,109.02,51.29,50.78,47.21,41.90,14.17.
nmr(150mhz,cd3od)δ171.71,166.84,157.03,152.24,150.26,148.15,141.37,135.01,131.62,128.45,125.64,121.79,117.53,114.42,110.25,55.89,55.45,46.81,42.11,21.09,13.77.
[0131]
22、化合物1-(4-(6-氯-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)乙烷-1-酮(化合物c22)，exact mass:397.1193；
[0132]1h nmr(600mz,cd3od):δ8.13-8.11(m,1h),7.90(d,j＝5.1hz,1h),7.83-7.80(m,2h),7.63-7.60(m,1h),7.31(t,j＝4.0hz,1h),6.32(s,1h),4.03-3.91(m,2h),3.83-3.77(m,2h),3.57-3.43(m,2h),3.31-3.23(m,2h),2.48(s,3h),2.19(s,1.49h),2.07(s,1.54h).
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ171.91,171.87,168.84,168.76,156.70,156.67,152.41,150.13,149.22,144.26,144.21,132.06,129.86,128.43,128.40,125.67,125.63,123.99,115.62,114.01,113.99,110.07,48.10,47.79,47.42,46.85,42.93,42.79,42.59,42.13,38.87,21.19,21.14,13.75.
[0133]
23、化合物(4-乙基哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c23)，收率53％，exact mass:349.1790；
[0134]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.06(dd,j＝8.7,1.0hz,1h),7.69(dd,j＝8.3,1.3hz,1h),7.66-7.63(m,2h),7.44(ddd,j＝8.1,6.6,1.1hz,1h),7.09(d,j＝3.4hz,1h),6.13(dd,j＝3.4,1.1hz,1h),4.03
–
3.94(m,1h),3.85
–
3.77(m,1h),3.23
–
3.09(m,2h),2.64
–
2.55(m,1h),2.52(dt,j＝8.2,3.9hz,1h),2.39(s,3h),2.37(q,j＝7.2hz,2h),2.29(ddd,j＝10.3,6.2,3.6hz,1h),2.19(ddd,j＝11.3,6.9,3.6hz,1h),1.01(t,j＝7.2hz,3h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ166.79,154.86,151.64,148.83,148.26,142.83,130.30,129.75,126.75,124.47,122.85,114.22,112.06,108.82,53.13,52.47,52.12,47.09,41.72,13.99,11.87.
[0135]
24、化合物1-(9-(6-溴-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)-3,9-二氮杂螺[5.5]十一烷-3-基)乙烷-1-酮(化合物c24)，收率57％，exact mass:509.1314；
[0136]1h nmr(600mz,cdcl3):δ7.95(d,j＝9.0hz,1h),7.88
–
7.82(m,1h),7.75(dd,j＝9.0,2.2hz,1h),7.66(s,1h),7.13(d,j＝3.3hz,1h),6.19(d,j＝4.0hz,1h),4.02
–
3.74(m,2h),3.56(dt,j＝7.8,3.9hz,2h),3.45
–
3.32(m,2h),3.18(t,j＝5.9hz,2h),2.43(s,3h),2.06(s,3h),1.78
–
1.65(m,2h),1.60
–
1.54(m,2h),1.51(qd,j＝7.3,4.6hz,2h),1.43
–
1.34(m,2h).
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ169.04,166.33,155.44,151.46,149.25,147.08,142.17,133.99,133.91,131.52,126.82,124.13,114.91,112.74,109.14,43.18,42.14,38.70,37.60,37.14,36.23,35.06,30.80,29.78,21.53,14.15.
[0137]
25、化合物(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)(哌啶-1-基)甲酮(化合物c25)，收率67％，exact mass:320.1525；
[0138]1h nmr(600mz,cdcl3):δ8.08(d,j＝8.5hz,1h),7.71(d,j＝8.2hz,1h),7.68
–
7.61(m,2h),7.45(td,j＝7.5,6.7,1.6hz,1h),7.12
–
7.08(m,1h),6.15(t,j＝2.6hz,1h),3.92
–
3.84(m,1h),3.81
–
3.70(m,1h),3.11(td,j＝5.6,2.2hz,2h),2.40(s,3h),1.78
–
1.67(m,2h),1.67
–
1.57(m,2h),1.45
–
1.31(m,2h).
13
cnmr(150mhz,cdcl3)δ
13
c nmr(151mhz,cdcl3)δ166.74,154.81,151.71,148.85,148.26,143.46,130.23,129.69,126.63,124.56,122.96,113.96,111.96,108.78,48.20,42.62,26.60,25.69,24.36,13.99.
[0139]
26、化合物6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)-n-(4-新酰基哌嗪-1-基)喹啉-4-甲酰胺(化合物c26)，
[0140]
收率52％，exact mass:434.2318；
[0141]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.25(s,1h),7.78(d,j＝8.6hz,1h),7.59(s,1h),7.39(d,j＝8.5hz,1h),7.33(s,1h),6.89(s,1h),6.10(s,1h),3.78(brs,4h),3.01(brs,4h),2.37(s,6h),1.24(s,9h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ176.40,165.28,154.76,151.33,147.43,146.54,140.26,136.99,132.48,128.68,123.95,123.00,114.97,111.92,108.90,55.16,44.50,38.67,28.45,28.25,21.78,14.12.
[0142]
27、化合物(4-乙基哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c27)，收率54％，exact mass:363.1947；
[0143]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.03-8.00(m,1h),7.66(d,j＝4.1hz,1h),7.54(d,j＝8.3hz,1h),7.48(s,1h),7.10(s,1h),6.18(s,1h),4.08-3.90(m,2h),3.30-3.13(m,2h),2.70(brs,2h),2.53-2.35(m,10h),1.10(t,j＝7.5hz,3h).
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ167.19,154.78,151.78,148.14,146.94,142.08,137.01,132.71,129.59,123.43,122.91,114.29,111.73,108.82,53.17,52.53,52.27,47.10,41.72,21.79,14.10,11.87.
[0144]
28、化合物6-甲基-n-(4-(3-甲基丁酰基)哌嗪-1-基)-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-甲酰胺(化合物c28)，收率59％，exact mass:434.2318；
[0145]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.06-7.98(m,1h),7.84(dd,j＝8.6,3.9hz,1h),7.68-7.65(m,1h),7.45-7.41(m,2h),6.96(t,j＝3.7hz,1h),6.15(s,1h),3.81(brs,2h),3.67(brs,2h),3.08(brs,2h),3.01(brs,2h),2.41(s,6h),2.19-2.17(m,2h),0.97-0.94(m,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ171.07,165.36,154.86,151.43,147.55,140.28,137.14,132.60,128.87,123.96,123.07,115.00,111.96,108.99,55.40,55.04,45.20,42.02,41.05,30.66,25.88,22.83,21.85,14.18.
