ZLN005在制备治疗矽肺的药物中的应用

zln005在制备治疗矽肺的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及zln005在制备治疗矽肺的药物中的应用。


背景技术：

2.矽肺是一种由于长期吸入大量游离二氧化硅粉尘所引起的一种潜在的肺间质性疾病，其特征是持续性的炎症和永久性的肺纤维化。地壳中丰富的二氧化硅及其在极其广泛的工业环境中的存在使矽肺的发病率很高。目前，该病的临床治疗方法有限，肺灌洗、肺移植和干细胞治疗都受到短暂治疗效果和频繁不良影响的限制。由于矽肺发病机制复杂，现有的防治手段仍不能有效的改善矽肺损伤。因此，迫切需要深入阐明矽肺发病机制，探寻新的干预靶点和防治手段，这具有十分重要的实际意义和临床应用价值。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供zln005在制备治疗矽肺的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明研究发现zln005可以抑制矽肺纤维化，因此可用于制备治疗矽肺的药物。
4.在肺部，巨噬细胞构成了抵御病原体和异物的第一道防线，在维持组织稳态方面发挥着重要作用。以往研究证实，巨噬细胞吞噬进入肺泡的二氧化硅后，释放炎症因子，放大了肺部的炎症反应。此外，巨噬细胞可以通过分泌转化生长因子-β1刺激成纤维细胞的增殖和迁移，加速肺纤维化的进展。新近研究发现，二氧化硅会导致巨噬细胞脂质代谢紊乱，加剧巨噬细胞中脂质的积累，诱导泡沫细胞的形成。此外，研究证实矽肺患者肺泡灌洗液中氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)降低，肺泡灌洗液的巨噬细胞中ox-ldl升高，ox-ldl的摄入是巨噬细胞泡沫化的关键，加剧细胞中脂质的蓄积。众所周知，脂质代谢是肺的一种特殊代谢方式，主要利用脂肪酸氧化在缺氧状态下获取能量，并且磷脂、鞘脂等脂质是肺泡表面活性剂合成中的重要成分，对维持正常肺泡表面张力起着重要作用。本发明前期研究发现，二氧化硅促进巨噬细胞脂质代谢紊乱，并可能触发促纤维化因子的产生，加速矽肺的进展。这些研究表明，脂质代谢紊乱在矽肺纤维化进展中扮演着重要作用。
5.过氧化物酶体-增殖物激活受体-γ-共激活剂-1α是脂质和代谢调节的关键因子，在维持脂质稳态中起着至关重要的作用。据报道，pgc1α可以通过调控lxr-abca1信号通路介导肾胆固醇外排来改善糖尿病肾损伤。此外，pgc1α也可以通过调控cd36介导脂质代谢紊乱改善肾间质纤维化。本发明前期证实cd36参与调控矽肺中的脂质代谢紊乱。表明pgc1α是调控脂质代谢紊乱的关键基因，可能在矽肺脂质代谢中扮演着重要的作用。然而，迄今为止，pgc1α在矽肺进展中的机制尚不清楚。本发明探讨了zln005在促进脂质稳态方面的保护作用，及其对矽肺纤维化可能的调控机制。
6.基于此，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供zln005在制备治疗矽肺的药物中的应用。
8.进一步地，所述治疗矽肺是指抑制矽肺的纤维化。
9.进一步地，所述矽肺是二氧化硅诱导。
10.本发明还提供一种治疗矽肺的药物，包括zln005。
11.进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
12.进一步地，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂或注射剂。
13.本发明还提供zln005在制备改善脂质代谢紊乱的药物中的应用。
14.进一步地，所述脂质代谢紊乱是二氧化硅诱导。
15.本发明公开了以下技术效果：
16.zln005是过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α(pgc1α)的激活剂。为探究zln005是否可以减缓矽肺纤维化的进展，本发明在二氧化硅刺激的大鼠巨噬细胞和小鼠矽肺模型中给予zln005治疗，探究其对矽肺脂质代谢紊乱及肺纤维化的影响。结果发现二氧化硅诱导nr8383巨噬细胞中脂质代谢紊乱，zln005减缓了巨噬细胞和矽肺小鼠中的脂质代谢紊乱，并抑制的肺纤维化。因此，zln005通过减少矽肺小鼠的脂质代谢紊乱而显示出抗纤维化作用。本发明为zln005在矽肺纤维化中的疗效提供了实质性证据。zln005改善脂质代谢紊乱，抑制了sio2诱导的纤维化，这表明zln005可以治疗矽肺病，抑制矽肺纤维化。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
