白藜芦醇在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及白藜芦醇在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用。


背景技术：

2.白藜芦醇是一种重要的植物次级代谢产物，具有较好的抗肿瘤活性。近年来，很多研究发现白藜芦醇对多种恶性肿瘤均有明显的治疗效果。因此，白藜芦醇对于抗肿瘤的机制探究及其药物开发都有较大的意义。
3.在细胞的多种死亡途径中，铁死亡(ferroptosis)作为一种新兴的死亡方式，近年来越来越受到大家的关注。铁死亡是一种铁依赖性的磷脂过氧化作用驱动的细胞死亡方式，受到多种细胞代谢途径的调控，其中包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体活性和氨基酸、脂质、糖的代谢，以及各种与疾病相关的信号途径。研究发现，铁死亡可以有多种方式诱发：第一，通过消耗细胞内的谷胱甘肽诱导铁死亡；第二，靶向并灭活gpx4蛋白诱导铁死亡；第三，通过消耗胞内的gpx4和coq10蛋白诱导铁死亡；第四，通过增加长链脂肪酸或氧化铁诱导脂质过氧化反应。
4.白藜芦醇是一种广泛应用于治疗肿瘤的植物次级代谢产物，然而白藜芦醇对肿瘤细胞铁死亡的诱导调控还未见报道。铁死亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，对于肿瘤细胞的发生发展密切相关。因此，研究白藜芦醇对铁死亡的调控机制对于深入理解白藜芦醇作为抗肿瘤药物至关重要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供白藜芦醇在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用。
6.为了探究白藜芦醇(resveratrol，res)抑制乳腺癌的机制，本发明利用不同浓度的白藜芦醇处理肿瘤细胞sum159，检测其对肿瘤细胞凋亡的诱导和增殖的抑制，随后对铁死亡相关的标志物进行了检测。在本发明中，使用天然化合物res处理乳腺癌细胞系sum159，发现res显著抑制了肿瘤细胞的增殖和活力(图1和图2)，并且以浓度依赖的方式诱导肿瘤细胞的凋亡(图3)。实验发现sum159在150μm浓度处理条件下，细胞活性降低到20％，而通过凋亡途径的细胞只存活了40％，还有大约20％的细胞通过其他细胞死亡方式，其他浓度条件下也有类似结果。在随后的实验中，进一步利用铁死亡抑制剂和诱导剂联合res处理sum159，并使用了多种细胞死亡途径的抑制剂(图4)，结果显示，相对于单独使用铁死亡诱导剂(rsl3和fin56)处理组，res单独使用能够显著诱导细胞的死亡，将铁死亡诱导剂和res联合使用将进一步降低了细胞的活性，同时，这种细胞活性能够被铁死亡抑制剂(fer-1和lip-1)恢复到ctrl组的细胞水平，而res和其他途径的抑制剂联合使用只能部分恢复。通过上述实验，发明人确定res能够作为一种铁死亡诱导剂显著抑制sum159细胞活性。随后，进一步检测了铁死亡的标志物(图5)，结果显示res能够显著增加铁死亡的代谢产物mda，同时gsh显著下调，这些标志物的水平变化能够被铁死亡抑制剂恢复到ctrl组的细胞水平。进
一步通过rt-pcr和western blot检测了与铁死亡相关基因的mrna和蛋白水平(图6和图7)，rt-pcr结果显示铁死亡相关的基因(gpx4，slc7a11，acsl3，acsl4，tfr1，fth1)的mrna水平不随res浓度变化而变化，然而在蛋白水平中，只有gpx4蛋白随着res浓度的升高而逐渐降低，这些实验结果表明：res可能通过调控gpx4蛋白水平来控制sum159的铁丝亡状态，尤其是控制gpx4蛋白的稳定性。随后，通过流式细胞术检测了res处理sum159细胞后引起的ros(图8和图9)和脂质过氧化水平(图10和图11)，结构表明，res能够以浓度依赖的方式来诱导sum159细胞产生ros和脂质过氧化，结果进一步表明了res可以诱导sum159细胞产生铁死亡。紧接着，为了进一步验证res是通过gpx4来有效调控sum159细胞的铁死亡，发明人构建了gpx4敲降的sum159细胞(sum159-gpx4)及其对照细胞(sum159-v)，并通过western blot验证敲降水平(图12)，结果表明gpx4-2和gpx4-3敲降效果较好。