一种鞣酸荧光探针的制备方法及其在植鞣革鉴定中的应用

1.本发明涉及分析检测领域，具体涉及一种鞣酸荧光探针的制备方法及其在植鞣革检测中的应用。


背景技术：

2.鞣酸（tannic acid，ta），也叫单宁酸，是一种存在于水果和植物中的天然多酚类化合物，由葡萄糖中心和没食子酰残基组成，广泛用于医药、食品和皮革等领域中。具有多种药理活性，如抗炎、神经保护、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等，因此被用作药物添加剂。鞣酸还是一种常用的食品添加剂，用来增加食品风味或使果汁汽水等饮料澄清。过量摄入鞣酸可能导致肝毒性作用、肝损伤、恶心、癌症和消化不良等疾病，食品添加鞣酸的安全浓度范围为6 ~ 235 μm。此外，鞣酸能与生动物皮中的胶原蛋白相互作用，使得生皮结构收敛变得更致密，从而使生动物皮转化为更耐用、可以长期保存的皮革，因此鞣酸往往被制革厂用作植物鞣剂制造植鞣革。植鞣革和金属鞣革的制造过程大不相同，金属鞣革在鞣制过程中一般只使用铬（ⅲ）、铝（ⅲ）或铁（ⅲ）等金属盐，因此大部分金属鞣革中不含鞣酸。所以通过检测皮革中是否含有鞣酸能辅助鉴别皮革的制造工艺。在开展一些珍贵的皮质艺术品、装饰品、古董和手工艺品的保护和修复工作之前，需要鉴定并区分不同种类的皮革，以针对性的选择最佳处理方法。考古也会涉及到皮革制造工艺的鉴别，古代皮革的不同制造方式储存着丰富的历史信息，与皮革技术的发展、过去的生活方式和社会文化等息息相关。所以，鞣酸的定量和定性检测具有重要意义，尤其在食品安全和皮革制造工艺鉴定方面。
3.到目前为止，已经报导了许多检测鞣酸的方法：高效液相色谱法、电化学法、分光光度法、化学发光法和荧光法等。这些方法仍然存在许多问题，如高效液相色谱法依赖大型仪器，前处理过程繁琐；电化学方法虽然可以快速的检测鞣酸，但操作过程较为复杂；其他方法还存在对鞣酸选择性不高、响应速度较慢等问题。荧光法中的有机小分子荧光探针具有灵敏度高、检出限低、选择性好、反应快、制备简单、设计策略灵活等优点。


