用于治疗法布里病的转基因表达盒

1.本公开属于基因工程技术领域。本公开涉及优化的编码α-半乳糖苷酶a蛋白的多核苷酸、包含编码α-半乳糖苷酶a蛋白的多核苷酸的转基因表达盒、重组aav载体以及用于预防或治疗法布里病的药物。


背景技术：

2.法布里病(fabry disease，fd，omim 301500)是由gla(omim 300644；hgnc 4296)基因突变引起的伴x染色体连锁的隐性遗传病。威廉
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安德森(william anderson)和约翰内斯
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法布里(johannes fabry)在1898年首次报道了该疾病，故也被称为安德森-法布里病(anderson-fabry disease)。法布里病属于一种比较罕见的x连锁遗传溶酶体贮积症(lysosomal storage disorder，lsd)，该疾病的影响不分种族、性别与地区。由于该疾病最初的临床表现使得容易发生误诊，目前其准确的患病率尚不可知。据报道，该疾病在普通人群中的患病率为1/40000-117000，而新生儿患病率高达1/1250。
3.gla基因位于x染色体的xq22.1位置，编码序列包含7个外显子，长度约1290bp，编码含429个氨基酸的α-半乳糖苷酶a(α-gal a酶，又名gla蛋白，ec 3.2.1.22)(simonetta i等，genetics and gene therapy of anderson-fabry disease[j].curr gene ther，2018，18(2)：96-106)。α-gal a酶能够水解体内多种糖结合物末端α-1,3和α-1,4键连接的半乳糖残基。目前已在法布里病患者中检测出1000多种不同的gla基因突变，其中最常见的几种突变类型包括错义突变(57％)、无义突变(11％)、片段缺失(6％)、片段插入(6％)，以及由于rna加工缺陷所导致的剪接突变(6％)。这些突变会破坏gla开放阅读框，导致α-gal a酶部分或完全失活，造成球形三酰基神经酰胺(globotriaosylceramide，gb3/gl3)及其衍生物脱乙酰基gb3(globotriaosylsphingosine，lyso-gb3/lyso-gl3)等代谢底物在血管平滑肌细胞、血管内皮上皮细胞、足细胞、间充质细胞、系膜细胞和肾小管细胞等不同类型细胞中贮积，进而导致细胞功能丧失，最终导致心脏、肾和脑血管等多器官损伤或死亡。
[0004]
目前，根据患者体内酶残留活性多少以及临床表现特点，可以将法布里病分为“经典型”和“迟发型”。经典型最见于半合子男性，体内无残留酶活性；这些患者通常在3-10岁期间表现出一些临床症状，典型症状包括神经性疼痛和血管角化瘤。迟发型法布里病患者体内残留的酶活性达到正常水平的2％-20％，多为杂合子女性；这些患者的病情较轻，早期不发病，通常在40-60岁出现症状，大多限于单个器官受累。然而，经典型和迟发型法布里病均会导致多个器官受损，引发并发症，但缺乏临床特异性。女性杂合子表现轻微或无症状，男性发病率一般高于女性。据估计，法布里男性患者预期寿命缩短15至20年；女性的预期寿命减少6～10年。
[0005]
对于法布里病的治疗，临床上最常用的方法是采用酶替代疗法(ert)。目前已上市的两种ert药物是注射用阿加糖酶α(replagal，shire)和注射用阿加糖酶β(fabrazyme，sanofi genzyme)。该治疗方法能有效清除体内储积的gb3和lyso-gb3等底物，缓解疾病疼痛，提高患者生活质量。但是，由于重组酶半衰期较短，因此两款药物均需要终生每2周一次
静脉输注给药，治疗成本高昂，并且长期使用可能会出现心脏、肾脏和脑部并发症(nowicki m等，enzyme replacement therapy in fabry disease in poland:a position statement[j].pol arch intern med，2020，130(1)：91-97)。
[0006]
因此，开发出更持久、更安全有效治疗法布里病的方法一直是研究的热点。目前一些新的药物或治疗策略已被报道，例如基因疗法、分子伴侣疗法、底物减少治疗(srt)及mrna疗法等，有望为法布里病治疗提供新的替代方案，其中基因疗法被认为是最有前景的治疗方法之一。
[0007]
但是，基因治疗面临的一个主要挑战是恢复法布里受损器官中的α-gal a酶活性。α-gal a酶被分泌到体循环中，被邻近和非邻近细胞重新摄取。这种交叉校正现象使某些组织器官可以充当酶工厂，在那里产生α-gal a酶，并释放到血液循环中，到达其余器官。有研究者提出将肝脏作为基因治疗法布里的靶器官。gla序列在体内转染肝细胞，表达的α-gal a酶可离开肝脏，经体循环到达远处的受累器官。基因治疗意味着使用适当的递送载体，在注射给药后保护遗传物质，稳定地将其携带到靶器官并将其导入细胞中，从而发挥治疗作用。
[0008]
腺相关病毒(adeno-associated virus，aav)是目前实现基因治疗的主要递送载体之一。aav能够在各种器官组织中长期稳定表达目的基因蛋白，特别是它可以有效地将治疗性转基因转移到肝脏中，有研究表明它能在血友病b患者体内持续表达长达7年。而且，在无辅助性病毒的情况下，aav无法自主复制，具有低免疫原性和相对较高的安全性，这些特性使其在多种疾病的基因治疗中具有明显的优势。
[0009]
对于法布里病，研究人员不断地开展aav基因治疗的试验性研究，他们尝试了多种不同的aav血清型，如aav1、aav2、aav2/6、aav8、aav9等。截至2021年3月，在clinicaltrials.gov上注册的涉及法布里病的aav疗法临床人体试验共有两项，一种是基于aav8载体的flt190，另一个是基于aav2/6载体的st-920。
[0010]
aav基因转移载体能够通过不同的衣壳蛋白向特定的细胞类型或组织转移从而发挥治疗作用，这种特异性可以通过将特定的aav衣壳蛋白与特定的转基因表达盒相结合而得到进一步强化，从而可以更有效地避免治疗性转基因在非靶组织、细胞中的表达，进一步提高aav介导的基因转移的有效性和安全性，实现更严格的表达。特别是，这对于以肝脏为导向的基因治疗具有重要意义。


