一种还原响应型载药纳米粒及其制备方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种还原响应型载药纳米粒及其制备方法。


背景技术：

2.胆固醇是一种内源性疏水性小分子化合物，生物相容性良好。随着生物材料和纳米药物制剂的发展，研究人员基于胆固醇制备出偶联物后，自组装形成纳米颗粒，这些纳米颗粒显示出良好的稳定性、特异性以及肿瘤组织靶向性等优点，在抗肿瘤药物递送中具有潜在应用价值。
3.目前已报道的纳米粒存在药物释放不可控的缺陷，且分子结构及分子量对纳米粒自组装行为、药物释放和细胞摄取的影响并不清楚，如何制备出具有可控药物释放和高肿瘤细胞摄取量的纳米粒这一技术问题仍有待解决。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供了一种还原响应型载药纳米粒，由甲氧基聚乙二醇-胆固醇在水溶液中自组装形成，甲氧基聚乙二醇-胆固醇的结构通式为
[0005][0006]
本发明还提供了一种上述还原响应型载药纳米粒的制备方法：
[0007]
(1)将3，3
’‑
二硫代二丙酸、胆固醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为2～4：1：2～8：0.5～2溶于二氯甲烷，加热回流过夜，然后旋干，加入少量乙酸乙酯溶解，加入至乙醇中沉淀，过滤，滤饼用乙醇洗涤后，真空干燥得3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯；
[0008]
(2)将步骤(1)中得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯、甲氧基聚乙二醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为1：1：2～8：0.5～2溶于二氯甲烷，加热回流24小时，然后旋干，加入超纯水分散，于超纯水中透析3天，离心分离后，取上清冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒。
[0009]
作为优选：步骤(1)中，3，3
’‑
二硫代二丙酸、胆固醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为2：1：4：1溶于二氯甲烷。
[0010]
作为优选：步骤(1)中，作为沉淀溶剂的乙醇的体积是乙酸乙酯的10～20倍。
[0011]
作为优选：步骤(2)中，3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯、甲氧基聚乙二醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为1：1：4：1溶于二氯甲烷。
[0012]
作为优选：步骤(2)中，甲氧基聚乙二醇分子量为2000～10000。
[0013]
进一步地：步骤(2)中，甲氧基聚乙二醇分子量为2000。
[0014]
作为优选：步骤(2)中，离心分离为按8000转/分钟离心10分钟。
[0015]
本发明提供的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒具有较好的载药能力、还原响应释放药物能力、靶向能力，并且作为缓释性靶向抗癌药物载药体，具有十分理想的前景。
附图说明
[0016]
图1为本发明实施例1制备的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯，以及实施例4和实施例5制备的甲氧基聚乙二醇-胆固醇的核磁共振氢谱图。
[0017]
图2为本发明实施例4和实施例5制备的甲氧基聚乙二醇-胆固醇的红外光谱图。
具体实施方式
[0018]
一种还原响应型载药纳米粒，由甲氧基聚乙二醇-胆固醇在水溶液中自组装形成，甲氧基聚乙二醇-胆固醇的结构通式为
[0019][0020]
上述还原响应型载药纳米粒的制备方法为：
[0021]
(1)3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的制备
[0022]
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的制备反应式如下：
[0023][0024]
将3，3
’‑
二硫代二丙酸、胆固醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edcl)和4-二甲氨基吡啶(dmap)，按照摩尔比为2～4：1：2～8：0.5～2溶于二氯甲烷，加热回流过夜，然后旋干，加入少量乙酸乙酯溶解，加入至乙醇中沉淀，过滤，滤饼用乙醇洗涤后，真空干燥得3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯，
[0025]
其中，作为沉淀溶剂的乙醇的体积是乙酸乙酯的10～20倍；
[0026]
(2)甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒的制备
[0027]
甲氧基聚乙二醇-胆固醇的制备反应式如下：
[0028][0029]
将步骤(1)中得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯、甲氧基聚乙二醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为1：1：2～8：0.5～2溶
于二氯甲烷，加热回流24小时，然后旋干，加入超纯水分散，于超纯水中透析3天，离心分离后，取上清冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒，
[0030]
由于甲氧基聚乙二醇-胆固醇在水中自主装成纳米粒胶体后，稳定性好，经过离心后依然稳定存在于上清液中，因此对上清液进行冻干后，得到的便是自组装成的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒，后续可顺利实现载药、释药。