随后在sum159-gpx4和sum159-v细胞中验证res对细胞活性和凋亡的影响(图13和图14)。cck8实验表明，res(150μm)对sum159-gpx4细胞的活性影响很小，其活性显著高于同条件处理的sum159-v细胞。凋亡实验也得到了类似的结果。随后，我们在sum159-gpx4和sum159-v细胞中通过流式细胞术检测了res处理后引起的ros(图15和图16)的变化，结果表明，在sum159-v细胞中经过res(150μm)处理后能够显著诱导ros，而在sum159-gpx4细胞中，res处理后，ros的水平变化不大。同理，在sum159-gpx4和sum159-v细胞中通过流式细胞术检测了res处理后引起的脂质过氧化(图17和图18)的变化，结果表明，在sum159-v细胞中经过res(150μm)处理后能够显著诱导脂质过氧化，而在sum159-gpx4细胞中，res处理后，脂质过氧化的水平变化不大。以上实验表明，res是通过调控gpx4蛋白的表达量来控制sum159细胞的铁死亡水平。最后，进一步探讨了res调控gpx4蛋白水平的机制，主要通过gpx4蛋白稳定性实验(图19)，结果表明，res(150μm)处理后，gpx4蛋白的稳定性显著下降了，从而促进了suml59细胞的铁死亡。因此，白藜芦醇可以作为一种铁死亡诱导剂来抑制乳腺癌的发生发展。
7.相比于现有技术研究，本发明的有益效果为：
8.(1)本发明通过白藜芦醇对乳腺癌的处理，得出能够显著诱导乳腺癌细胞的铁死亡。
9.(2)本发明利用基因编辑技术在乳腺癌sum159细胞中构建gpx4敲除的稳转细胞系。在稳转细胞系中，进一步探究白藜芦醇对肿瘤铁死亡的调控机制。
附图说明
10.图1为cck8检测res处理sum159细胞后的活性水平。
11.图2为cck8检测res处理sum159细胞48h后的活性水平柱状图分析。
12.图3为res处理sum159细胞的凋亡水平检测。
13.图4为多种死亡抑制剂处理sum159细胞后活性水平检测。
14.图5为res处理sum159细胞后铁死亡相关指标的检测。
15.图6为res处理sum159细胞前后铁死亡相关标志物的mrna检测。
16.图7为res处理sum159细胞前后铁死亡相关标志物的蛋白水平检测。
17.图8为流式细胞术检测sum159细胞处理前后ros水平。
18.图9为sum159细胞处理前后ros水平的柱状图分析。
19.图10为流式细胞术检测sum159细胞处理前后脂质过氧化水平。
20.图11为sum159细胞处理前后脂质过氧化水平的柱状图分析。
21.图12为sum159细胞gpx4基因敲除的验证。
22.图13为res处理sum159-v和sum159-gpx4细胞前后细胞活性水平的检测。
23.图14为res处理sum159-v和sum159-gpx4细胞前后细胞凋亡水平的检测。
24.图15为流式细胞术检测res处理sum159-v细胞中ros水平。
25.图16为流式细胞术检测res处理sum159-gpx4细胞中ros水平。
26.图17为流式细胞术检测res处理sum159-v细胞中脂质过氧化水平。
27.图18为流式细胞术检测res处理sum159-gpx4细胞中脂质过氧化水平。
28.图19为res处理前后gpx4蛋白的稳定性检测。
具体实施方式
29.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
30.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
31.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1
33.1、不同浓度res处理乳腺癌细胞
34.本部分实验选择的乳腺癌细胞系为sum159，具体处理过程如下。
35.1.1细胞培养及铺板
36.(1)乳腺癌细胞系sum159使用的完全培养基为含10％fbs的dmem，培养条件为37℃，5％co2。
37.(2)细胞传代。细胞密度达到80％-90％时应选择传代，传代后的细胞重新放入37℃，5％co2细胞培养箱中继续培养。
38.1.2不同浓度的白藜芦醇处理乳腺癌细胞
39.(1)接种状态较好的细胞(sum159)于6孔板中，预培养12h；
40.(2)待细胞密度达到70％，向每孔加入指定浓度的白藜芦醇(分别为0，5，10，50，100和150μm)，继续培养24h；
41.(3)分别收集蛋白和mrna，检测铁死亡相关基因的表达变化。