技术实现要素：

[0011]
鉴于本领域中存在的上述情况和需求，本发明人设计并构建了多种新的转基因表达盒，其可以高效表达gla蛋白，优选同时具有器官/组织(特别是肝脏)特异性。本发明人进一步用具有器官/组织(特别是肝脏)特异性的aav病毒衣壳对转基因表达盒进行包装，由此构建了可用于预防或治疗法布里病的重组aav载体。
[0012]
在第一方面，本公开提供一种编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸，其核苷酸序列与seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，优选具有至少86％、90％、95％、99％或100％的同一性。
[0013]
在一些实施方式中，多核苷酸包含seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列。在一个优选实施方式中，多核苷酸的核苷酸序列如seq id no：1或seq id no：2所示。
[0014]
本公开的多核苷酸与天然gla基因相比具有显著更高的α-半乳糖苷酶a(gla蛋白)表达水平。
[0015]
在第二方面，本公开提供一种转基因表达盒，其包括：启动子、信号肽的编码序列、编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸、polya；所述编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸选自：根据第一方面所述的多核苷酸和seq id no：3所示的序列。
[0016]
在一些实施方式中，启动子选自：cb启动子、lxp2.1启动子、lxp2.3启动子、cag启动子、ef1启动子、泛素启动子、t7启动子、sv40启动子、vp16、vp64启动子、tuj1启动子、gfap启动子、波形蛋白启动子、rpe65启动子、vmd2启动子、突触蛋白启动子、vgat启动子、dat启动子、th启动子、骨钙蛋白启动子、cmv启动子、pgk1启动子、ubc启动子、tre启动子、uas启动子、ac5启动子、camkiia启动子、gds启动子和adh1启动子。在一个优选实施方式中，启动子选自cb启动子、lxp2.1启动子和lxp2.3启动子。在一个更优选实施方式中，启动子选自cb启动子和lxp2.1启动子。在一个最优选实施方式中，启动子为lxp2.1启动子。
[0017]
在一些实施方式中，信号肽选自α-半乳糖苷酶a的原始信号肽、bm40信号肽、fib信号肽、白蛋白信号肽、cd40原始信号肽、yfkn信号肽、bpr信号肽、mpr信号肽、phob信号肽、wapa信号肽、abna信号肽、α因子信号肽、酸性磷酸酶(pho5)信号肽、蔗糖酶(suc2信号肽)、蚕丝蛋白lc信号肽、人胰岛素信号肽、流感血凝素信号肽、gaussia luc信号肽、人il-2信号肽、人胰蛋白酶原-2信号肽、人igg2 h信号肽、小鼠igκ信号肽、vsv-g信号肽和人osm信号肽。在一个优选实施方式中，信号肽选自bm40信号肽和fib信号肽。在一个更优选实施方式中，信号肽为bm40信号肽。
[0018]
在一些实施方式中，信号肽为α-半乳糖苷酶a的原始信号肽，所述信号肽的编码序列选自如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：22所示的序列。
[0019]
在一些实施方式中，转基因表达盒的核苷酸序列选自seq id no：7至seq id no：17。
[0020]
在第三方面，本公开提供一种重组aav载体，其包含：根据第二方面所述的转基因表达盒和aav衣壳蛋白。
[0021]
在一些实施方式中，aav衣壳蛋白为天然aav衣壳蛋白或人工改造的aav衣壳蛋白。在一个优选实施方式中，aav衣壳蛋白的氨基酸序列如seq id no：25所示。
[0022]
在第四方面，本公开提供根据第三方面所述的重组aav载体在制备用于预防或治疗法布里病的药物中的应用。
[0023]
在第五方面，本公开提供一种药物，其包含：根据第三方面所述的重组aav载体和可选的赋形剂。
[0024]
在一些实施方式中，药物为注射剂。
[0025]
在第六方面，本公开提供一种治疗法布里病的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的根据第五方面所述的药物。
[0026]
在一些实施方式中，药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用。在一个优选实施方式中，药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。
[0027]
在第七方面，本公开提供一种将编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸递送至靶细胞中的方法，包括：1)将根据第二方面所述的转基因表达盒包装于aav衣壳蛋白中，形成根据第
三方面所述的重组aav载体；以及2)使所述靶细胞与所述重组aav载体接触。
[0028]
在一些实施方案中，靶细胞是离体细胞。在一些实施方案中，靶细胞是体内细胞。
附图说明
[0029]
图1是b101、b109、b110、b111、b112和b188表达盒的构建示意图。
[0030]
图2显示了图1所示的表达盒在huh7细胞裂解液和huh7上清液中的gla表达水平。
[0031]
图3是b188、b229和b251表达盒的构建示意图。
[0032]
图4显示了图3所示的表达盒在huh7细胞裂解液和huh7上清液中的gla表达水平。
[0033]
图5是b247、b248、b249和b250表达盒的构建示意图。
[0034]
图6显示了图5所示的表达盒在huh7细胞裂解液和huh7上清液中的gla表达水平。
[0035]
图7显示了图5所示的表达盒在huh7细胞裂解液和huh7上清液中α-gal a酶活性水平对比。各表达盒组与空白对照(nc)组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0036]