[0031]
其中，甲氧基聚乙二醇分子量为2000～10000，离心分离为按8000转/分钟离心10分钟。
[0032]
具体个例如下：
[0033]
实施例1
[0034]
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的制备
[0035]
将3，3
’‑
二硫代二丙酸(2mmol，420mg)、胆固醇(1mmol，387mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4mmol，767mg)和4-二甲氨基吡啶(1mmol，122mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流12小时，然后将二氯甲烷旋干，加入2ml乙酸乙酯溶解固体，并加入至30ml乙醇中沉淀，搅拌，过滤，滤饼用乙醇洗涤后，真空干燥得暗黄色固体，产率86％(产率＝产物质量
÷
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的分子量
÷
原料中胆固醇摩尔数
×
100％，下同)。
[0036]
通过高效液相色谱测定实施例1所合成3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的纯度为97％。通过核磁共振氢谱进行结构表征，结果显示除了胆固醇的特征峰外，3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的核磁共振氢谱在2.93和2.70处出现了3，3
’‑
二硫代二丙酸中的亚甲基峰，见图1，表明3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的成功合成。
[0037]
实施例2
[0038]
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的制备
[0039]
将3，3
’‑
二硫代二丙酸(4mmol，840mg)、胆固醇(1mmol，387mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(8mmol，1.534g)和4-二甲氨基吡啶(2mmol，244mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流12小时，然后将二氯甲烷旋干，加入2ml乙酸乙酯溶解固体，并加入至40ml乙醇中沉淀，搅拌，过滤，滤饼用乙醇洗涤后，真空干燥得暗黄色固体，产率88％。
[0040]
实施例3
[0041]
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯的制备
[0042]
将3，3
’‑
二硫代二丙酸(2mmol，420mg)、胆固醇(1mmol，387mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2mmol，384mg)和4-二甲氨基吡啶(0.5mmol，61mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流12小时，然后将二氯甲烷旋干，加入2ml乙酸乙酯溶解固体，并加入至20ml乙醇中沉淀，搅拌，过滤，滤饼用乙醇洗涤后，真空干燥得暗黄色固体，产率59％。
[0043]
实施例2相比于实施例1，在3，3
’‑
二硫代二丙酸相对于胆固醇的用量上增加了一倍，并且1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶的用量也有成倍的增加，但产率上涨十分有限，可见实施例1反应物中“3，3
’‑
二硫代二丙酸摩尔数为胆固醇的2倍”已达到足够过量；
[0044]
实施例3相比于实施例1，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲
氨基吡啶的用量明显减少，导致产率下降。
[0045]
实施例4
[0046]
甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒的制备
[0047]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.2mmol，116mg)、甲氧基聚乙二醇(分子量2000，0.2mmol，400mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.8mmol，153mg)和4-二甲氨基吡啶(0.2mmol，24mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时，然后将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率83％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇的分子量
÷
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯摩尔数
×
100％)。
[0048]
通过高效液相色谱测定实施例4所合成甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇的纯度为92％。通过核磁共振氢谱和红外光谱进行结构表征，核磁共振氢谱结果显示，与3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯相比，甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇的核磁共振氢谱中新出现了聚乙二醇的峰，表明甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇的成功合成，见图1；红外光谱结果显示，甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇的红外光谱中出现了酯键中的c＝o伸缩振动峰(1730cm-1