42.2、res处理sum159细胞前后细胞活性水平的检测
43.本部分实验利用cck-8试剂检测不同浓度的res处理乳腺癌细胞sum159前后细胞活性随时间的变化，res处理的浓度分别为0，5，10，50，100和150μm，检测时间分别选择0h、12h、24h、36h、48h。
44.3、流式细胞术检测sum159细胞处理前后细胞凋亡水平
45.野生型sum159通过不同浓度的res处理48h，然后使用annexin v-pe/7-aad apoptosis detection kit(vazyme)测定每个处理组中sum159肿瘤细胞的凋亡水平。
46.如图1和图2所示，res显著抑制了肿瘤细胞的增殖和活力；如图3所示，以浓度依赖的方式诱导肿瘤细胞的凋亡。
47.实施例2
48.多种死亡途径的抑制剂和白藜芦醇联合处理sum159细胞
49.使用不同种类的细胞死亡抑制剂分别和res联合处理野生型sum159细胞，同时也联合使用了铁死亡诱导剂rsl3和fin56和铁死亡抑制剂fer-1和lip-1。抑制剂种类：凋亡抑制剂z-vad-fmk，自噬抑制剂3-methyladenine(3-me)，焦亡抑制剂bay 11-7821(bay)。实验组设置如下：ctrl(不加药处理组)，rsl3处理组，fin56处理组，res处理组，res联合rsl3处理组，res联合fin56处理组，res联合fer-1处理组，res联合lip-1处理组，res联合z-vad-fmk处理组，res联合3-me处理组，res联合bay处理组。利用cck8试剂检测每种处理条件下的细胞活性水平。
50.如图4所示，相对于单独使用铁死亡诱导剂(rsl3和fin56)处理组，res单独使用能够显著诱导细胞的死亡，将铁死亡诱导剂和res联合使用将进一步降低了细胞的活性，同时，这种细胞活性能够被铁死亡抑制剂(fer-1和lip-1)恢复到ctrl组的细胞水平，而res和其他途径的抑制剂联合使用只能部分恢复。
51.实施例3
52.res处理前后铁死亡产物的检测
53.选取野生型sum159细胞，利用res及铁死亡抑制剂fer-1和lip-1处理，实验分组如下：ctrl(不加药处理组)，res处理组，res联合fer-1处理组，res联合lip-1处理组。利用mda和gsh检测试剂盒检测铁死亡相关产物mda和gsh在每个实验组中的水平。
54.如图5所示，res能够显著增加铁死亡的代谢产物mda，同时gsh显著下调，这些标志物的水平变化能够被铁死亡抑制剂恢复到ctrl组的细胞水平。
55.实施例4
56.1、res处理前后铁死亡相关标志物的mrna检测
57.使用不同浓度的res处理野生型sum159，处理浓度分别为0，5，10，50，100和150μm，处理24h后收集细胞。总rna由rna-easy isolation reagent制备，并通过hiscript ii q rt supermix(vazyme)逆转录为cdna，用于qpcr(aceq qpcr sybr green master mix)(vazyme)。检测的基因主要包括：gpx4，slc7a11，acsl4，acsl3，tfr1和fth1。
58.2、res处理前后铁死亡相关标志物的蛋白检测
59.使用不同浓度的res处理野生型sum159，处理浓度分别为0，5，10，50，100和150μm，处理48h后收集细胞。收集细胞并用ripa缓冲液与蛋白酶抑制剂混合液(混合比例100：1)提取蛋白。检测的蛋白主要包括：gpx4，slc7a11，acsl4，acsl3，tfr1和fth1。
60.如图6和图7所示，rt-pcr结果显示铁死亡相关的基因(gpx4，slc7a11，acsl3，acsl4，tfr1，fth1)的mrna水平不随res浓度变化而变化，然而在蛋白水平中，只有gpx4蛋白随着res浓度的升高而逐渐降低，
61.实施例5
62.1、流式细胞术检测sum159细胞处理前后ros水平检测
63.使用不同浓度的res处理野生型sum159，处理浓度分别为0，5，10，50，100和150μm，处理24h后收集细胞。利用c11-bodipy检测各组细胞内ros的水平。
64.2、流式细胞术检测sum159细胞处理前后脂质过氧化水平检测
65.使用不同浓度的res处理野生型sum159，处理浓度分别为0，5，10，50，100和150μm，处理24h后收集细胞。利用dcfh-da然后检测各组细胞内的脂质过氧化的水平。