图8显示了图5所示的表达盒包装到aav843病毒载体(t02衣壳)中并向小鼠注射后，各病毒载体在小鼠肝脏基因组中的病毒拷贝数及α-gal a酶活性水平。各病毒载体组与fabry组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0037]
图9显示了图5所示的表达盒包装到aav843病毒载体(t02衣壳)中并向小鼠注射后，小鼠体内血浆中α-gal a酶的活性变化。各病毒载体组与fabry组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。各病毒载体组与wt组比较，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001，####p《0.0001。
[0038]
图10显示了图5所示的表达盒包装到aav843病毒载体(t02衣壳)中并向小鼠注射后，小鼠各组织中α-gal a酶的活性变化。各病毒载体组与fabry组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。各病毒载体组与wt组比较，
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[0039]
图11显示了图5所示的表达盒包装到aav843病毒载体(t02衣壳)中并向小鼠注射后，小鼠肾脏内的lyso-gb3含量(ng/ml)。各病毒载体组与fabry组比较，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。各病毒载体组与wt组比较，#p《0.05，##p《0.01，###p《0.001，####p《0.0001。
[0040]
图12显示了图5所示的表达盒包装到aav843病毒载体(t02衣壳)中并向小鼠注射后，fabry模型小鼠肾脏的病理学变化(苏木素-尹红(he)染色)。
[0041]
图13显示了密码子优化的α-半乳糖苷酶a(gla蛋白)编码核酸序列(gla优化1)(seq id no：1)
[0042]
图14显示了密码子优化的α-半乳糖苷酶a(gla蛋白)编码核酸序列(gla优化2)(seq id no：2)
[0043]
图15显示了b109表达盒的核苷酸序列(seq id no：7)。
[0044]
图16显示了b110表达盒的核苷酸序列(seq id no：8)。
[0045]
图17显示了b111表达盒的核苷酸序列(seq id no：9)。
[0046]
图18显示了b112表达盒的核苷酸序列(seq id no：10)。
[0047]
图19显示了b188表达盒的核苷酸序列(seq id no：11)。
[0048]
图20显示了b229表达盒的核苷酸序列(seq id no：12)。
[0049]
图21显示了b251表达盒的核苷酸序列(seq id no：13)。
[0050]
图22显示了b247表达盒的核苷酸序列(seq id no：14)。
[0051]
图23显示了b248表达盒的核苷酸序列(seq id no：15)。
[0052]
图24显示了b249表达盒的核苷酸序列(seq id no：16)。
[0053]
图25显示了b250表达盒的核苷酸序列(seq id no：17)。
具体实施方式
[0054]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。在本文中的描述中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在限制本发明。
[0055]
除非另有说明，否则本文列出的核酸或多核苷酸序列是单链形式，方向是从5'至3'，从左至右。本文提供的核苷酸和氨基酸采用iupaciub生化命名委员会建议的格式，对于氨基酸采用单字母代码或三字母代码。
[0056]
术语
[0057]
在本文中，术语“多核苷酸”是“核酸”的同义词，指任何长度的核苷酸的聚合形式，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们的混合序列或类似物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，例如甲基化或限制的核苷酸和核苷酸类似物。
[0058]
在本文中，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式术语(即意味着“包括但不限于”)。
[0059]
在本文中，术语“密码子优化”是指从其天然形式修饰的多核苷酸序列。这样的修饰导致一个或多个碱基对的差异，其相应的氨基酸序列中有或没有改变，可能增强或抑制基因的表达和/或对修饰的多核苷酸序列的细胞应答。
[0060]
在本文中，术语“患者”和“受试者”可互换使用并且以其常规意义使用，指患有或容易患有可通过施用本公开的药物进行预防或治疗的病症的生物体，并且包括人和非人动物(例如，啮齿动物或其他哺乳动物)。
[0061]
在一些实施方式中，受试者是非人动物(例如，黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物包括啮齿类动物，如小鼠、大鼠和豚鼠；禽类，包括家禽、野禽和猎禽，如鸡、火鸡和其他鸡类、鸭、鹅等)。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物。在一些实施方式中，受试者是人。
[0062]
在本文中，术语“治疗”包括：(1)抑制病状、疾病或者病症，即，阻止、减少或者延迟疾病的发展或其复发或者其至少一种临床或者亚临床症状的发展；或者(2)缓解疾病，即，引起病状、疾病或者病症或者其临床或者亚临床症状中的至少一种消退。
[0063]
在本文中，术语“治疗有效量”或“有效量”指产生施用它要达到的治疗效果的剂量。例如，适用于治疗眼部疾病的药物的治疗有效量可为能够预防或改善与该眼部疾病相关的一种或多种症状的量。
[0064]
在本文中，术语“改善”指与疾病有关的症状的改善，并且可以指至少一种衡量或定量该症状的参数的改善。
[0065]
在本文中，术语“预防”病状、疾病或者病症包括：预防、延迟或者减少受试者中发展的病状、疾病或者病症的至少一种临床或者亚临床症状出现的发生率和/或可能性，该受
试者可能患有或易患该病状、疾病或者病症但尚未经历或者表现出该病状、疾病或者病症的临床或亚临床症状。
[0066]