)，见图2。表明3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯与甲氧基聚乙二醇2000通过酯键成功偶联。
[0049]
实施例5
[0050]
甲氧基聚乙二醇5000-胆固醇纳米粒的制备
[0051]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.2mmol，116mg)、甲氧基聚乙二醇(分子量5000，0.2mmol，1g)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.8mmol，153mg)和4-二甲氨基吡啶(0.2mmol，24mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时，然后将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率76％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇5000-胆固醇的分子量
÷
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯摩尔数
×
100％)。
[0052]
实施例6
[0053]
甲氧基聚乙二醇10000-胆固醇纳米粒的制备
[0054]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.2mmol，116mg)、甲氧基聚乙二醇(分子量10000，0.2mmol，2g)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.4mmol，76mg)和4-二甲氨基吡啶(0.1mmol，12mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时，然后将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率43％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇10000-胆固醇的分子量
÷
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯摩尔数
×
100％)。
[0055]
实施例7
[0056]
甲氧基聚乙二醇1000-胆固醇纳米粒的制备
[0057]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.2mmol，116mg)、甲氧基聚乙二醇(分子量1000，0.2mmol，200mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.8mmol，153mg)和4-二甲氨基吡啶(0.2mmol，24mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时，然后将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率87％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇1000-胆固醇的分子量
÷
3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯摩尔数
×
100％)。
boc-d-赖氨酸摩尔数
×
100％)。
[0073]
实施例12
[0074]
甲氧基聚乙二醇5000-赖氨酸的制备
[0075]
将n2,n6-双-boc-d-赖氨酸(0.2mmol，69mg)、甲氧基聚乙二醇(分子量5000，0.2mmol，1g)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.8mmol，153mg)和4-二甲氨基吡啶(0.2mmol，24mg)加入至20ml二氯甲烷中，加热搅拌回流24小时，反应完成后冷却至室温，加入2ml三氟乙酸搅拌4小时脱boc保护，然后将反应液浓缩至约2ml，加入至20ml乙醚中沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤，真空干燥得到甲氧基聚乙二醇与赖氨酸形成的酯，产率56％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇5000与赖氨酸形成的酯的分子量
÷
n2,n6-双-boc-d-赖氨酸摩尔数
×
100％)。
[0076]
实施例13
[0077]
甲氧基聚乙二醇10000-赖氨酸的制备
[0078]
将n2,n6-双-boc-d-赖氨酸(0.2mmol，69mg)、甲氧基聚乙二醇(分子量10000，0.2mmol，2g)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.8mmol，153mg)和4-二甲氨基吡啶(0.2mmol，24mg)加入至20ml二氯甲烷中，加热搅拌回流24小时，反应完成后冷却至室温，加入2ml三氟乙酸搅拌4小时脱boc保护，然后将反应液浓缩至约2ml，加入至20ml乙醚中沉淀，过滤，滤饼用乙醚洗涤，真空干燥得到甲氧基聚乙二醇与赖氨酸形成的酯，产率48％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇10000与赖氨酸形成的酯的分子量
÷
n2,n6-双-boc-d-赖氨酸摩尔数
×
100％)。
[0079]
实施例14
[0080]
甲氧基聚乙二醇2000-赖氨酸-双胆固醇纳米粒的制备