[0146]
29、化合物(4-(2-乙基丁基)哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c29)，收率63％，exact mass:405.2416；
[0147]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.08(d,j＝8.5hz,1h),7.71(d,j＝8.2hz,1h),7.68-7.64(m,2h),7.45(t,j＝7.3hz,1h),7.10(d,j＝3.1hz,1h),6.15(d,j＝3.2hz,1h),3.99-3.81(m,2h),3.21-3.13(m,2h),2.57-2.45(m,2h),2.41(s,3h),2.31-2.10(m,4h),1.38-1.20(m,5h),0.79(t,j＝7.5hz,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ166.79,154.86,151.70,148.85,148.29,142.99,130.28,129.77,126.73,124.55,122.90,114.24,112.03,108.82,62.20,54.01,53.38,47.26,41.87,37.54,23.92,14.02,10.73.
[0148]
30、化合物(4-环丙基哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c30)，收率61％，exact mass:375.1947；
[0149]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.00(d,j＝8.6hz,1h),7.64(s,1h),7.52(d,j＝8.8hz,1h),7.49(s,1h),7.09(d,j＝3.0hz,1h),6.17(d,j＝2.3hz,1h),3.95-3.86(m,2h),3.21-3.13(m,2h),2.78-2.76(m,2h),2.51-2.43(m,2h),2.49(s,3h),2.43(s,3h),1.67-1.63(m,1h),0.48-0.42(m,2h),0.41-0.38(m,2h).
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ167.19,154.70,151.81,148.11,146.93,142.18,136.92,132.64,129.55,123.46,122.93,114.27,111.62,108.77,53.67,53.08,47.19,41.79,38.33,21.77,14.07,6.05.
[0150]
31、化合物(4-环丙基哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c31)，收率64％，exact mass:361.1790；
[0151]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.11(d,j＝6.9hz,1h),7.74-7.68(m,3h),7.49(d,j＝6.7hz,1h),7.13(s,1h),6.18(s,1h),3.97(brs,1h),3.82(brs,1h),3.17(brs,2h),2.78(brs,2h),2.52-2.41(m,2h),2.44(s,3h),1.68-1.63(m,1h),0.47-0.39(m,4h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ166.95,154.97,151.73,148.92,148.35,142.96,130.38,129.85,126.82,124.56,122.94,114.29,112.13,108.89,53.66,53.05,47.21,41.84,38.64,14.09,6.04.
[0152]
32、化合物(4-(2-乙基丁基)哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c32)，收率55％，exact mass:419.2573；
[0153]1h nmr(500mz,cdcl3):δ7.98(d,j＝8.5hz,1h),7.62(s,1h),7.49(d,j＝8.9hz,1h),7.48(s,1h),7.06(d,j＝3.1hz,1h),6.14(d,j＝2.4hz,1h),3.97-3.86(m,2h),3.23-3.14(m,2h),2.53(t,j＝5.2hz,2h),2.47(s,3h),2.41(s,3h),2.27-2.18(m,2h),2.15(d,j＝6.9hz,2h),1.38-1.21(m,5h),0.80(t,j＝7.4hz,6h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ167.03,154.60,151.79,148.05,146.89,142.23,136.82,132.56,129.49,123.44,122.91,114.21,111.54,108.72,62.26,54.05,53.44,47.26,41.86,37.56,23.93,21.72,14.01,10.74.
[0154]
33、化合物(4-环己基哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c33)，收率49％，exact mass:417.2416；
[0155]1h nmr(500mz,cdcl3):δ7.99(d,j＝8.6hz,1h),7.62(s,1h),7.52(d,j＝8.7hz,1h),7.48(s,1h),7.07(d,j＝2.9hz,1h),6.17(s,1h),3.99-3.88(m,2h),3.22-3.17(m,2h),2.73(t,j＝5.2hz,2h),2.49(s,3h),2.43(s,3h),2.43-2.41(m,2h),2.32-2.28(m,1h),1.83-1.77(m,4h),1.61(d,j＝12.9hz,1h),1.26-1.04(m,5h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ167.04,154.67,151.75,148.05,146.85,142.18,136.87,132.59,129.50,123.46,122.89,114.26,111.63,108.74,63.60,49.49,48.85,47.65,42.25,28.83,26.22,25.78,21.74,14.04.
[0156]
34、化合物(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c34)，收率58％，exact mass:375.1947；
[0157]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.07(d,j＝8.4hz,1h),7.70(d,j＝8.2hz,1h),7.67-7.64(m,2h),7.45(t,j＝7.4hz,1h),7.10(s,1h),6.15(s,1h),4.07-3.83(m,2h),3.20(brs,2h),2.71-2.59(m,2h),2.40(s,3h),2.39-2.27(m,2h),2.24(d,j＝6.3hz,2h),0.81-0.76(m,1h),0.46(d,j＝7.5hz,2h),0.04(d,j＝4.9hz,2h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ166.84,154.92,151.68,148.86,148.30,142.87,130.33,129.81,126.78,124.51,122.89,114.26,112.10,108.85,63.46,60.35,53.52,52.91,47.12,41.73,14.04,8.23,3.90.
[0158]
35、化合物(4-(环丙基甲基)哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c35)，收率57％，exact mass:389.2103；
[0159]1h nmr(500mz,cdcl3):δ7.97(d,j＝8.3hz,1h),7.61(s,1h),7.49(d,j＝8.5hz,1h),7.46(s,1h),7.05(s,1h),6.14(s,1h),4.01-3.90(m,2h),3.23(brs,2h),2.68(brs,2h),2.46(s,3h),2.41(s,3h),2.44-2.34(m,2h),2.27(d,j＝5.1hz,2h),0.85-0.78(m,1h),0.48(d,j＝6.4hz,2h),0.06(brs,2h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ167.12,154.68,
151.75,148.06,146.88,142.08,136.91,132.62,129.52,123.41,122.89,114.26,111.64,108.76,63.47,60.38,53.49,52.90,47.05,41.66,21.74,14.04,8.15,3.92.