在本文中，术语“局部施用”或“局部途径”是指具有局部作用的给药。
[0067]
在本文中，术语“转导”、“转染”和“转化”是指将外源核酸递送到宿主细胞中，然后多核苷酸产物的转录和翻译的过程，该过程包括使用重组病毒将外源多核苷酸引入宿主细胞。
[0068]
在本文中，术语“基因表达”或“表达”是指基因转录、翻译和翻译后修饰产生基因的rna或蛋白产物的过程。
[0069]
在本文中，术语“靶向”是指载体优先进入一些细胞或组织，然后进一步在细胞中表达病毒基因组或重组转基因携带的序列。
[0070]
在本文中，术语“载体”指封装多核苷酸的一个或一系列大分子，其促进多核苷酸在体外或体内递送至靶细胞。载体的种类包括但不限于质粒、病毒载体、脂质体和其他基因递送载体。
[0071]
在本文中，术语“表达盒”、“转基因盒”和“转基因表达盒”可互换地使用，指编码特定蛋白质、多肽或rnai元件的多核苷酸片段，其可以克隆到质粒载体中，也可以包装到病毒颗粒(如aav)中以将转基因产物递送到靶细胞中。
[0072]
在本文中，术语“可选”或“可选的”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。
[0073]
在本文中，术语“人工重组的病毒基因组”或“重组基因组”是指替代itr之间天然aav基因组的人为设计或人工合成的外源dna序列。包含人工重组的病毒基因组的aav称为“重组aav”。其中，重组aav可基于其中所包含的重组基因组的表达实现不同的功能。
[0074]
在本文中，术语“赋形剂”是指药物中附着于有效成分的天然或合成物质，例如溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些赋形剂可以帮助病毒颗粒的储存和对受试者的给药。赋形剂可以包括任何合适的组分，例如但不限于盐水。盐水的说明性例子包括但不限于缓冲盐水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液、蔗糖溶液、盐溶液和聚山梨醇酯溶液。
[0075]
在本文中，术语“反向末端重复(itr)”包括形成发夹结构并用作顺式元件以介导病毒复制、包装和整合的任何aav病毒末端重复或合成序列。本文的itr包括但不限于来自1-11型aav(禽类aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav)的末端重复序列。此外，aav末端重复序列不必具有天然末端重复序列，只要该末端重复序列可用于病毒复制、包装和整合即可。
[0076]
编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸
[0077]
本发明人对编码α-半乳糖苷酶a的核酸序列进行了优化，由此获得了高效表达α-半乳糖苷酶a的基因片段。
[0078]
本公开的编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸的核苷酸序列与seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸与seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0079]
在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸如seq id no：1或seq id no：2所示。
[0080]
此外，本发明人还通过在编码α-半乳糖苷酶a蛋白的多核苷酸(seq id no：1)中插入内含子(rglobin)形成seq id no：3所示的序列。
[0081]
编码α-半乳糖苷酶a的原始信号肽的多核苷酸
[0082]
本发明人还对编码α-半乳糖苷酶a的原始信号肽的核酸序列(seq id no：22)进行了优化。本公开的编码α-半乳糖苷酶a的原始信号肽的多核苷酸的核苷酸序列与seq idno：4或seq id no：5所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性。在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸与seq id no：4或seq id no：5所示的核苷酸序列具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
[0083]
在一些实施方式中，编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸如seq id no：4或seq id no：5所示。
[0084]
转基因表达盒
[0085]
本公开的转基因表达盒包括：启动子、信号肽的编码序列、编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸、polya。
[0086]
在一些实施方式中，信号肽的编码序列位于编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸的n末端。
[0087]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、α-半乳糖苷酶a信号肽的原始编码序列、α-半乳糖苷酶a的原始编码序列以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：6所示，命名为b101。
[0088]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、如seq id no：4所示的优化的信号肽编码序列、如seq id no：1所示的优化的α-半乳糖苷酶a编码序列以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：7所示，命名为b109。
[0089]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、如seq id no：5所示的优化的信号肽编码序列、如seq id no：2所示的优化的α-半乳糖苷酶a编码序列以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：8所示，命名为b110。