18.图1为油红o染色和western blot检测sio2对nr8383细胞中脂质的影响的结果；其中，a为油红o染色结果；b为pgc1α的western blot检测结果；c-e分别为pgc1α、cd36和lxr的相对含量统计结果；
19.图2为zln005对sio2诱导的脂质代谢紊乱的影响；其中，a为不同zln005浓度下pgc1α的western blot检测结果；b为pgc1α相对含量统计结果；c为细胞存活率；d和e分别为免疫荧光染色和bodipy染色结果；f-h分别为fc、tc和ce的含量；i为ce的比例；j为western blot检测细胞中脂质相关因子cd36、pgc1α、lxr和abca1的表达情况的结果；k-n为cd36、abca1、lxr和pgc1α相对含量统计结果；d和e中标尺均为20μm；
20.图3为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞样品保留时间和质荷比的二维离子强度图；
21.图4为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞的正离子pca评分图(a)、opls-da图(b)、s-plot图(c)和排列评分图(d)；
22.图5为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞的负离子pca评分图(a)、opls-da图(b)、s-plot图(c)和排列评分图(d)；
23.图6为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞的正离子的差异代谢物；
24.图7为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞的负离子的差异代谢物；
25.图8为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞的差异代谢物的富集分析；
26.图9为zln005刺激sio2诱导的巨噬细胞的差异代谢物的通路分析；
27.图10为ox-ldl对nr8383细胞脂质相关因子表达的影响；其中，a为油红o染色结果；b为脂质相关因子的western blot检测结果；c-e分别为脂质相关因子pgc1α、cd36和lxr的相对含量统计结果；
28.图11为使用zln005激活pgc1表达的bodipy染色结果；
29.图12为zln005对矽肺小鼠的脂质代谢紊乱和纤维化的影响；其中，a为he和vg染色结果；b分别为bodipy染色、油红o染色、cd36免疫荧光和pgc1α免疫荧光染色结果；c-e分别为tc、fc和ce的含量；f为ce的比例；g为westernblot检测pgc1α、lxr、cd36、eca、coli和il-6的表达情况的结果；h-m为pgc1α、lxr、cd36、eca、coli和il-6的相对含量统计结果。
具体实施方式
30.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
31.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
32.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
33.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
34.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
35.术语说明：本发明所指的zln005，cas号为49671-76-3，结构式如下：
36.实施例1
37.1.材料和方法
38.1.1动物和样品采集
39.8周龄雄性c57bl/6j小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号：scxk(京)2019-0008]，饲养于华北理工大学动物实验中心[许可证号：syxk(冀)2020-007]，将所有小鼠饲养在特定的无病原体设施中，并在恒温(23-25℃)，湿度(40-50％)和12小时光照/黑暗循环的条件下保持。所有涉及小鼠的实验均获得华北理工大学动物实验伦理委员会的批准(伦理审批号：sk2022128)，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。