[0160]
36、化合物(4-异丙基哌嗪-1-基)(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c36)，收率59％，exact mass:363.1947；
[0161]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.09(d,j＝8.5hz,1h),7.71(d,j＝8.2hz,1h),7.69-7.65(m,2h),7.47(t,j＝7.5hz,1h),7.11(s,1h),6.16(s,1h),4.00-3.83(m,2h),3.21-3.17(m,2h),2.72-2.60(m,3h),2.42(s,3h),2.40-2.28(m,2h),1.01(s,3h),0.99(s,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ166.85,154.96,151.72,148.90,148.33,142.96,130.35,129.85,126.79,124.56,122.94,114.33,112.13,108.87,54.58,49.18,48.46,47.55,42.14,18.38,14.08.
[0162]
37、化合物(4-异丙基哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c37)，收率52％，exact mass:377.2103；
[0163]1h nmr(500mz,cdcl3):δ7.98(d,j＝8.5hz,1h),7.62(s,1h),7.50(d,j＝8.6hz,1h),7.47(s,1h),7.06(s,1h),6.14(s,1h),3.99-3.86(m,2h),3.23-3.16(m,2h),2.73-2.64(m,3h),2.47(s,3h),2.41(s,3h),2.37-2.30(m,2h),1.01(s,3h),1.00(s,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ167.07,154.68,151.79,148.10,146.89,142.19,136.86,132.59,129.54,123.49,122.92,114.28,111.62,108.75,54.57,49.12,48.46,47.54,42.13,21.73,18.32,14.05.
[0164]
38、化合物(4-(环丙烷羰基)哌嗪-1-基)(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-基)甲酮(化合物c38)，收率59％，exact mass:403.1896；
[0165]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.01(d,j＝8.6hz,1h),7.64(s,1h),7.54(d,j＝8.6hz,1h),7.46(s,1h),7.10(d,j＝2.8hz,1h),6.17(s,1h),4.01-3.78(m,4h),3.61-3.46(m,2h),3.32-3.18(m,2h),2.49(s,3h),2.43(s,3h),1.78-1.56(m,1h),0.98(brs,2h),0.81-0.70(m,2h).
13
c nmr(125mhz,cdcl3)δ172.39,167.44,154.78,151.62,148.06,146.94,137.20,132.82,129.62,123.05,122.74,114.23,111.75,108.84,47.14,41.97,29.70,21.78,14.04,11.03,7.76.
[0166]
39、化合物2-甲基-1-(4-(6-甲基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)丙-1-酮(化合物c39)，收率59％，exact mass:405.2052；
[0167]1h nmr(500mz,cdcl3):δ7.95(d,j＝8.6hz,1h),7.60(s,1h),7.49(d,j＝8.6hz,1h),7.41(s,1h),7.05(s,1h),6.12(s,1h),3.96-3.82(m,2h),3.79-3.59(m,2h),3.49-3.31(m,2h),3.19(brs,2h),2.83-2.70(m,1h),2.44(s,3h),2.39(s,3h),1.09(s,3h),1.02(s,3h).
13
c nmr(126mhz,cdcl3)δ175.67,165.66,154.69,151.58,148.00,146.90,137.12,132.74,129.58,122.98,122.67,114.15,111.67,108.78,60.29,46.85,45.72,41.98,30.10,21.71,19.31,13.97.
[0168]
40、化合物2-甲基-1-(4-(2-(5-甲基呋喃-2-基)喹啉-4-羰基)哌嗪-1-基)丙-1-酮(化合物c40)的合成，收率57％，exact mass:391.1896；
[0169]1h nmr(500mz,cdcl3):δ8.03(d,j＝8.3hz,1h),7.63-7.60(m,3h),7.40(t,j＝6.8hz,1h),7.07(s,1h),6.11(s,1h),3.90(brs,1h),3.81-3.59(m,3h),3.49-3.22(m,2h),3.14(brs,2h),2.77-2.66(m,1h),2.35(s,3h),1.04(s,3h),0.97(s,3h).
13
c nmr(126mhz,
cdcl3)δ175.47,165.56,154.88,151.44,148.75,148.21,130.39,129.79,126.87,124.07,122.57,114.13,112.12,108.83,47.17,47.03,45.61,45.03,41.87,29.99,19.22,13.90.
[0170]
实施例2、多取代的喹啉类化合物在sirt1激活剂筛选模型上的活性评价及量效曲线测定
[0171]
采用实验室前期构建的sirt1激活剂高通量筛选模型进行活性化合物筛选[atherosclerosis.2018jul；274:172-181.doi:10.1016/j.atherosclerosis.2018.04.039.]。将待测活性化合物设置浓度梯度，使用美国perkinelmer公司的sirt1 assay试剂盒，测定其在不同浓度下的激活活性，使用graphpad prism8.3.0软件拟合sirt1激活剂的量效曲线并计算其ec
50
值。
[0172]
具体方法如下：
[0173]