[0090]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、α-半乳糖苷酶a信号肽的原始编码序列、如seq id no：1所示的优化的α-半乳糖苷酶a编码序列以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：9所示，命名为b111。
[0091]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、α-半乳糖苷酶a信号肽的原始编码序列、如seq id no：2所示的优化的α-半乳糖苷酶a编码序列以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：10所示，命名为b112。
[0092]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、如seq id no：4所示的优化的信号肽编码序列、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：11所示，命名为b188。
[0093]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、bm40信号肽(编码序列)、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：12所示，命名为b229。
[0094]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括cb启动子、fib信号肽(编码序列)、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述
转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：13所示，命名为b251。
[0095]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括lxp2.1启动子、bm40信号肽(编码序列)、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：14所示，命名为b247。
[0096]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括lxp2.1启动子、fib信号肽(编码序列)、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：15所示，命名为b248。
[0097]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括lxp2.3启动子、bm40信号肽(编码序列)、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：16所示，命名为b249。
[0098]
在一个实施方式中，转基因表达盒包括lxp2.3启动子、fib信号肽(编码序列)、如seq id no：3所示的序列(通过在seq id no：1中插入内含子(rglobin)而形成)以及polya；所述转基因表达盒的核苷酸序列如seq id no：17所示，命名为b250。
[0099]
在一些实施方式中，转基因表达盒还包含其他调控元件以使转基因包装到病毒中，例如两侧的反向末端重复序列(itr)。在一些实施方式中，两侧的两个itr各自独立地为正常itr或缩短的itr，例如长度约145bp的正常itr或长度约100bp的缩短itr。
[0100]
在一些实施方式中，转基因表达盒还包含用于控制蛋白质产物表达的多核苷酸元件，例如增强子、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(ires)、2a信号(例如p2a、t2a、f2a)。
[0101]
在一些实施方式中，转基因表达盒编码的蛋白质产物连接寡肽标签(例如，flag、6
×
his、2
×
ha、myc)，其有助于蛋白质产物的纯化。本领域技术人员理解与蛋白质纯化有关的技术和程序。
[0102]
重组aav载体
[0103]
在一个具体实施方式中，使用包含5’itr、重组基因组和3’itr的dna质粒来生产aav病毒载体，其中5’itr和3’itr分别位于重组基因组的两侧。可以通过使用已知的技术，例如通过转染，将dna质粒、编码aav cap/rep基因的质粒和由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助质粒同时引入合适的宿主细胞，由此生产aav病毒载体。dna质粒可以在宿主细胞中表达，并被包装成病毒颗粒。
[0104]
在一些实施方式中，aav衣壳蛋白可以为任何aav血清型衣壳蛋白，包括天然aav衣壳蛋白(例如，天然的1-11型aav、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav的衣壳蛋白)和其他人工改造的aav衣壳蛋白(例如，人工改造的1-11型aav、禽aav、牛aav、犬aav、马aav和绵羊aav的衣壳蛋白)。
[0105]
不同aav血清型的基因组序列、itr序列、rep和cap蛋白在本领域内是已知的。这些序列可以在文献或在公共数据库查找，例如genbank数据库、uniprot蛋白质数据库。
[0106]
药物
[0107]
药物的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述药物的药代动力学参数例如药物组织分布、生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。
[0108]
在一些实施方式中，药物的剂型可以为注射剂、片剂、胶囊剂或散剂。
[0109]
在一些实施方式中，药物可以以单剂量或多剂量递送。
[0110]
在一些实施方案中，可以使用多于一次给药(例如两次、三次、四次或更多次给药)以在各个间隔的时间段内(例如每天、每周、每月、每年等)实现期望水平的蛋白表达。
[0111]