[0081]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.3mmol，116mg)、实施例11制备的甲氧基聚乙二醇2000-赖氨酸(分子量2128，0.1mmol，213mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，230mg)和4-二甲氨基吡啶(0.3mmol，37mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时后，将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率83％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇2000-赖氨酸-双胆固醇分子量
÷
甲氧基聚乙二醇2000-赖氨酸摩尔数
×
100％)。
[0082]
实施例15
[0083]
甲氧基聚乙二醇5000-赖氨酸-双胆固醇纳米粒的制备
[0084]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.3mmol，116mg)、实施例12制备的甲氧基聚乙二醇5000-赖氨酸(分子量5128，0.1mmol，513mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，230mg)和4-二甲氨基吡啶(0.3mmol，37mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时后，将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率81％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇5000-赖氨酸-双胆固醇分子量
÷
甲氧基聚乙二醇5000-赖氨酸摩尔数
×
100％)。
[0085]
实施例16
[0086]
甲氧基聚乙二醇10000-赖氨酸-双胆固醇纳米粒的制备
[0087]
将实施例2得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.3mmol，116mg)、实施例13制备的甲氧基聚乙二醇10000-赖氨酸(分子量10128，0.1mmol，1013mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.2mmol，230mg)和4-二甲氨基吡啶(0.3mmol，37mg)加入至20ml二氯甲烷中搅拌溶解，加热搅拌回流24小时后，将二氯甲烷旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得微黄色固体，产率57％(产率＝产物质量
÷
甲氧基聚乙二醇10000-赖氨酸-双胆固醇分子量
÷
甲氧基聚乙二醇10000-赖氨酸摩尔数
×
100％)。
[0088]
实验1
[0089]
载尼罗红纳米粒的制备
[0090]
将实施例4～7、实施例8～10、实施例14～16制备的改性胆固醇纳米粒各90mg，分别和10mg尼罗红加入至3ml二甲基亚砜中，室温(25℃，下同)搅拌12小时，然后将二甲基亚砜旋干，加入30ml超纯水，超声分散，于超纯水中透析3天，8000转/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥得到载尼罗红纳米粒，通过紫外可见分光光度法测定该载尼罗红纳米粒的载药量(装载的药物质量与(药物+载体)质量的百分比)和包封率(装载的药物与投入总药物的百分比)。
[0091]
表1负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒的载药量和包封率
[0092][0093][0094]
如表1所示，实施例4～7、实施例14～16中，随着甲氧基乙二醇分子量的增加(2000～10000)，所制备的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒负载尼罗红的载药量和包封率不断降低，主要是由于随着甲氧基乙二醇分子量的增加，甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒中胆固醇所占比例降低，不利于疏水性药物与胆固醇通过疏水相互作用负载，其中，甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒的载药量和包封率最高，分别为9.2％和91％，甲氧基聚乙二醇1000-胆固醇纳米粒由于亲水性不足，在载药试验过程中形成沉淀。以上结果表明，相比之下，甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒对疏水性药物具有最好的载药能力。
[0095]
实验2
[0096]
纳米粒粒径和电位测定
[0097]
试验分散液配制：取实验1中基于实施例4～7制备的载尼罗红纳米粒冻干粉，分别加入至超纯水中，超声分散5分钟，配置得到4mg/ml的分散液。
[0098]
粒径和电位测定：分别取上述配置的分散液1ml，通过激光粒度及zeta电位分析仪测定粒径和电位。
[0099]
表2负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒的粒径和电位
[0100][0101]
如表2所示，随着甲氧基乙二醇分子量的增加(2000～10000)，所制备的负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒的粒径不断增加，电位不断降低，主要由于聚乙二醇链长的增加使纳米粒亲水外壳的厚度增加，电荷屏蔽作用增强；所有纳米粒的电位均为负，有利于血液长循环；所有纳米粒的多分散性指数均低于0.3，表明所有纳米粒均具有较好的粒径分布。
[0102]
实验3
[0103]
体外药物释放实验
[0104]
ph7.4释放液配置：称取0.2g磷酸二氢钾，2.16g十二水合磷酸氢二钠，5g吐温-80，加入超纯水溶解，定容至1l，然后用氢氧化钠溶液调节ph至7.4。
[0105]