(1)取150mm的二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)贮存液稀释至终浓度为1mm，现用现配。使用新鲜配制的含dtt的酶解缓冲液分别将75mm的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，nad
+
)溶液和1.5μm的乙酰化底物溶液稀释100倍，使nad
+
溶液终浓度为750μm，乙酰化底物溶液终浓度为15nm。使用新鲜配制的含dtt的酶解缓冲液分别将sirt1酶液及化合物稀释至合适浓度。anti-acetyl eu
3+-cryptate用检测缓冲液稀释200倍。
[0174]
(2)根据实验组别设置向384孔板中依次加入以下溶液：
[0175][0176]
(3)室温孵育5h，测定各孔荧光值ex:340nm，em:665/665nm。
[0177]
检测结果计算公式：
[0178]
底物去乙酰化的比率：ratio:(665nm/615nm)
×
104；
[0179]
deacetylation of substrate(％):100-(ratio
sample
/ratio
no enzyme
×
100)。
[0180]
计算各化合物的激活倍数，并将激活活性＞120％的化合物定义为具有sirt1激活潜力的化合物。利用graphpad prism软件作图，得到ec
50
和最大上调率(max)。
[0181]
各化合物的筛选结果见表1，各化合物激活sirt1的量效关系曲线如图1所示，具体的，
[0182]
化合物c2、c5、c9、c14、c15、c18、c22、c23、c38、c40和c41对sirt1的最大激活倍数大于200％。
[0183]
表1多取代的喹啉类化合物在sirt1激活剂筛选模型上的活性
[0184][0185]
实施例3、多取代的喹啉类化合物对巨噬细胞胆固醇流出的影响
[0186]
胆固醇代谢包括内源合成、外源摄取、酯化储存以及外排四个主要部分，胆固醇代谢紊乱会导致患者体内出现大量胆固醇累积，极大程度地增加了代谢性疾病的发病风险。通过促进胆固醇外排来维持胆固醇代谢稳态，是治疗高胆固醇血症、血脂异常、nafld、动脉粥样硬化等糖脂代谢紊乱性疾病及代谢综合征的重要治疗策略。
[0187]
本实施例的实验过程如下：
[0188]
小鼠巨噬细胞(raw264.7 murine macrophage,raw264.7)使用含10％胎牛血清(fetal bovine serum,fbs)的dmem培养基培养。将状态良好的raw264.7细胞以5
×
104个/孔的密度铺于pe ultra 96孔黑色透明底板，待细胞贴壁后，弃去96孔板中细胞培养基，分
别设置空白组、对照组和加药组，向对应孔中加入一定浓度使用测定培养基(dmem培养基含5％ fbs,0.1％ dmso)稀释的药物溶液，于37℃，5％ co2的细胞培养箱中孵育24小时。弃去96孔板中含药细胞培养基，向对应孔中加入使用新鲜含药测定培养基配制的终浓度为5μm的荧光标记胆固醇(22-nbd-cholesterol)溶液孵育6小时。向对应孔中加入载脂蛋白a1(apoa-i，终浓度为10μg/ml)，于37℃孵育6小时。对照组不加待测化合物仅加入22-nbd-cholesterol和apoa-i，溶剂组仅添加培养基。使用pbs轻柔漂洗细胞两次，注意避免细胞脱落。随后各孔分别加入100μl 4％多聚甲醛，固定细胞15min。使用pbs轻柔漂洗细胞两次，随后各孔分别加入100μl dapi染液，染色15min。使用pbs轻柔漂洗细胞两次，随后各孔分别加入100μl蒸馏水，使用高内涵成像系统拍照并分析结果。
[0189]
检测结果如图2、图3所示，具体的，
[0190]
图2显示了sirt1激活剂阳性对照化合物srt2104[mercken e m,mitchell s j,martin-montalvo a,et al.srt2104 extends survival of male mice on a standard diet and preserves bone and muscle mass[j].aging cell,2014,13(5):787-96.]及sirt1最大激活倍数大于200％的10个化合物的胆固醇流出水平。其中，化合物srt2104、c2、c9、c14、c23、c31、c38和c41在10μm条件下均能显著促进胆固醇流出，其中c2、c14、c23和c41的效果优于阳性对照srt2104。
[0191]
图3显示了化合物c2、c14、c23和c41在0.1μm、1μm和10μm浓度下能够呈剂量依赖性促进巨噬细胞内胆固醇流出，这与10μm浓度下化合物胆固醇流出实验筛选实验结果一致，化合物c2、c23和c41效果较好。
[0192]
实施例4、多取代的喹啉类化合物对游离脂肪酸(free fatty acid,ffa)诱导小鼠肝细胞(aml12)脂质蓄积的影响
[0193]
ffa积累诱发肝脏脂肪变性是第一次打击，这是发生nafld的必要因素。给予不同浓度的ffa来诱导肝细胞脂质蓄积是目前公认的研究nafld的体外细胞模型。因此，利用小鼠正常肝细胞aml12构建肝脂肪变性细胞模型，研究c41脂代谢调节的作用及机制。
[0194]
aml12细胞使用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基培养。将aml12细胞以5
×
104个/孔的密度铺于96孔板，于37℃，5％ co2的细胞培养箱中过夜培养。使用含有0.5％(w/v)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,bsa)的dmem培养基配制浓度为500μm的ffa(油酸：棕榈酸＝2:1,v/v)溶液，同时加入10μm的各个多取代的喹啉类化合物作用24h，通过油红o染色评价化合物对ffa诱导的肝细胞脂质蓄积的影响。
[0195]
检测结果如图4、图5，具体的，
[0196]
与ffa诱导组相比，化合物srt2104、c2、c5、c18、c23和c41在10μm处理后的细胞内脂滴明显变小并减少，说明这些化合物均能显著减少aml12细胞中脂质蓄积。
[0197]
与ffa单独诱导组相比，化合物c2、c23在0.01μm、0.1μm和1μm浓度下均能减少细胞内脂质蓄积。
[0198]
实施例5、化合物c2、c23和c41在金黄地鼠高脂血症模型上的体内药效学评价
[0199]
(一)金黄地鼠高脂血症模型的构建
[0200]
7周龄雄性金黄地鼠随机分为9组，对照组金黄地鼠使用金黄地鼠对照饲料喂养，模型组及给药组均使用高脂饮食(17kcal％fat,0.5％cholesterol)喂养4周以构建金黄地鼠高脂血症模型。分别设置对照组(cd)、模型组(hfd)、hfd+srt2104组(100mg/kg)、hfd+c2