在一些实施方案中，药物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如在密封的安瓿瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需要在使用前立即加入无菌液体，例如盐水或注射用水。
[0112]
下面结合附图和实施例对本公开作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。实施例中所用细胞、试剂等均可通过商业渠道获得。实施例中未注明具体条件的实验方法，系按照本领域已知的常规条件，或按照制造厂商所建议的条件进行操作。
[0113]
实施例
[0114]
在本公开的实施例中，所有数据均以均值
±
标准差(sd)表示。采用graphpad prism软件进行统计分析并作图。用t检验计算。
[0115]
实施例1：b101、b109、b110、b111、b112和b188表达盒的构建
[0116]
首先，基于ncbi基因库中的人源gla全长cdna序列，对gla的原始序列进行密码子优化，得到两个密码子优化的序列：gla优化1(seq id no：1)和gla优化2(seq id no：2)。同时，对gla蛋白的原始信号肽的编码序列(sp未优化，seq id no：22)进行密码子优化，得到两个密码子优化的序列：sp优化1(seq id no：4)和sp优化2(seq id no：5)。
[0117]
接着，如图1所示，分别采用sp原始、sp优化1和sp优化2，构建基于gla原始序列、gla优化1序列和gla优化2序列的表达盒b101(seq id no：6)、b109(seq id no：7)、b110(seq id no：8)、b111(seq id no：9)、b112(seq id no：10)和b188(seq id no：11)。
[0118]
b101：sp未优化-gla未优化
[0119]
b109：sp优化1-gla优化1
[0120]
b110：sp优化2-gla优化2
[0121]
b111：sp未优化-gla优化1
[0122]
b112：sp未优化-gla优化2
[0123]
b188：sp优化1-gla优化1-rglobin
[0124]
注：b188的gla优化1中插入了1个嵌合内含子(rglobin)。所有表达盒都含有cb启动子和polya序列。
[0125]
实施例2：b101、b109、b110、b111、b112和b188表达盒的gla蛋白表达
[0126]
将生长状态良好的huh7细胞铺于6孔板中，接种密度为1e6个细胞/孔。12h后待细胞贴壁生长后，使用pei转染试剂将上述6个表达盒的质粒载体转入细胞内,每孔转染5μg质粒，按比例加入2倍体积的pei试剂。转染后6h换液，培养48h收取细胞及上清液，使用非变性细胞组织裂解液提取细胞中蛋白，bca试剂盒进行蛋白定量，并进行western blot检测gla蛋白表达和分泌水平。
[0127]
western blot结果显示(图2)，与空白对照组(nc)相比，在表达与分泌上，5个优化的载体转染组(b109、b110、b111、b112和b188)的细胞裂解液以及细胞上清液中gla蛋白表达量都显著提高。huh7细胞中，b188载体组gla蛋白表达量明显优于其他载体组；huh7上清
液中，b109、b112和b188载体组的gla蛋白分泌量较高。综合来看，在gla蛋白的表达和分泌上，b188载体组的表现较佳。
[0128]
实施例3：b229和b251表达盒的构建
[0129]
在本实施例中，本发明人在b188表达盒的基础上再次进行优化设计，用2种分泌肽bm40和fib替代sp优化1，其余结构不变，得到2个新的优化表达盒：b229(seq id no：12)和b251(seq id no：13)。b229和b251表达盒的结构如图3所示。
[0130]
b229：bm40-gla优化1-rglobin
[0131]
b251：fib-gla优化1-rglobin
[0132]
注：b229和b251的gla优化1中均插入了1个嵌合内含子(rglobin)，且均含有cb启动子和polya序列。
[0133]
实施例4：b188、b229和b251表达盒的gla蛋白表达
[0134]
与实施例2中所述的步骤类似地，将3个表达盒的质粒载体(b188、b229和b251)分别转染到huh7细胞，比较它们在细胞水平的gla蛋白表达。
[0135]
western blot结果显示(图4，上图)，与空白对照组(nc)相比，在表达与分泌上，3个载体转染组(b188、b229和b251)的细胞裂解液以及细胞上清液中gla蛋白表达量均升高。其中，转染b229载体(bm40分泌肽)的huh7细胞中gla蛋白表达量最高，b251载体(fib分泌肽)次之，两者均优于b188载体(sp优化1)。huh7上清液中，3个载体组均可分泌表达gla蛋白，b229与b251分泌量差异不明显，均显著高于b188载体。对western blot条带进行半定量分析(图4，下图)，印证了上述结论。综合来看，在gla蛋白的表达和分泌上，b229载体表现最好。
[0136]
实施例5：b247、b248、b249和b250表达盒的构建
[0137]
在本实施例中，本发明人继续在b229和b251表达盒的基础上进行优化设计，用2种肝脏特异性启动子lxp2.1和lxp2.3替代cb启动子，得到4个新的优化表达盒：b247(seq id no：14)、b248(seq id no：15)、b249(seq id no：16)和b250(seq id no：17)。各表达盒的结构如图5所示。
[0138]
b247：lxp2.1-bm40-gla优化1-rglobin
[0139]
b248：lxp2.1-fib-gla优化1-rglobin
[0140]
b249：lxp2.3-bm40-gla优化1-rglobin
[0141]
b250：lxp2.3-fib-gla优化1-rglobin
[0142]
注：所有表达盒的gla优化1中均插入了1个嵌合内含子(rglobin)，且均含有polya序列。
[0143]
实施例6：b247、b248、b249和b250表达盒的gla蛋白表达
[0144]
与实施例2中所述的步骤类似地，将4个表达盒的质粒载体(b247、b248、b249和b250)分别转染到huh7细胞，比较它们在细胞水平的gla蛋白表达。
[0145]