技术实现要素：

4.发明目的：针对以上问题，本发明提供了一种基于6,7-二羟基香豆素（6,7-dihydroxycoumarin，dhc）的荧光探针dhc-fe
3+
的制备方法及其在植鞣革鉴定中的应用。dhc-fe
3+
可以用于体外快速、高选择性检测鞣酸，其制备过程简单，无需复杂的合成步骤，且优于其他基于量子点的荧光方法，具有成本低和制备简单等显著优点。dhc-fe
3+
成功应用于果汁中鞣酸的定量检测，并首次用于检测植鞣革中的鞣酸。
5.技术方案：本发明所述的一种鞣酸荧光探针dhc-fe
3+
，由中心原子fe
3+
和配体6,7-二羟基香豆素构成，其结构式为：
。
6.上述鞣酸荧光探针在植鞣革鉴定中的应用。
7.上述鞣酸荧光探针的制备方法为：将fe
3+
溶液与6,7-二羟基香豆素混合制得。
8.其中，所述制备方法中fe
3+
溶液由六水氯化铁和盐酸按摩尔质量比1:1在蒸馏水中配置而得，浓度为0.5 mol/l。
9.其中，所述制备方法中fe
3+
溶液和6,7-二羟基香豆素的混合体积比为1:49，摩尔质量比约为1:2。
10.有益效果：与现有技术相比，本发明具有的显著效果为：（1）本发明荧光探针操作简单，不需要繁琐的合成过程；（2）本发明荧光探针选择性高，只对鞣酸有响应，对抗坏血酸、氨基酸、葡萄糖、蔗糖、hpo
42-、ca
2+
、mg
2+
等均无响应；（3）灵敏度高，2 μm鞣酸即可引起荧光强度增强47倍，检测限低至7 nm；（4）响应速度快，探针可在瞬间与鞣酸反应导致荧光恢复，1 min内荧光强度即达平台期；（5）稳定性好，在hepes（20 mm, ph=7.4）溶液中保存10 min未见探针荧光大幅度变化；（6）可用于定量测试，在鞣酸0.02
–
1.9 μm浓度范围内有良好的线性；（7）由于本发明简便高效且检测结果可视化的优点，可广泛应用于果汁和植鞣革中鞣酸的检测。
附图说明
11.图1 为dhc-fe
3+
的结构及其对鞣酸的响应机理示意图。
[0012] 图2 为dhc-fe
3+
对鞣酸响应的紫外可见光谱分析。
[0013]
图3 为dhc-fe
3+
对鞣酸响应的荧光发射光谱分析。
[0014]
图4 为dhc-fe
3+
与鞣酸响应前后的稳定性分析。
[0015]
图5 为ph对dhc-fe
3+
与鞣酸响应的影响。
[0016]
图6 为dhc-fe
3+
对鞣酸的选择性分析。
[0017]
图7 为dhc-fe
3+
在468 nm处的荧光强度随鞣酸浓度变化的线性分析。
[0018]
图8 为dhc-fe
3+
对鞣酸的检测在皮革中的应用。
具体实施方式
[0019]
下面结合附图将对本发明实例中的技术方案进行清楚、完整的描述，以使本领域的技术人员能更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的
界定。
[0020]
实施例1 dhc-fe
3+
的制备及其对鞣酸的响应机理。
[0021]
本发明中dhc-fe
3+
的制备方法为：（1）将六水氯化铁和盐酸按摩尔质量比1:1在蒸馏水中混合，得到浓度为0.5 mol/l的fe
3+
溶液。2）将6,7-二羟基香豆素溶解于dmso中，浓度为10 mmol/l。（3）将0.5 mol/l的fe
3+
溶液与10 mmol/l的6,7-二羟基香豆素dmso溶液混合，体积比为1:49，得到摩尔质量比约为1:2的dhc-fe
3+
荧光探针溶液。
[0022]
本发明中荧光探针检测鞣酸的机理是由于鞣酸含有与6,7-二羟基香豆素相似的邻苯酚结构，且鞣酸对fe
3+
的亲和力高于6,7-二羟基香豆素。通过鞣酸和6,7-二羟基香豆素之间发生竞争性的配体置换，释放出游离荧光染料6,7-二羟基香豆素，使得荧光恢复，从而实现dhc-fe
3+
对鞣酸的荧光检测。
[0023]
实施例2 dhc-fe
3+
对鞣酸响应的紫外可见光谱分析。
[0024]
dhc-fe
3+
对鞣酸响应的紫外可见光谱如图2所示。dhc和dhc
‑ꢀ
fe
3+
的吸收峰分别位于390 nm和378 nm处。加入2 μm鞣酸后，含dhc
‑ꢀ
fe
3+
的溶液的吸收峰红移至380 nm，与游离dhc的最大紫外吸收峰位于390 nm不一致。但对比dhc
‑ꢀ
fe
3+
与鞣酸作用后溶液的峰（380 nm）与dhc与鞣酸作用后溶液的峰（380 nm），两者最大吸收峰的波长一致，紫外光谱形状也相似。以上说明鞣酸在hepes缓冲液中会影响游离dhc的紫外吸收光谱，使其蓝移，以及鞣酸的加入导致dhc
‑ꢀ
fe
3+
释放出了游离dhc荧光团。此外，6,7-二羟基香豆素在hepes（20 mm, ph=7.4）中的最大紫外吸收峰为375 nm，因此可用375 nm作为探针dhc-fe
3+
的荧光激发波长。
[0025]
实施例3 dhc-fe
3+
对鞣酸响应的荧光发射光谱分析。
[0026]
以375 nm激发，在hepes（20 mm, ph=7.4）中测试，观察加入2 μm鞣酸前后dhc-fe
3+
的荧光强度变化。如图3所示， dhc-fe
3+
本身几乎无荧光，加入2 μm鞣酸1min后，荧光强度升高约47倍，且荧光同时达平台期，表明dhc-fe
3+
能在hepes中对鞣酸快速灵敏地响应。图3中的图片插图为探针与鞣酸作用前（左）后（右），在365 nm紫外手提灯照射下待测溶液的荧光对比。
[0027]