[0040]
小鼠随机分为3组(每组n＝6)，如下：(1)：对照组(c)，(2)二氧化硅组(sio2)，(3)二氧化硅加zln005组(sio2+zln005)。对照组灌注50μl生理盐水；sio2和sio2+zln005组，在气管内滴注50μl二氧化硅悬浮液(5mg/mouse，s5631，sigma-aldrich，st.louis，mo，usa)诱导矽肺病。在小鼠暴露于二氧化硅1周后，sio2+zln005组小鼠每天腹腔注射12mg/kg的zln005(14121，cayman，cayman chemical company，usa)至4周，取肺，存于-80℃。
[0041]
1.2肺组织病理学观察
[0042]
4％多聚甲醛溶液固定大鼠肺组织并包埋在石蜡中，石蜡切片，he染色观察组织病理改变，vg染色检测纤维化情况。4％多聚甲醛溶液固定大鼠肺组织，30％蔗糖脱水，oct包埋，冰冻切片，油红o染色和bodipy染色观察脂质水平。使用olympus dp80光学显微镜(olympus corporation，tokyo，japan)观察病理图像。细胞固定后进行bodipy染色观察细胞内的脂滴。使用olympus fluoview fv-1000激光扫描共聚焦显微镜(olympus corporation，tokyo，japan)观察。
[0043]
1.3免疫荧光染色(if)
[0044]
进行if染色，将肺组织石蜡切片和细胞爬片与抗cd36(中国华安生物技术公司)、抗colι(英国affinity biosciences公司)、抗il-6(中国华安生物技术公司)和抗pgc1α(美国santa cruz生物技术公司)抗体在4℃下孵育过夜。用二抗37℃孵育60min。细胞核用dapi(8961s；cell signaling technology，inc.，danvers，ma，usa)染色。
[0045]
1.4脂质组学
[0046]
将细胞中加入甲醇乙腈(1：1)提取液后超声，在-20℃放置4h，4℃，12000rpm离心20分钟，取上清，随后再4℃，12000rpm离心5分钟，取上清。
[0047]
脂质分析由waters i-classacquity uplc(waters，elstree，uk)与vion ims qtof(waters，elstree，uk)联合进行，使用beh c181.7μm色谱柱(2.1
×
100mm i)(waters，inc.)。elstree，uk)。用mse模式分析片段离子谱。流动相a由0.1％甲酸组成，流动相b由酸性乙腈和甲醇(1:1，v/v)与0.1％甲酸组成。碎片离子质谱分析采用mse模式。脂质代谢物在以下条件下用梯度洗脱分离。0-1分钟，99％-70％a；2.5-6.5min，40％-10％a；7-10分钟，0％a；柱温保持在45℃。流速为0.4ml/min。参数如下所示。ms范围，m/z 50-1000；扫描时间0.2s；公元6电动车；解吸温度500℃；源温度，120℃；解吸气体，1000l/h；锥气，50l/h；毛细管电压，2000v。锁定校准(锁定雾化器参考：质量，556.2766m/z；采样时间，0.5分钟；ce、6电动车；流速为10μl/min)。为了消除仪器误差，通过混合所有肺组织或细胞的样品来制备质量控制(qc)样品。将qc样品插入检测队列中，以监控和评估实验过程中系统的稳定性和可靠性。
[0048]
使用progenesis qi对原始的lc/ms数据进行峰识别，峰提取和反褶积计算，并利用ezinfo进行主成分分析(pca)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，结合人类代谢组数据库(hmdb)(https://hmdb.ca/)、kegg、mass bank和lipidmaps(http://lipidmaps.org)and lipidblast进行脂质的鉴定，最后使用metaboanalyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)识别与脂质差异代谢物最相关的代谢途径。
[0049]
1.5细胞培养和处理
[0050]
大鼠肺泡巨噬细胞nr8383细胞购自中国科学院上海细胞库。用体积分数为15％胎牛血清的f12k培养基培养细胞。首先根据pgc1α的表达和细胞存活率筛选zln005的刺激浓