western blot结果显示(图6)，与空白对照组(nc)相比，在表达与分泌上，4个载体转染组(b247、b248、b249和b250)的细胞裂解液以及细胞上清液中gla蛋白表达量均显著提高。其中，转染b248载体(lxp2.1启动子)的huh7细胞中gla蛋白表达量最高，明显优于b247载体(lxp2.1启动子)、b249载体(lxp2.3启动子)和b250载体(lxp2.3启动子)。huh7上清液中，4个载体组均可分泌表达gla蛋白，且分泌水平都较高，分泌量差异不明显。综合来看，在
gla蛋白的表达和分泌上，b248载体表现最好。
[0146]
实施例7：b247、b248、b249和b250表达盒的α-gal a酶活性水平
[0147]
本发明人进一步对huh7细胞裂解液和上清液中的α-gal a酶活性水平进行了检测。
[0148]
4个载体(b247、b248、b249和b250)在huh7细胞裂解液和上清液中的α-gal a酶活性水平如图7所示。huh7细胞中，相较于空白对照组(nc)，4个载体转染组的细胞中α-gal a酶活性水平显著升高，且b247载体组的α-gal a酶活性高于其他3个载体组。huh7上清液中，相较于nc组，4个载体转染组的细胞中α-gal a酶活性水平均显著提升，其中b247和b248载体组的α-gal a酶活性水平相近，略低于b249和b250载体组。总α-gal a酶活性测定中，上清液占比高，因此趋势与huh7上清液相似；分泌至上清液的α-gal a酶活性占总体的80％左右，其中b250载体组的分泌效率最高，b249载体组的整体α-gal a酶活性最高，分泌比例略低。综合来看，4个载体均能在肝癌细胞huh7中显著表达和分泌gla蛋白，其中b249载体的总体表现最好。
[0149]
综上所述，转染载体在细胞水平上表达的α-gal a酶活性与其western blot表达结果互相佐证，并表明本实施例中构建的4个载体在肝癌细胞系huh7中均可以成功表达gla蛋白且将其有效分泌到胞外。
[0150]
实施例8：b247、b248、b249和b250载体对法布里病的治疗作用
[0151]
为了验证4个载体(b247、b248、b249和b250)对法布里病的治疗作用，将4个表达盒包装到具有肝脏靶向性的aav843病毒载体(t02衣壳)中，通过尾静脉注射的给药方式，向2月龄的法布里模型小鼠(雄性)体内注射病毒载体，剂量为1e13 vg/kg(病毒基因组数/千克体重)，同时设置法布里(fabry)模型和野生型(wt)小鼠对照组(n＝5)。治疗后4周，对全部小鼠实行安乐死，收集小鼠血样及组织样本，进行后续的检测和分析。
[0152]
首先，提取小鼠的肝脏组织dna，通过qpcr检测各病毒载体在小鼠肝脏基因组中的拷贝数；同时提取蛋白，检测肝脏中的α-gal a酶活性。结果如图8所示。b248组在小鼠肝脏基因组中的拷贝数最多(约264个拷贝/ng gdna)，远高于b247组(约106个拷贝/ng gdna)、b249组(约170个拷贝/ng gdna)、b250组(约164个拷贝/ng gdna)，后3组的肝脏中aav拷贝数较为接近。
[0153]
上述结果表明，4个载体均能提高肝脏中α-gal a酶活性，证明4个载体均可以有效靶向肝脏并表达α-gal a酶。其中，b247和b248载体组的α-gal a酶活性恢复至远超正常生理水平，b247载体组的α-gal a酶活性略高于b248载体组，b249和b250载体组的酶活性较前二者低，但仍高于fabry与wt对照组。
[0154]
综合肝脏拷贝数与酶活性结果可以看出，b247载体组进入肝脏的病毒拷贝数最低，但其酶活性却呈高表达，b248进入肝脏的病毒拷贝数最高，但其酶活性低于b247，由此说明b247在肝脏中的表达最强。
[0155]
在治疗后不同时间点对小鼠进行眼眶取血，分离外周血浆，检测肝脏分泌出来进入到血液循环的α-gal a酶活性水平。血浆中α-gal a酶活性结果如图9所示。
[0156]
注射前(第0周)，模型小鼠和wt小鼠之前存在显著差异，各模型组小鼠血浆中均检测不到α-gal a酶活性；注射后第1周，各载体组的α-gal a酶活性均有所提高，远超法布里未治疗组(fabry)，与wt组具有显著性差异；注射后第2周，各载体组的α-gal a酶活性较第1
周略有升高；注射后第3周，b247和b248载体组的小鼠血浆中酶活性较高，分别达到wt水平的994倍和1140倍，b247和b248载体组略低，分别达到wt水平的23倍和61倍；注射后第4周，各载体组的α-gal a酶活性的整体趋势与第3周时接近(仅略有下降)，表达水平稳定。
[0157]
上述结果表明，4个病毒载体在小鼠体内均能长期稳定表达和分泌gla蛋白。其中b247和b248载体分泌到血液循环的α-gal a酶含量显著高于b249和b250载体，且4个病毒载体组的酶活性均高于未治疗的fabry小鼠与wt小鼠，在注射后3周左右表达到达高峰期。
[0158]
治疗后4周，对全部小鼠实行安乐死，取小鼠主要组织器官，测定其各脏器中α-gal a酶活性及有毒代谢底物lyso-gb3含量。
[0159]
法布里小鼠主要受损器官心、肾、脑中α-gal a酶活性结果如图10所示。在心脏中，b247和b248载体组的α-gal a酶活性恢复至超生理水平，b249和b250载体组的酶活性恢复至wt水平；在肾脏中，b247和b248载体组的α-gal a酶活性分别恢复至wt组2.8倍与6.9倍；在脑中，由于血脑屏障的存在，4个载体组的α-gal a酶活性恢复至略高于fabry组水平，但远低于wt水平。
[0160]
整体而言，4个优化的载体组在肝脏中表达、分泌到血液循环中的α-gal a酶均能被法布里小鼠的各组织有效摄取，可以显著提高法布里小鼠各组织中的α-gal a酶活性水平。其中，b247和b248载体组可以将各组织中的α-gal a酶活性恢复至更高水平。
[0161]
对法布里主要受累的靶器官肾脏中的有毒代谢底物lyso-gb3含量进行检测，结果如图11所示。4个载体治疗组均明显降低了法布里小鼠肾脏内的lyso-gb3含量，其中b247和b248载体组的治疗效果尤其显著。在治疗4周后，b247和b248载体组的lyso-gb3含量仅为法布里小鼠的1.9％和3.3％，其中b247的清除效果略胜于b248，b249和b250载体组的lyso-gb3含量分别为法布里小鼠的21.8％和34.5％。