(l)组(40mg/kg)、hfd+c2(h)组(100mg/kg)、hfd+c23(l)组(40mg/kg)、hfd+c23(h)组(100mg/kg)、hfd+c41(l)组(40mg/kg)和hfd+c41(h)组(100mg/kg)。在给予4周高脂饮食之后，给药组每天以灌胃方式给予相应剂量的化合物(溶于0.5％cmc-na溶液)，对照组和模型组同样以灌胃方式给予等量0.5％ cmc-na溶液，持续给药21天。
[0201]
实验结束时，禁食过夜。收集粪便，烘干后用于粪便胆固醇含量测定。在对金黄地鼠执行安乐死之前，采用眼底静脉丛取血，收集血液至润载肝素的ep管中，冰上静置1h后，使用吊篮离心机2500rpm离心20min，随后小心地吸取上层血浆并分装至ep管中，冻存于-80℃冰箱。打开胸腔和腹腔并暴露心脏，使用约30ml生理盐水通过心脏对金黄地鼠进行灌流，留肝脏组织，取一部分至冻存管置于液氮中速冻保存，另外一部分肝脏组织在4％多聚甲醛组织固定液中进行固定。
[0202]
(二)血脂水平的测定
[0203]
使用全自动生化分析仪及相应试剂盒，对血浆中丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、总胆固醇(tc)、总甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平进行检测。
[0204]
结果如图6，具体的，
[0205]
(1)高脂饮食饲养的金黄地鼠血浆tc和tg水平均显著高于cd组；
[0206]
(2)阳性对照srt2104组及化合物c2、c23和c41的各高低剂量给药组均能够显著性降低血浆中tc水平，且各化合物降低血浆tc的效果均不弱于阳性对照srt2104组(100mg/kg)；
[0207]
(3)化合物c2在两个剂量下(40mg/kg和100mg/kg)均能够显著性降低血浆中tg水平，其效果优于阳性对照药srt2104。化合物c23在40mg/kg剂量下一定程度降低血浆中tg水平，而在100mg/kg剂量下能够显著性降低血浆中tg水平。
[0208]
(三)肝脏组织病理切片及染色
[0209]
1)金黄地鼠肝脏组织石蜡切片制作
[0210]
取出使用4％多聚甲醛固定好的肝脏组织，切取相同部位适当大小的组织。
[0211]
脱水：在梯度浓度的乙醇溶液中进行肝脏组织的梯度脱水，乙醇浓度梯度为30％、50％、70％、100％，组织分别在各浓度乙醇溶液中脱水30min。
[0212]
透明：将脱水处理后的组织块浸入二甲苯中，透明处理1h。
[0213]
浸蜡：将透明处理后的组织块依次置于以下溶液各30min：25％、50％、75％的石蜡-二甲苯溶液，随后转移至100％液态蜡液中。
[0214]
包埋：向包埋盒中倒入蜡液，将浸蜡处理后的组织块放在中间位置。水平放置于4℃待其凝固即可。
[0215]
切片及贴片：利用切片机将蜡块切出3-5μm的薄片，在45℃左右的温水中展平，使用毛笔将切片贴至载玻片上，置于45℃恒温烘箱中烘干切片。
[0216]
2)金黄地鼠肝脏组织石蜡切片h&e染色
[0217]
脱蜡及入水：将肝脏组织石蜡切片依次置于以下溶液中：二甲苯中20min，无水乙醇中10min，95％乙醇中5min，80％乙醇中5min，70％乙醇中5min，蒸馏水5min。
[0218]
染核：苏木精染液染色10min，用自来水冲洗。分化及返蓝：将切片转移至分化液中2s，放入自来水中5min。
[0219]
染胞浆：伊红染液染色30s。
[0220]
脱水及透明：将染色后的肝脏组织石蜡切片依次置于以下溶液中脱水：70％乙醇中5min，95％乙醇中5min，无水乙醇中10min，二甲苯中20min。
[0221]
封片：随后使用中性树脂封片，置于室温通风处晾干，切片保存备用。
[0222]
3)金黄地鼠肝脏冰冻切片油红染色
[0223]
向冰冻切片包埋模具中挤入oct包埋剂，约一半体积即可，置于干冰中进行预冻。取出已在20％蔗糖溶液中脱水的肝脏组织，切取相同部位的小块组织，放入预冻好的包埋剂中心。继续向包埋模具中添加oct包埋剂使肝脏组织没于其中。低温凝固oct包埋剂，待其完全凝固后，置于-80℃冰箱长期保存。
[0224]
在-20℃条件下，利用恒冷箱切片机进行冰冻切片，切下约6-8μm的薄片。随后将切片展开，平整粘贴在载玻片上，置于-20℃保存。
[0225]
取出-20℃保存的冰冻切片，室温放置30min。将晾干后的冰冻切片置于4％多聚甲醛中，固定10min。随后，将切片在蒸馏水中泡洗三次，每次3min。将切片放入60％异丙醇中浸泡同步化3min。将切片转移至新鲜配制的油红工作液中，染色30min。染色后将切片置于60％异丙醇中分色1-2min，并随时在显微镜下观察。蒸馏水泡洗切片3次，置于苏木素染液中2-3min，复染细胞核。吸干切片周围水滴，封片，阴干后在显微镜下观察并拍照。
[0226]
h&e染色和油红染色结果如图7所示，
[0227]
h&e染色结果显示，cd组金黄地鼠细胞肝脏形态正常，排列整齐。而hfd组细胞有一定程度的膨大，有脂质蓄积的迹象，但未出现明显的气球样变、脂肪空泡和炎症浸润。化合物c2、c23和c41治疗后使金黄地鼠肝脏细胞形态趋于正常。
[0228]
oro染色结果显示，与cd组相比，hfd组oro染色切片呈深红色，表明hfd饮食金黄地鼠肝脏出现大量的脂质蓄积。与hfd组相比，阳性对照化合物srt2104以及化合物c2、c23和c41治疗后使金黄地鼠肝脏oro染色不同程度地变浅，上述结果表明，化合物c2、c23和c41治疗后能够降低肝脏内脂质蓄积的程度。
[0229]
(四)肝脏组织脂质测定
[0230]
称取金黄地鼠肝脏组织50mg/只，放入组织破碎专用管中，每管加入1ml裂解液，利用组织破碎仪进行低温匀浆。组织匀浆后，4℃，12000rpm离心20min。离心后，取适量组织匀浆上清液利用组织tc和tg检测试剂盒对金黄地鼠肝脏组织中的脂质进行测定，使用bca蛋白浓度检测试剂盒测定匀浆液中总蛋白浓度，并对各组样品进行均一化处理，计算肝脏组织中tc和tg的含量。
[0231]
结果如图8，具体的
[0232]
(1)高脂饮食饲养的金黄地鼠肝脏tc水平显著高于cd组；
[0233]
(2)hfd+c2(h)组(100mg/kg)和hfd+c23(h)组(100mg/kg)能够显著性降低肝脏中tc水平；
[0234]
(3)高脂饮食饲养的金黄地鼠肝脏tg水平无明显变化，给药后仍没有明显的影响。
[0235]
上述结果表明，化合物c2和c23给药均可以减少肝脏tc蓄积，改善由高脂饮食诱导的脂代谢紊乱。
[0236]
(五)粪便脂质测定
[0237]
将金黄地鼠进行禁食10h处理后所收集粪便，置于60℃，约8h，烘干。
[0238]
称取100mg烘干的粪便，加入1ml组织裂解液，利用组织破碎仪进行匀浆。
[0239]
匀浆后，4℃，12000rpm离心20min。
[0240]