含10mm还原型谷胱甘肽ph7.4释放液配置：称取0.2g磷酸二氢钾，2.16g十二水合磷酸氢二钠，5g吐温-80，还原型谷胱甘肽3.07g，加入超纯水溶解，定容至1l，然后用氢氧化钠溶液调节ph至7.4。
[0106]
体外药物释放测定
[0107]
取实验1中基于实施例4～7、实施例8～10、实施例14～16制备的载尼罗红纳米粒冻干粉，分别加入至超纯水中，超声分散5分钟，配置得到4mg/ml的载尼罗红纳米粒溶液，取各载尼罗红纳米粒溶液2ml，分别装入透析袋中(分子量截留：3500)，密封，然后浸没在40ml上述配置的释放液中，置于摇床中震荡，温度为37℃，转速为150转/分钟。分别在2、4、6、16、24、40、48小时时间节点，于透析袋外部的释放液中取出2ml，再补充2ml相应的空白释放液，取出的释放液通过荧光光度法计算尼罗红累积释放量(尼罗红累积释放量＝释放液中尼罗红的质量
÷
原透析袋中2ml的载尼罗红纳米粒溶液中尼罗红质量
×
100％，下同)。释放实验全程在避光的条件下进行，每种样品的释放实验平行做三组。
[0108]
表3负载有尼罗红的甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒(实施例4)的药物释放
[0109][0110]
表4负载有尼罗红的甲氧基聚乙二醇5000-胆固醇纳米粒(实施例5)的药物释放
[0111][0112][0113]
表5负载有尼罗红的甲氧基聚乙二醇10000-胆固醇纳米粒(实施例6)的药物释放
[0114][0115]
表6负载有尼罗红的羟乙基淀粉70000-胆固醇纳米粒(实施例8)的药物释放
[0116][0117]
表7负载有尼罗红的羟乙基淀粉130000-胆固醇纳米粒(实施例9)的药物释放
[0118][0119]
表8负载有尼罗红的羟乙基淀粉200000-胆固醇纳米粒(实施例10)的药物释放
[0120][0121]
表9负载有尼罗红的甲氧基聚乙二醇2000-赖氨酸-双胆固醇纳米粒(实施例14)的药物释放
[0122]
[0123][0124]
表10负载有尼罗红的甲氧基聚乙二醇5000-赖氨酸-双胆固醇纳米粒(实施例15)的药物释放
[0125][0126]
表11负载有尼罗红的甲氧基聚乙二醇10000-赖氨酸-双胆固醇纳米粒(实施例16)的药物释放
[0127][0128]
如表3～11所示，所制备负载有尼罗红的改性胆固醇纳米粒在含还原型谷胱甘肽的释放液中的释药速率，均显著高于在无还原型谷胱甘肽的释放液中的释药速率，体现出
改性胆固醇纳米粒具有还原响应型药物的释放特性。
[0129]
其中，从表6、表7、表8之间的相互比较来看，随着制备载药粒子的羟乙基淀粉的分子量变大，载药粒子对其中药物的释放程度没有发生明显的变化，更看不出变化规律，这是因为羟乙基淀粉与3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯反应结合时，相当于是3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯接枝在羟乙基淀粉的支链部位，因此无论是对于分子量大的羟乙基淀粉主链，还是对于分子量小的羟乙基淀粉主链，接枝后彼此间的重复单元结构理论上还是一样的，而大分子性能主要受重复单元结构的影响，因此各载药粒子之间，释放性能无明显变化。
[0130]
从表9、表10、表11之间的相互比较来看，随着自组装制备载药粒子的改性胆固醇的分子量增大，载药粒子对其中药物的释放程度相应变小，这是因为改性胆固醇为小分子，自组装载药状态下，各分子的胆固醇一端集中朝向中心处的疏水药物，亲水端则分散向外朝向溶剂水，由于亲水端分子聚合度的增加，导致对各分子上靠近胆固醇结构的二硫键的保护相对更好，也就更大程度阻挡了这里的二硫键受到外部(还原性)环境的影响而断裂释药，因此释药程度下降。
[0131]
但是从表3、表4、表5之间的相互比较来看，自组装制备载药粒子的改性胆固醇的分子量变小时，对药物的释放程度非但没有增加，反而有变小的趋势，这与表9、表10、表11之间的一般变化规律明显不同，对此，申请人认为，可能是由于本技术的改性胆固醇分子在结构上接近单一链状，从而在自组装形成载药粒子后，各分子链对相对靠近载药粒子中心区域的二硫键形成了协同保护作用，减缓了其断裂；而当聚乙二醇结构的聚合物增大后，各分子链之间的协同效应下降，使保护作用变弱。因此，申请人认为，在本技术的载药粒子分子结构上，聚乙二醇链段的行为模式，相比于其自身的聚合度、链段长短，对二硫键具有更为明显的影响。
[0132]
基于上述释药效果，再结合表1、表12中甲氧基聚乙二醇分子量选择2000时，载药粒子的载药性、靶向性也均是最高的，说明实施例4制备的甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒，具有作为缓释性靶向抗癌药物载药体的理想前景。
[0133]
表9、表10、表11中所检测的载药粒子，由于其分子结构的不同，无法达到实施例4中自组装形成载药粒子的分子链之间的协同保护效应。
[0134]
实验4
[0135]
肿瘤细胞摄取实验
[0136]
试验分散液配制：取实验1制备的载尼罗红纳米粒冻干粉加入至超纯水中，超声分散5分钟，分别配制得到尼罗红浓度为1mg/ml的各纳米粒分散液，将尼罗红溶于二甲基亚砜，配制得到1mg/ml的游离尼罗红溶液。以上述溶液为母液，以dmem培养基为稀释液，稀释得到尼罗红浓度为5μg/ml的各纳米粒试验液以及游离尼罗红试验液。
[0137]
肿瘤细胞摄取定量：将hepg2肝癌细胞以每孔20万个细胞的密度接种于6孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成上述配制的试验液，每组平行设置三个孔，于细胞培养箱中培养4小时，然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，通过流式细胞仪检测细胞摄取量(测细胞中尼罗红的含量，尼罗红有荧光，细胞荧光越强，说明摄取越多)。
[0138]
表12hepg2细胞摄取量
[0139]
样品肿瘤细胞荧光强度(a.u.)