66.如图8、图9、图10和图11所示，res能够以浓度依赖的方式来诱导sum159细胞产生ros和脂质过氧化，结果进一步表明了res可以诱导sum159细胞产生铁死亡。
67.实施例6sum159细胞gpx4基因敲除的验证
68.针对基因gpx4设计三个sgrna(sgrna1、sgrna2和sgrna3)。利用crspr cas9基因编辑技术在乳腺癌细胞sum159中敲除gpx4，构建稳转细胞系sum159-gpx4，同时构建对照细胞系sum159-v。收集细胞，利用western blot验证gpx4的敲除效果。
69.如图12所示，gpx4-2和gpx4-3敲降效果较好。
70.实施例7
71.res处理gpx4缺失的sum159细胞前后细胞活性水平的检测
72.选择上述构建的稳转细胞系sum159-gpx4和sum159-v，分别经res处理(浓度选择为0和150μm)，利用cck-8试剂检测sum159-gpx4和sum159-v细胞活性随时间的变化，检测时间分别选择0d、1d、2d、3d、4d、5d。
73.如图13和图14所示，res(150μm)对sum159-gpx4细胞的活性影响很小，其活性显著高于同条件处理的sum159-v细胞，凋亡实验也得到了类似的结果。
74.实施例8
75.1、流式细胞术检测res处理gpx4缺失的sum159细胞中ros水平
76.选择上述构建的稳转细胞系sum159-gpx4和sum159-v，分别经res处理(浓度选择为0和150μm)，处理24h后收集细胞。利用c11-bodipy检测各组细胞内ros的水平。
77.2、流式细胞术检测res处理gpx4缺失的sum159细胞中脂质过氧化水平
78.选择上述构建的稳转细胞系sum159-gpx4和sum159-v，分别经res处理(浓度选择为0和150μm)，处理24h后收集细胞。利用dcfh-da然后检测各组细胞内的脂质过氧化的水平。
79.如图15和图16所示，在sum159-v细胞中经过res(150μm)处理后能够显著诱导ros，而在sum159-gpx4细胞中，res处理后，ros的水平变化不大。如图17和图18所示，在sum159-gpx4和sum159-v细胞中通过流式细胞术检测了res处理后引起的脂质过氧化的变化，结果表明，在sum159-v细胞中经过res(150μm)处理后能够显著诱导脂质过氧化，而在sum159-gpx4细胞中，res处理后，脂质过氧化的水平变化不大。
80.实施例9
81.res处理前后gpx4蛋白的稳定性检测
82.选择野生型乳腺癌细胞sum159，处理浓度分别为0和150μm，然后分别用chx和mg132处理sum159，处理时间为0h，2h，4h，8h，对应的实验组别为res 0μm(chx 0h,mg132 0h)；res 0μm(chx 2h,mg132 0h)；res 0μm(chx 4h,mg132 0h)；res 0μm(chx 8h,mg132 0h)；res 0μm(chx 2h,mg132 2h)；res 0μm(chx 4h,mg1324h)；res 0μm(chx 8h,mg132 8h)；res 150μm(chx 0h,mg132 0h)；res 150μm(chx 2h,mg132 0h)；res 150μm(chx 4h,mg132 0h)；res 150μm(chx 8h,mg1320h)；res 150μm(chx 2h,mg132 2h)；res 150μm(chx 4h,mg132 4h)；res 150μm(chx 8h,mg132 8h)。收集每组的细胞，提取蛋白，利用western blot检测gpx4的蛋白水平。
83.如图19所示，res(150μm)处理后，gpx4蛋白的稳定性显著下降了，从而促进了suml59细胞的铁死亡。

技术特征：
1.白藜芦醇在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。

技术总结
本发明公开了白藜芦醇在制备肿瘤细胞铁死亡诱导剂中的应用。本发明经实验发现，白藜芦醇不仅能够直接细胞凋亡途径来抑制肿瘤细胞的生长，而且能够通过诱导铁死亡的功能来提高抗肿瘤免疫治疗效果。因此，利用白藜芦醇制备抗抗肿瘤药物，预期将有较好的应用前景。预期将有较好的应用前景。预期将有较好的应用前景。


技术研发人员：张二浩
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2023.06.13
技术公布日：2023/8/31