度。此外，用浓度为50μg/ml的sio2和50μg/ml的ox-ldl处理nr8383巨噬细胞36h。在sio2和ox-ldl刺激后12h时，向培养基中加入zln005(20μm)，之后细胞孵育24h。实验设置对照组(c)、zln005组、sio2组和zln005+sio2组，其中c组：常规培养基正常培养；zln005组：终浓度为20μm的zln005刺激24h；sio2组：终浓度为50μg/ml的sio2刺激36h；zln005+sio2组：终浓度为50μg/ml的sio2刺激36h，其中在第12h时，给予终浓度为20μm的zln005治疗24h。
[0051]
1.6免疫印迹法(western blot)
[0052]
采用“hao x,jin y,zhang y,et al.inhibition ofoncogenic src ameliorates silica-induced pulmonary fibrosis via pi3k/akt pathway[j].int j mol sci,2023,24(1):774”中的方法进行westernblot检测。检测中使用的一抗包括β-actin(boster biotechnology，china)，colι(affinity biosciences，uk)，pgc1α(santa cruz biotechnology，usa)，lxr(huaan biotechnology，china)，abca1(huaan biotechnology，china)，cd36(huaan biotechnology，china)。孵育一抗后，将肺组织和细胞样品与山羊抗兔或抗小鼠二抗以1:5000的浓度孵育2小时。使用ecl显影液检测目标条带。
[0053]
1.7测量细胞中的总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯
[0054]
根据试剂盒说明书，酶标仪在500nm处测定总胆固醇(tc)、游离胆固醇(fc)水平，并计算细胞内胆固醇酯(ce)的含量以及ce的比例。ce％＝(tc-fc)/tc。
[0055]
1.8统计分析
[0056]
使用spss 21软件进行统计学分析。所有结果均以均数
±
sd表示，并且至少从3个实验中获得。使用单因素方差(anova)分析比较两组以上组的平均值，然后进行lsd检验。使用独立样本t检验比较两组样本的均值。p＜0.05被认为具有统计学意义。
[0057]
2.结果
[0058]
2.1sio2诱导巨噬细胞脂质代谢紊乱
[0059]
在本发明中，油红o染色和western blot检测sio2对nr8383细胞中脂质的影响。油红o染色结果发现sio2刺激后脂质增加(图1中a)。western blot显示pgc1α和lxr在sio2刺激组显著下调，cd36在sio2刺激组显著上调(图1中b-c)。以上提示，sio2诱导巨噬细胞发生脂质代谢紊乱。
[0060]
2.2zln005减轻了sio2诱导的脂质代谢紊乱
[0061]
为探究zln005对sio2诱导的脂质代谢紊乱的影响。首先筛选了zln005刺激细胞的浓度，western blot检测pgc1α的表达，结果发现20μm条件下pgc1α表达最高，并且没有抑制细胞的存活率(图2中a-c)。免疫荧光染色和bodipy染色结果(图2中d和e)发现，与c组相比，sio2刺激后pgc1α表达降低，脂质含量增加，zln005刺激后，与sio2组相比，pgc1α表达增加，脂质含量降低。此外，zln005也抑制了细胞中sio2诱导的tc、fc和ce的升高(图2中f-i)。western blot检测细胞中脂质相关因子的表达情况，与c组相比，sio2刺激后pgc1α、lxr和abca1表达降低，cd36表达增加，过表达zln005后，抑制了sio2刺激所导致的pgc1α、lxr和abca1的降低，cd36的增加(图2中j-n)。提示zln005减轻了sio2诱导的脂质代谢紊乱。
[0062]
2.3zln005调控sio2诱导脂质代谢紊乱的脂质代谢物学研究
[0063]
为进一步探究zln005参与改善sio2诱导脂质代谢物或代谢途径的变化，本发明对sio2组和zln005+sio2组的nr8383细胞进行了脂质代谢组学分析。两组的正负离子强度图具有相似的离子分布(图3)，表明两组的代谢组学特征具有可比性。pca结果(图4中a和图5中