实施例4(甲氧基聚乙二醇2000)244.7
±
12.6实施例5(甲氧基聚乙二醇5000)223.8
±
14.5实施例6(甲氧基聚乙二醇10000)181.2
±
13.6游离尼罗红178.6
±
15.5
[0140]
如表12所示，随着甲氧基乙二醇分子量的增加(2000～10000)，所制备的负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒的肿瘤细胞摄取量不断降低，其中，负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒的细胞摄取量最高；负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒和甲氧基聚乙二醇5000-胆固醇纳米粒的细胞摄取量均高于游离尼罗红，而负载尼罗红的甲氧基聚乙二醇10000-胆固醇纳米粒的细胞摄取量与游离尼罗红相当。以上结果表明甲氧基聚乙二醇2000-胆固醇纳米粒的肿瘤细胞摄取量最高。

技术特征：
1.一种还原响应型载药纳米粒，其特征在于：所述的载药纳米粒由甲氧基聚乙二醇-胆固醇在水溶液中自组装形成，所述甲氧基聚乙二醇-胆固醇的结构通式为2.一种如权利要求1所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：所述制备方法为，(1)将3，3
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二硫代二丙酸、胆固醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为2～4：1：2～8：0.5～2溶于二氯甲烷，加热回流过夜，然后旋干，加入少量乙酸乙酯溶解，加入至乙醇中沉淀，过滤，滤饼用乙醇洗涤后，真空干燥得3，3
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二硫代二丙酸单胆固醇酯；(2)将步骤(1)中得到的3，3
’‑
二硫代二丙酸单胆固醇酯、甲氧基聚乙二醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为1：1：2～8：0.5～2溶于二氯甲烷，加热回流24小时，然后旋干，加入超纯水分散，于超纯水中透析3天，离心分离后，取上清冷冻干燥得甲氧基聚乙二醇-胆固醇纳米粒。3.如权利要求2所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，3，3
’‑
二硫代二丙酸、胆固醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为2：1：4：1溶于二氯甲烷。4.如权利要求2所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，作为沉淀溶剂的乙醇的体积是乙酸乙酯的10～20倍。5.如权利要求2所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，3，3
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二硫代二丙酸单胆固醇酯、甲氧基聚乙二醇、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，按照摩尔比为1：1：4：1溶于二氯甲烷。6.如权利要求2所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，甲氧基聚乙二醇分子量为2000～10000。7.如权利要求6所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，甲氧基聚乙二醇分子量为2000。8.如权利要求2所述的还原响应型载药纳米粒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，离心分离为按8000转/分钟离心10分钟。

技术总结
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种还原响应型载药纳米粒及其制备方法，载药纳米粒由甲氧基聚乙二醇-胆固醇在水溶液中自组装形成，甲氧基聚乙二醇-胆固醇的结构通式为制备方法为，(1)将胆固醇与3，3


技术研发人员：胡航 肖文 袁晓音 徐德锋
受保护的技术使用者：常州大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/31