离心后，取上清使用组织tc测定试剂盒进行粪便tc含量测定。
[0241]
结果如图9，具体的，
[0242]
(1)高脂饮食饲养的金黄地鼠粪便tc水平显著高于cd组，这与高脂饮食中外源性胆固醇摄入密切相关。
[0243]
(2)hfd+c2(l)组(40mg/kg)、hfd+c2(h)组(100mg/kg)、hfd+c23(l)组(40mg/kg)、hfd+c23(h)组(100mg/kg)和hfd+c41(l)组(40mg/kg)粪便tc水平显著高于hfd组，且hfd+c2(l)组(40mg/kg)和hfd+c23(h)组(100mg/kg)在金黄地鼠体内促进胆固醇外排的效果最优。
[0244]
(六)肝脏组织蛋白提取及检测
[0245]
称取金黄地鼠肝脏组织50mg/只，放入组织破碎专用管中，每管加入1ml裂解液，利用组织破碎仪进行低温匀浆。组织匀浆后，4℃，12000rpm离心20min。离心后，取适量组织匀浆上清液使用bca蛋白浓度检测试剂盒测定匀浆液中总蛋白浓度，并调整各样品蛋白至相同浓度。分别加入对应体积的5
×
蛋白上样缓冲液，金属浴100℃加热10min，待其冷却至常温，保存于-20℃。
[0246]
结果如图10、图11，western blot分析显示，
[0247]
(1)与hfd组相比，c2在40mg/kg低剂量下对脂代谢相关蛋白表达水平的影响效果稍弱，但能够显著上调sirt1的蛋白表达，并且显著降低acc的表达，上调p-ampkα的表达(图10)；
[0248]
(2)如与hfd组相比，化合物c2在100mg/kg高剂量下能够显著上调sirt1、磷酸化-腺苷5
’‑
单磷酸激活的蛋白激酶α(phospho-adenosine 5
’‑
monophosphate-activated protein kinase alpha，p-ampkα)和abca1的蛋白表达，并且显著降低乙酰辅酶a羧化酶(acetyl coa carboxylase，acc)的表达(图10)；
[0249]
(3)如与hfd组相比，c23在40mg/kg低剂量下能显著提高p-ampkα蛋白水平，显著降低acc的表达，一定程度上调sirt1和abca1的表达(图11)；
[0250]
(4)与hfd组相比，化合物c23在100mg/kg高剂量下表现出对脂代谢相关蛋白表达水平具有较强的影响，其能显著上调sirt1、p-ampkα和abca1的蛋白表达，并且显著降低acc的表达(图11)。
[0251]
实施例6、化合物c41对高脂高胆固醇饮食(high fat and high cholesterol diet，hfhc)诱导的nafld小鼠的治疗作用
[0252]
(一)hfhc饮食诱导的nafld模型的构建
[0253]
8周龄雄性c57bl/6j小鼠随机分为4组，对照组小鼠使用对照饲料喂养(chow diet,cd)，模型组及给药组均使用高脂高胆固醇饮食(#m10640,biopike,40kcal％fat,20％ fructose,2％cholesterol，high-fat and high-cholesterol diet,hfhc)喂养40周以构建c57bl/6j小鼠nafld模型。分别设置对照组(chow diet，cd)、hfhc组、hfhc+c41组(50mg/kg)、hfhc+oca(obeticholic acid,奥贝胆酸)组(30mg/kg)，给药组每天以灌胃方式给予相应剂量的化合物(溶于0.5％ cmc-na溶液)，对照组和模型组同样以灌胃方式给予等量0.5％ cmc-na溶液，持续给药4周。
[0254]
实验结束时，对小鼠进行禁食过夜。收集粪便，烘干后用于粪便胆固醇含量测定。
在对小鼠执行安乐死之前，采用眼底静脉丛取血，收集血液至润载肝素的ep管中，冰上静置1h后，使用吊篮离心机2500rpm离心20min，随后小心地吸取上层血浆并分装至ep管中，冻存于-80℃冰箱。将其固定至解刨板上，使用约30ml生理盐水通过心脏对小鼠进行灌流。摘取小鼠肝脏组织，称重后，迅速取一部分至冻存管置于液氮中速冻保存，随后长期保存于-80℃冰箱。另外一部分肝脏组织在4％多聚甲醛组织固定液中进行固定，充分固定后可保存于20％无菌蔗糖溶液中。
[0255]
(二)肝脏组织病理切片及染色
[0256]
1)nafld小鼠肝脏组织石蜡切片制作
[0257]
方法同实施例5、(三)肝脏组织病理切片及染色1)金黄地鼠肝脏组织石蜡切片制作。
[0258]
2)nafld小鼠肝脏组织石蜡切片h&e染色
[0259]
方法同实施例5、(三)肝脏组织病理切片及染色2)金黄地鼠肝脏组织石蜡切片h&e染色。
[0260]
结果如图12所示，h&e染色结果显示，
[0261]
(1)普通饮食(cd)组小鼠的肝脏组织结构正常，无脂质沉积、气球样变和炎性浸润等病变(图12a)；
[0262]
(2)hfhc组小鼠的肝脏与cd组相比，出现严重的脂肪变性，可以观察到明显的脂肪空泡和气球样变，并且出现了炎性浸润(图12a)；
[0263]
(3)与hfhc组相比，c41和oca治疗组小鼠的肝脏组织的脂质沉积显著减少，h&e染色结果中脂肪空泡面积明显变小且数量减少(图12a)；
[0264]
(4)cd组、hfhc组、hfhc+c41组和hfhc+oca的nas得分分别约为0.5、5.5、3.0和2.3。hfhc组相比，c41治疗降低了脂肪变性评分和小叶炎症评分，但没有降低气球样变评分，从而显著降低nas评分(图12b)。
[0265]
以上数据表明，hfhc饮食诱导成功构建了nafld小鼠模型达到nash标准，并且c41治疗对hfhc引起的nafld具有显著改善作用。
[0266]
3)nafld小鼠肝脏组织石蜡切片马松三色染色法(masson trichrome staining,masson)
[0267]
将肝脏组织石蜡切片依次置于以下溶液中：二甲苯中20min，无水乙醇中10min，95％乙醇中5min，80％乙醇中5min，70％乙醇中5min，蒸馏水5min。苏木精染液染色10min，用自来水冲洗。masson立春红酸性复红液染色10min，用0.2％冰醋酸洗片。1％磷钼酸分化5min。苯胺蓝染色5min，用0.2％冰醋酸洗片1min。
[0268]
将肝脏组织石蜡切片置于95％乙醇中快速脱水；使用无水乙醇脱水3次，每次1min；使用二甲苯透明3次，每次1min。随后使用中性树脂封片，置于室温通风处晾干，切片保存备用。
[0269]
结果如图13所示，masson染色结果显示，
[0270]
(1)hfhc组小鼠的肝脏与cd组相比，胶原沉积区域明显增多，出现了轻微的纤维化。而与hfhc组相比，c41治疗组小鼠的肝脏胶原纤维沉积明显减少(图13a)。与hfhc组相比，c41治疗组和oca治疗组的肝纤维化分级均有一定程度的降低。
[0271]
(2)通过rt-qpcr进一步检测了肝纤维化过程的重要细胞调节因子肝星状细胞激