a)显示sio2组和zln005+sio2组具有清晰的样品簇(正离子：r2x＝0.434，q2＝0.187，负离子：r2x＝0.307，q2＝0.181)，表明不同组别的代谢物存在差异。为进一步分析两组间的代谢差异，应用了opls-da和s-plot分析(图4中b-c、图5中b-c)，结果显示，sio2组和zln005+sio2组明显分开(正离子：r2y＝0.993，q2＝0.937，负离子：r2y＝0.989，q2＝0.886)。200次迭代的交叉排列检验(图4中d和图5中d)显示模型未出现过拟合，说明所有模型可靠。此外，与sio2组相比，zln005+sio2组得到71个脂质代谢生物标志物，其中51个差异脂质代谢物上调，20个差异脂质代谢物下调(图6-7)。基于metaboanalyst 5.0软件对这些差异代谢物进行代谢途径的分析。本发明以impact＞0.1作为最重要代谢途径的筛选条件，发现差异代谢物主要富集在甘油磷脂代谢，亚麻酸代谢，谷胱甘肽代谢和甘油脂类代谢(图8-9)。
[0064]
2.4ox-ldl诱导巨噬细胞脂质代谢紊乱
[0065]
为确定ox-ldl对nr8383细胞脂质相关因子表达的影响，本发明使用ox-ldl刺激nr8383细胞。油红o染色结果发现ox-ldl刺激后脂质增加(图10中a)。western blot显示pgc1α和lxr在ox-ldl刺激组显著下调，cd36在ox-ldl刺激组显著上调(图10中b-e)。这些结果表明ox-ldl在巨噬细胞脂质代谢中起关键作用。
[0066]
2.5zln005减轻ox-ldl诱导的巨噬细胞脂质代谢紊乱
[0067]
接下来，本发明使用zln005激活pgc1α的表达，bodipy染色结果(图11)发现，与control相比，ox-ldl刺激后脂质含量增加。zln005刺激后，与ox-ldl组相比，脂质含量降低。提示zln005减轻了ox-ldl诱导的脂质代谢紊乱。
[0068]
2.6zln005减轻矽肺小鼠的脂质代谢紊乱和纤维化
[0069]
由于观察到zln005抑制了巨噬细胞中的脂质代谢紊乱，因此本发明考虑了zln005是否可以减轻体内对二氧化硅的纤维化反应。为验证这一假设，本发明对暴露于二氧化硅的小鼠中给予zln005治疗。zln005减弱了矽肺小鼠中的纤维化。并且油红o染色和bodipy染色(图12中a-b)发现，矽肺小鼠肺组织中的脂质增加，zln005治疗后，脂质紊乱得到改善，免疫荧光和western blot观察到矽肺小鼠肺组织中pgc1α表达降低，cd36表达增加，zln005逆转了矽肺小鼠中pgc1α和cd36的表达(图12中g-m)，此外，zln005也抑制了矽肺血清中tc、fc和ce的升高(图12中c-f)。综上所述，这些数据支持zln005抑制巨噬细胞中的脂质代谢紊乱发挥抗纤维化作用。
[0070]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.zln005在制备治疗矽肺的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗矽肺是指抑制矽肺的纤维化。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述矽肺是二氧化硅诱导。4.一种治疗矽肺的药物，其特征在于，包括zln005。5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、粉剂或注射剂。7.zln005在制备改善脂质代谢紊乱的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脂质代谢紊乱是二氧化硅诱导。

技术总结
本发明公开了ZLN005在制备治疗矽肺的药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明在二氧化硅刺激的大鼠巨噬细胞和小鼠矽肺模型中给予ZLN005治疗，探究其对矽肺脂质代谢紊乱及肺纤维化的影响。结果发现二氧化硅诱导NR8383巨噬细胞中脂质代谢紊乱，ZLN005减缓了巨噬细胞和矽肺小鼠中的脂质代谢紊乱，并抑制的肺纤维化。因此，ZLN005通过减少矽肺小鼠的脂质代谢紊乱而显示出抗纤维化作用。本发明为ZLN005在矽肺纤维化中的疗效提供了实质性证据。ZLN005改善脂质代谢紊乱，抑制了SiO2诱导的纤维化，这表明ZLN005可以治疗矽肺病，抑制矽肺纤维化。矽肺纤维化。矽肺纤维化。


技术研发人员：刘和亮 何海兰 王宏丽
受保护的技术使用者：华北理工大学
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/8/31