实施例4 dhc-fe
3+
与鞣酸响应前后的稳定性分析。
[0028]
dhc-fe
3+
本身在hepes中的荧光强度稳定，至少10 min内荧光不恢复，表明在缓冲液中形成了稳定的配合物。当dhc-fe
3+
与鞣酸孵育后，荧光快速增强，10 min内不变（图4），表明其具有良好的稳定性。
[0029] 实施例5 ph对dhc-fe
3+
与鞣酸响应的影响。
[0030]
我们还研究了加入鞣酸前后，不同ph对dhc-fe
3+
在468 nm处荧光强度的影响（图5）。发现在ph为8~10之间，荧光响应强度相对较高，在ph 8时dhc-fe
3+
荧光强度达到最大值，在ph 7.4时其荧光强度仍可保持相对较高水平，而在ph值小于6时，荧光猝灭。以上结果说明探针dhc-fe
3+
不适用于酸性环境中鞣酸的检测，只适用于偏碱性环境。考虑到hepes常用的ph值为7.4，本研究中hepes缓冲液的ph值均控制在7.4。
[0031]
实施例6 dhc-fe
3+
对鞣酸的选择性分析。
[0032]
为了评价dhc-fe
3+
在鞣酸分析中对各种干扰物的选择性，记录了dhc-fe
3+
对鞣酸、gsh、gssg、l-glu、l-asp、l-cys、d-cys、蔗糖、葡萄糖、抗坏血酸、柠檬酸、酒石酸、hpo
42-、k
+
、mg
2+
、ca
2+
、咖啡因、没食子酸和bsa的荧光响应。如图6所示，除了鞣酸外，其他干扰物没有引
起任何可检测到的荧光变化。虽然柠檬酸（10 μm）和没食子酸（10 μm）的测试浓度小于其他干扰物（100 μm），但仍然相当于鞣酸 （2 μm）的5倍，与已有的荧光检测方法相当（表1）。
[0033]
为了进一步验证dhc-fe
3+ 检测鞣酸的实用性，将100 μm gsh、葡萄糖、蔗糖、抗坏血酸、酒石酸和hpo
42-混合在2 μm 鞣酸样品中，测量其荧光响应强度变化。图6所示的ta组表示dhc-fe
3+
与2 μm鞣酸共同孵育，mix组则表示dhc-fe
3+
与上述6种干扰物的混合物（100 μm）共同孵育。结果发现，不加鞣酸的混合物样品的荧光强度与dhc-fe
3+
几乎相同（ta组与mix组相比），意味着dhc-fe
3+
对多种干扰物质的混合物无响应。向2 μm 鞣酸额外添加上述6中干扰物的混合物后，并不会导致其荧光强度大幅增加（ta和ta+mix组对比），表示dhc-fe
3+
具有较强的抗干扰能力，可以用于复杂样品的分析。综上，dhc-fe
3+
对鞣酸的选择性高。
[0034]
实施例7 dhc-fe
3+
在468 nm处的荧光强度随鞣酸浓度变化的线性分析。
[0035]
然后考察了dhc-fe
3+
在468 nm处的荧光强度随鞣酸浓度的变化。从图7可以看出，随着鞣酸浓度的增加，荧光响应在0.02
–
1.9 μm范围内依次增强。检测限计算结果为7 nm （3σ/s, n = 11）。表1为已建立的检测鞣酸的荧光方法，其中lod表示检测限。本方法的检测限与表中所列的其他荧光方法相当。以上结果表明，dhc-fe
3+
探针可以在0.02
–
1.9 μm范围内定量检测鞣酸。
[0036]
表1
[0037]
我们将探针运用于实际果汁中的鞣酸定量检测。果汁样品为超市购买，分别为苹果汁、白葡萄汁，红葡萄汁。表2是果汁中鞣酸的加标回收率检测结果，显示鞣酸的加标回收率在97.6
–
102.1%之间，相对标准偏差在0.4
–
2.9之间，与表1 中其他荧光检测方法相当或更优，表明探针在果汁中的鞣酸检测结果高度可靠。
[0038]
表2
[0039]
实施例8 dhc-fe
3+
对鞣酸的检测在皮革中的应用。
[0040]
由于皮革中是否含有鞣酸是皮革鞣剂鉴定的重要依据之一，鉴于dhc-fe
3+
对溶液中鞣酸的检出率快、灵敏度高、稳定性好、选择性好，我们进一步将其用于植物鞣革中鞣酸的检测。如图8所示，通过将部分皮革浸泡于含有dhc-fe
3+
探针的hepes溶液中，用荧光分光光度计对溶液的荧光强度变化进行测定。其中，a表示铬鞣革，b表示铝鞣革，c表示铁鞣革，d表示植鞣革。结果显示，在2.02 mg植鞣革中，荧光强度大大增强，而在2.00 mg铬鞣皮、2.01 mg铝鞣皮中，荧光强度没有增加，在2.01 mg铁鞣皮中，荧光强度略有下降。以上的检测时间均小于1min。综上，利用dhc-fe
3+
检测皮革中是否含有鞣酸，可以快速、简便且灵敏的对植鞣革和金属鞣革进行区分，实现对植鞣革的鉴定。

技术特征：
1.一种鞣酸荧光探针，其特征在于，所述荧光探针结构式为：2.权利要求1所述的鞣酸荧光探针的制备方法，其特征在于，将fe
3+
与6,7-二羟基香豆素混合制得。3.含有权利要求1所述的化合物或其前体fe
3+
与6,7-二羟基香豆素的试剂盒。4.权利要求1所述的化合物在制备鞣酸检测试剂中的用途。

技术总结
本发明公开了一种鞣酸荧光探针及其在植鞣革鉴定中的应用，本发明荧光探针操作简单，不需要繁琐的合成过程；选择性高；灵敏度高，检测限低至7 nm；响应速度快，1 min内荧光强度即达平台期；稳定性好，在HEPSE（20 mM,PH=7.4）溶液中10 min未见探针荧光大幅度变化；可用于定量测试，在鞣酸0.02


技术研发人员：徐庆岭 唐佳丽 韩宾
受保护的技术使用者：中国科学院大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/31