活标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-sma)、转化生长因子-β(transforming growth factor beta，tgf-β)和肝脏内胶原合成相关基因ⅰ型胶原蛋白α1(collagen type i alpha 1，col1a1)的mrna水平变化。结果表明，与cd组相比，hfhc组nafld小鼠肝脏内tgfβ和col1a1的mrna水平显著增加(图13d，图13e)，而αsam的mrna水平无明显变化(图13c)。给予c41组与hfhc组相比，肝脏tgfβ和col1a1的mrna水平均显著下降(图13d，图13e)，αsam的mrna水平有一定程度的降低(p＝0.13)。因此，化合物c41能够通过调控小鼠肝脏中纤维化进程相关基因mrna水平而抑制肝纤维化。
[0272]
4)nafld小鼠肝脏冰冻切片脂质分析
[0273]
方法同实施例5、(三)肝脏组织病理切片及染色3)金黄地鼠肝脏冰冻切片脂质分析。
[0274]
结果如图14a、14b所示，oro染色结果显示，
[0275]
hfhc组小鼠的肝脏与cd组相比出现严重的脂质沉积。而与hfhc组相比，c41治疗组小鼠的肝脏组织中脂滴显著减少，说明其可以减少肝脏中脂质含量。
[0276]
(三)肝脏组织脂质测定
[0277]
1)称取小鼠肝脏组织50mg/只，研磨并加入3ml甲醇和氯仿的混合液(甲醇：氯仿＝1:2，v/v)，转移至4ml ep管中，震荡过夜。
[0278]
2)静置30min，取2ml上清液至新的ep管中，6000rpm，离心2min。
[0279]
3)取1.5ml上清液，将溶剂旋干，加入400μl的10％ triton-x-100复溶。
[0280]
4)取适量提取液利用组织tc和tg检测试剂盒对小鼠肝脏组织中的脂质进行测定，根据称取的肝重对各组样品进行均一化处理，计算肝脏组织中tc和tg的含量。
[0281]
结果如图14c所示，
[0282]
与cd组相比，hfhc组小鼠的肝脏tc和tg含量都显著增加，表明hfhc饮食能够增加小鼠肝脏脂质含量。
[0283]
而与hfhc组相比，c41治疗后显著减少了肝脏中的tc和tg含量。
[0284]
以上结果说明，c41能够抑制hfhc饮食诱导的小鼠肝脏脂质蓄积。
[0285]
(四)血脂水平的测定
[0286]
使用全自动生化分析仪及相应试剂盒，对小鼠血浆中丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast)、总胆固醇(tc)、总甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)水平进行检测。
[0287]
结果如图15所示，
[0288]
与cd组相比，40周hfhc饮食饲养的nafld模型小鼠血浆中tc、ldl-c和hdl-c的水平显著增加，并一定程度上升高血浆中的tg水平。
[0289]
与hfhc组相比，c41治疗可显著性降低小鼠血浆中tc、tg和ldl-c的水平，并显著增加血浆中hdl-c的水平。
[0290]
这些结果表明，c41治疗改善了hfhc饮食诱导的nafld小鼠的血脂异常。
[0291]
(五)肝脏组织蛋白提取及检测
[0292]
1)称取小鼠肝脏组织50mg/只，放入组织破碎专用管中，每管加入1ml裂解液，利用组织破碎仪进行低温匀浆。
[0293]
2)组织匀浆后，4℃，12000rpm离心20min。
[0294]
3)离心后，取适量组织匀浆上清液使用bca蛋白浓度检测试剂盒测定匀浆液中总蛋白浓度，并调整各样品蛋白至相同浓度。分别加入对应体积的5
×
蛋白上样缓冲液，金属浴100℃加热10min，待其冷却至常温，保存于-20℃。
[0295]
结果如图16所示，western blot分析显示，
[0296]
与cd组相比，hfhc饮食诱导明显降低了sirt1、p-ampkα/ampkα比率和pcg-1α的蛋白表达(图16a，图16b)，同时显著提高了包括固醇调节元件结合蛋白1c(sterol regulatory element binding protein-1c,srebp-1c)、acc和硬脂酰-coa去饱和酶1(scd-1)在内的脂蛋白的表达水平(图16c，图16d)。
[0297]
c41治疗显著增加了sirt1、pcg-1α和p-ampkα/ampkα比率的蛋白表达水平(图16a，图16b)，与此同时与hfhc组相比，c41治疗明显降低了srebp-1c、acc和scd-1的表达水平(图16c，图16d)。
[0298]
实施例7、化合物降低内皮细胞(endothelial cell，ec)衰老细胞衰老相关标志物的作用
[0299]
心血管疾病(cardiovascular disease,cvd)是老年人以及代谢紊乱患者的主要死因，而血管衰老是cvd发生的一个主要危险因素。内皮细胞(endothelial cell，ec)作为血液和血管组织的第一道屏障，在血管衰老进程起到关键作用。长期不良刺激，如血液中高活性氧成分、高葡萄糖和脂质等营养物质水平、尿酸等代谢产物等暴露，通过氧化应激、dna损伤、线粒体功能障碍，以及慢性炎症等不同程度的应激反应，使ec呈现出形态扁平扩大，细胞核结构变化，溶酶体衰老相关半乳糖苷酶(senescence associated-β-galactosidase，sa-β-gal)活性增加，细胞周期阻滞，dna和蛋白质等大分子损伤，衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，sasp)和代谢紊乱等相互依赖的衰老特征，严重损害细胞功能，并诱导血管组织细胞生长停滞和血管稳态失调。衰老的ec，细胞周期相关因子p53(tumor protein 53，肿瘤蛋白53)和p21(cyclin-dependent kinase inhibitor 1a，周期蛋白依赖激酶抑制剂1a)水平升高，细胞核标志物核纤层蛋白b1(lamin b1)水平降低，sa-β-gal染色阳性细胞比例增加，以及sasp相关炎症因子水平升高，这是衰老细胞典型特征。根据衰老细胞上述特征和国际细胞衰老学会推荐，通过检测p53、p21和lamin b1水平，sa-β-gal染色，以及sasp中炎症因子表达水平能够综合评价ec细胞衰老效果。
[0300]
(一)人脐静脉内皮细胞(huvecs)衰老细胞模型的构建及化合物作用方式：
[0301]
huvecs细胞于6孔细胞培养板中，使用培养基在37℃、5％ co2条件的培养箱中培养24h使细胞贴壁。使用新培养基配置200nm浓度的多柔比星(doxorubicin,dox)溶液培养细胞24h为ec衰老细胞模型组；新培养基配置200nm浓度dox溶液，加入终浓度为10μm的化合物c2、c5、c9、c23和c41培养细胞24h为实验组；以含有等体积dmso培养基培养的细胞作为对照组。对作用后的模型细胞提取总rna，并逆转录为cdna。