[0162]
综合来看，b247和b248载体能将各组织的α-gal a酶活性恢复至较高水平，且b247对于有毒底物lyso-gb3的清除效果更佳；b249和b250载体对于α-gal a酶活性的恢复、底物lyso-gb3的清除效果也有一定效果。在4个载体中，b247载体的效果最好。
[0163]
最后，对短期治疗模型小鼠的肾脏进行病理学变化的检测，结果如图12所示。注射后4周，b247组、b248组和b249组的肾脏病理学表现为轻至中度的肾小管变性和轻至中度的鲍曼氏囊增生；b248组的肾脏肾盏处有中度以单核细胞为主的炎细胞浸润；b250组的肾脏病理学表现为中度的肾小管变性和轻至中度的鲍曼氏囊增生；fabry组的肾脏病理学表现为中至重度的肾小管变性和轻至中度的鲍曼氏囊增生。结果表明，4个优化载体均能有效纠正法布里肾脏的病理学表现。总体而言，b247组的肾脏病理学表现最轻微，治疗效果最好。
[0164]
虽然通过参照本公开的某些优选实施方式，已经对本公开进行了图示和描述，但本领域的普通技术人员应该明白，以上内容是结合具体的实施方式对本公开所作的进一步详细说明，不能认定本公开的具体实施只局限于这些说明。本领域技术人员可以在形式上和细节上对其作各种改变，包括做出若干简单推演或替换，而不偏离本公开的精神和范围。

技术特征：
1.编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的核苷酸序列与seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列具有至少85％的同一性，优选具有至少86％、90％、95％、99％或100％的同一性。2.根据权利要求1所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸包含seq id no：1或seq id no：2所示的核苷酸序列，优选地，所述多核苷酸的核苷酸序列如seq id no：1或seq id no：2所示。3.转基因表达盒，其包括：启动子、信号肽的编码序列、编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸、polya；所述编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸选自：权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的多核苷酸和seq id no：3所示的序列。4.根据权利要求3所述的转基因表达盒，其中，所述启动子选自：cb启动子、lxp2.1启动子、lxp2.3启动子、cag启动子、ef1启动子、泛素启动子、t7启动子、sv40启动子、vp16、vp64启动子、tuj1启动子、gfap启动子、波形蛋白启动子、rpe65启动子、vmd2启动子、突触蛋白启动子、vgat启动子、dat启动子、th启动子、骨钙蛋白启动子、cmv启动子、pgk1启动子、ubc启动子、tre启动子、uas启动子、ac5启动子、camkiia启动子、gds启动子和adh1启动子；优选地，所述启动子选自cb启动子、lxp2.1启动子和lxp2.3启动子；更优选地，所述启动子选自cb启动子和lxp2.1启动子；最优选地，所述启动子为lxp2.1启动子。5.根据权利要求3或4所述的转基因表达盒，其中，所述信号肽选自α-半乳糖苷酶a的原始信号肽、bm40信号肽、fib信号肽、白蛋白信号肽、cd40原始信号肽、yfkn信号肽、bpr信号肽、mpr信号肽、phob信号肽、wapa信号肽、abna信号肽、α因子信号肽、酸性磷酸酶(pho5)信号肽、蔗糖酶(suc2信号肽)、蚕丝蛋白lc信号肽、人胰岛素信号肽、流感血凝素信号肽、gaussia luc信号肽、人il-2信号肽、人胰蛋白酶原-2信号肽、人igg2 h信号肽、小鼠igκ信号肽、vsv-g信号肽和人osm信号肽；优选地，所述信号肽选自bm40信号肽和fib信号肽；更优选地，所述信号肽为bm40信号肽。6.根据权利要求5所述的转基因表达盒，其中，所述信号肽为α-半乳糖苷酶a的原始信号肽，所述信号肽的编码序列选自如seq id no：4、seq id no：5和seq id no：22所示的序列。7.根据权利要求3至6中任一项所述的转基因表达盒，其中，所述转基因表达盒的核苷酸序列选自seq id no：7至seq id no：17。8.重组aav载体，其包含：权利要求3至7中任一项所述的转基因表达盒和aav衣壳蛋白。9.根据权利要求8所述的重组aav载体，其中，所述aav衣壳蛋白为天然aav衣壳蛋白或人工改造的aav衣壳蛋白；优选地，所述aav衣壳蛋白的氨基酸序列如seq id no：25所示。10.权利要求8或9所述的重组aav载体在制备用于预防或治疗法布里病的药物中的应用。11.药物，其包含：权利要求8或9所述的重组aav载体和可选的赋形剂。12.根据权利要求11所述的药物，其中，所述药物通过全身途径或局部途径施用，例如静脉内施用、肌内施用、皮下施用、经口施用、局部接触、腹膜内施用和病灶内施用；优选地，所述药物通过全身途径施用，例如静脉内施用。13.根据权利要求11或12所述的药物，其中，所述药物为注射剂。
14.将编码α-半乳糖苷酶a的多核苷酸递送至靶细胞中的方法，包括：1)将权利要求3至7中任一项所述的转基因表达盒包装于aav衣壳蛋白中，形成权利要求8或9所述的重组aav载体；以及2)使所述靶细胞与所述重组aav载体接触。15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述靶细胞是离体细胞。

技术总结
本发明涉及优化的编码α-半乳糖苷酶A蛋白的多核苷酸、包含编码α-半乳糖苷酶A蛋白的多核苷酸的转基因表达盒、重组AAV载体以及用于预防或治疗法布里病的药物。本发明的转基因表达盒、重组AAV载体和药物可以高效表达GLA蛋白，优选同时具有器官/组织(特别是肝脏)特异性，在法布里患者的受损器官中疗效更强，更有效地缓解疾病表型，由此实现对法布里病的良好治疗效果。治疗效果。治疗效果。


技术研发人员：吴侠 吴军 李占鳌
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.06.01
技术公布日：2023/8/31