[0302]
(二)通过rt-qpcr方法检测衰老标志物p53转录水平：
[0303]
对作用后的模型细胞提取总rna：细胞弃去培养基，使用pbs清洗一次，6孔板每孔加入1ml trizol裂解液，于冰上裂解细胞，裂解液于10000rpm，4℃条件下离心10min，取上清移入新的离心管中，按样品：氯＝1：1比例加入氯仿萃取rna粗品，样品：异丙醇＝2：1比例加入异丙醇沉淀rna粗品，70％乙醇(采用无rna酶水配置)清洗两次提取出总rna。试剂盒将
rna逆转录为cdna。
[0304]
通过rt-qpcr方法检测衰老标志物p53转录水平变化，结果如图17所示，c2、c5、c23和c41呈现明显降低p53转录水平的趋势。
[0305]
(三)通过rt-qpcr方法检测sasp相关炎症因子il1β转录水平：
[0306]
对作用后的模型细胞提取总rna，并逆转录为cdna。通过rt-qpcr检测c2、c5、c9和c41作用后sasp相关炎症因子il1β转录水平变化，结果如图18所示，c2、c5、c9和c41能够明显降低il1β的转录水平。
[0307]
(四)通过western blot方法检测衰老标志物lamin b1蛋白质水平
[0308]
对作用后的模型细胞提取总蛋白质。通过western blot检测c2、c5、c9和c41作用后衰老标志物lamin b1蛋白质水平变化，结果如图19所示，c2、c5、c9和c41能够明显升高lamin b1的蛋白质水平。
[0309]
实施例8、化合物对ec衰老细胞sa-β-gal染色的改善作用
[0310]
huvecs细胞于12孔细胞培养板中，使用培养基在37℃、5％ co2条件的培养箱中培养24h使细胞贴壁。使用新培养基配置200nm浓度的dox溶液培养细胞24h为ec衰老细胞模型组；新培养基配置200nm浓度dox溶液，加入终浓度为10μm的化合物c5、c9、c41培养细胞24h为实验组。
[0311]
对作用后的模型细胞使用sa-β-gal活性检测试剂盒检测衰老经典指标——sa-β-gal染色情况：细胞弃去培养基，使用pbs清洗一次，使用sa-β-gal染色试剂盒试剂进行固定和染色，并统计染色阳性细胞比例，结果如图20所示，
[0312]
dox诱导下染色阳性细胞比例呈剂量依赖性上升趋势，且与dmso组相比200nm dox诱导下sa-β-gal染色阳性细胞比例显著升高，10μm浓度的c5、c9和c41作用下，均能明显降低衰老细胞sa-β-gal染色情况，sa-β-gal染色阳性比例显著降低。
[0313]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。

技术特征：
1.一组具有如下式(1)所示结构的多取代的喹啉类化合物，其中：r1为h原子,c1-c4的烷基，c1-c4的烷氧基，c1-c3的酰基或者卤素；r2为h原子,c1-c4的烷基，c1-c4的烷氧基，c1-c3的酰基或者卤素；r3为选自如下取代基的含氮杂环：哌啶基或者r4取代的哌啶基，或者r4取代的含n螺环；或者r4取代的哌嗪基；或者r4取代的氨基哌嗪基；并且，当r1是甲基、r2是氢原子时候，r3不为乙酰基取代的哌嗪；r4为哌啶基，芳基，芳杂基，c1-c6的烷基或环烷基，c1-c3的酰基，酯基。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，r3的结构为如下任一的结构式：3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的化合物是如下表所示的化合物c1-c40。
4.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下反应式所示，具体包括如下步骤，(1)中间体化合物i-1的制备，1)化合物1溶于乙醇中，加入适量氢氧化钾溶液，搅拌均匀后，等当量加入化合2，回流反应12小时；2)旋干乙醇后，调节体系为酸性后，过滤固体，烘干，制备目标产物i-1；(2)目标产物i-2的制备，1)化合物i-1经缩合试剂与含氮杂环酰胺化，制备目标产物i-2。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)的步骤为，1)化合物1溶于乙醇中，加入3个当量的33％的氢氧化钾溶液，回流搅拌30分钟，然后等
当量加入化合2，继续回流反应12小时；2)旋干乙醇后，加入10％的乙酸水溶液至体系为酸性，过滤固体，烘干。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)的步骤为，1)将化合物i-1溶于二氯甲烷中，加入1.2当量的三乙胺，然后加入1.2当量的hatu，搅拌15分钟后，加入含n杂环，室温反应4-6小时；2)水洗，二氯甲烷层浓缩柱层析(乙酸乙酯/石油醚＝1/1)制得目标产物i-2。7.包含权利要求1所述的化合物的药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的通式(1)所示的化合物，以及一种或多种药学上可接受的载体；优选的，所述的药物组合物是口服制剂，更优选的，所述的口服制剂是口服片剂、胶囊、颗粒等。8.权利要求1所述的通式(1)所示的化合物，以及化合物c41在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗如下代谢综合征疾病：(1)高脂血症；高胆固醇血症；高甘油三酯血症；和/或(2)动脉粥样硬化；和/或(3)代谢相关脂肪性肝病；和/或(4)非酒精性脂肪肝；和/或(5)衰老；优选的，所述的衰老指由代谢异常导致的内皮细胞衰老而产生的血管衰老(vascular ageing)、心血管衰老(cardiovascular ageing)；所述化合物c41的结构如下式(2)所示，9.权利要求1所述的通式(1)所示的化合物，以及化合物c41的如下应用，(4)制备激活sirt1活性的制剂；(5)制备激活apmk活性的制剂；(6)制备上调abca1表达的制剂；(4)制备促进巨噬细胞胆固醇流出的制剂；(5)制备抑制肝脏脂质聚积的制剂。

技术总结
本发明涉及一组多取代的喹啉类化合物及其用途，具体的所述的化合物如式(1)所示，所述的化合物用于治疗如下代谢综合征疾病：(1)高脂血症；高胆固醇血症；高甘油三酯血症；(2)动脉粥样硬化；(3)代谢相关脂肪性肝病；(4)非酒精性脂肪肝；(5)衰老。(5)衰老。(5)衰老。


技术研发人员：司书毅 许艳妮 韩江雪 刘超 李顺旺 盛任 王伟志 姜新海 李依宁 雷丽娟 张语嫣 李妍 陈明华 张晶 巫晔翔 王晨吟
受保护的技术使用者：中国医学科学院医药生物技术研究所
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/31