新型昆虫抑制蛋白的制作方法

新型昆虫抑制蛋白
相关申请的引用
1.本技术要求2020年12月23日提交的美国临时申请号63/130,385的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。序列表的并入
2.名为“mons485wo-sequence_listing.txt”的文件包含计算机可读形式的序列表并且创建于2021年12月9日。该文件是338千字节(在中测量)，通过电子提交(使用美国专利局efs-web提交系统)与本技术同时提交，并以引用的方式整体并入本文。
技术领域
3.本发明一般涉及昆虫抑制蛋白领域。公开了一类新型蛋白质，其对作物植物和种子的农业相关害虫，特别是鳞翅目物种的昆虫植物害虫表现出昆虫抑制活性。提供了植物、植物部分、种子、包括植物细胞以及细菌细胞的细胞，以及载体，其各自分别包含重组多核苷酸构建体，所述构建体包含可操作地连接的异源启动子和编码一种或多种所公开的毒素蛋白的多核苷酸区段。


背景技术：

4.提高包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、芥花(canola)、蔬菜和棉花等在内的具有重要农业意义的植物的作物产量已变得越来越重要。除了越来越多地需要农产品来为不断增长的人口提供食物、衣服和能量以外，预计气候相关影响和由不断增长的人口造成的使用农业实践以外的土地的压力也会减少农业可用耕地的量。这些因素导致对粮食安全的严峻预测，特别是在植物生物技术和农艺实践没有重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续的改进是在有限量的农业可用耕地上扩大作物生产的重要工具。
5.昆虫，特别是鳞翅目昆虫，被认为是损害大田作物，从而降低受侵袭地区的作物产量的主要原因。对农业造成不利影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于黑粘虫(考斯夜蛾(spodoptera cosmioides))、小地老虎(球菜夜蛾(agrotis ipsilon))、玉米穗虫(谷实夜蛾(helicoverpa zea))、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾(alabama argillacea))、菱纹背蛾(小菜蛾(plutella xylostella))、欧洲玉米螟(玉米螟(ostrinia nubilalis))、秋粘虫(草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))、cry1fa1抗性秋粘虫(草地贪夜蛾)、旧世界棉铃虫(owb，棉铃实夜蛾(helicoverpa armigera))、南部粘虫(南部灰翅夜蛾(spodoptera eridania))、大豆尺蠖(大豆夜蛾(chrysodeixis includens))、斑点棉铃虫(翠纹钻夜蛾(earias vittella))、西南玉米螟(西南玉米杆草螟(diatraea grandiosella))、甘蔗螟(小蔗螟(diatraea saccharalis))、向日葵尺蠖(两色髯须夜蛾(rachiplusia nu))、烟草蚜虫(烟芽夜蛾(heliothis virescens))、烟草切根虫(斜纹夜蛾(spodoptera litura)，也称为丛毛虫(cluster caterpillar))、西部豆切根虫(西部豆夜蛾(striacosta albicosta))以及黧豆毛虫(黎豆夜蛾(anticarsia gemmatalis))。
6.历史上，依赖合成化学杀昆虫剂的密集应用作为农业中的害虫防治剂。除了出现的抗性问题之外，对环境和人类健康的担忧也激发了生物杀虫剂的研究和开发。这项研究工作导致逐步发现和使用包括细菌在内的各种昆虫病原性微生物物种。
7.当昆虫病原性细菌，尤其是属于芽孢杆菌属的细菌的潜力被发现并开发为生物害虫防治剂时，生物防治模式发生了转变。细菌苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)的菌株已被用作杀虫蛋白的来源，这是因为发现bt菌株对特定昆虫表现出高毒性。已知bt菌株产生δ-内毒素，其在孢子形成开始时和静止生长期期间位于伴孢结晶包涵体内(例如，cry蛋白)，并且还已知其产生分泌性杀昆虫蛋白。在被易感昆虫摄食后，δ-内毒素以及分泌性毒素在中肠上皮细胞的表面发挥其作用，破坏细胞膜，导致细胞破坏和死亡。编码杀昆虫蛋白的基因还已在除bt以外的细菌物种中鉴定出来，包括其他芽孢杆菌属和多种另外的细菌物种，诸如侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)、球形赖氨酸芽孢杆菌(lysinibacillus sphaericus)(“ls”，以前称为球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus))、日本甲虫类芽孢杆菌(paenibacillus popilliae)和缓病类芽孢杆菌(paenibacillus lentimorbus)。此外，还已从多种非细菌来源(包括蕨类植物、蛛形纲动物毒液)中鉴定出杀昆虫毒素，并且在害虫的饮食中递送靶向阻遏必需基因的dsrna已被确定为有效的害虫管理策略。
8.结晶和分泌的可溶性杀昆虫毒素对其宿主具有高度特异性，并已作为化学杀昆虫剂的替代物获得全球范围内的认可。例如，杀昆虫毒素蛋白已被用于各种农业应用中，以保护农业上重要的植物免受昆虫侵袭，减少对化学杀虫剂应用的需要，并提高产量。杀昆虫毒素蛋白用于通过机械方法，诸如喷洒以将包含各种细菌菌株的微生物制剂分散到植物表面上，以及通过使用遗传转化技术产生表达一种或多种杀昆虫毒素蛋白的转基因植物和种子来防治作物植物的农业相关害虫。
9.表达杀昆虫毒素蛋白的转基因植物的使用已经在全球范围内适用。例如，2016年，2310万公顷种植了表达bt毒素的转基因作物并且7540万公顷种植了表达bt毒素叠加有除草剂抗性性状的转基因作物(isaaa.2016.global status of commercialized biotech/gm crops:2016.isaaa简报第52号.isaaa:ithaca,ny)。转基因防昆虫作物的全球使用以及这些作物中使用的有限数目的杀昆虫毒素蛋白已经对赋予对目前使用的杀昆虫蛋白的抗性的现有昆虫等位基因产生了选择压力。
10.目标害虫对杀昆虫毒素蛋白的抗性的发展产生了对发现和开发新形式的杀昆虫毒素蛋白的持续需要，所述新形式的杀昆虫毒素蛋白可用于管理昆虫对表达杀昆虫毒素蛋白的转基因作物的抗性的增加。具有改善的功效并表现出对更广谱的易感昆虫物种的防治的新蛋白毒素将减少可发展抗性等位基因的存活昆虫的数量。此外，在一种植物中使用对同一害虫有毒并表现出不同作用方式或者两种或更多种不同的毒性作用方式的两种或更多种转基因杀昆虫毒素蛋白(例如，与编码肽或蛋白毒素的转基因相结合的编码靶向阻遏必需基因的dsrna的转基因，两者都对同一昆虫物种有毒)降低了任何单一目标昆虫物种中的抗性的可能性。此外，使用自限性技术，诸如oxitec ltd提供的那些，当与本发明的蛋白质一起使用时，应改善被赋予表达本发明的蛋白质的转基因作物的性状的持久性(zhou等人2018,evol appl 11(5):727-738；alphey等人,2009,journal of economic entomology,102:717-732)。
11.因此，发明人在本文公开了一种来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白，以及工程化的变体蛋白和示例性的重组蛋白，所述蛋白各自对目标鳞翅目物种，特别是对黑粘虫(考斯夜蛾)、小地老虎(球菜夜蛾)、玉米穗虫(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(玉米螟)、南美豆荚虫(大豆荚虫(helicoverpa gelotopoeon))、南部粘虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和黧豆毛虫(黎豆夜蛾)表现出杀昆虫活性。


技术实现要素：

12.本文公开了一种新型杀虫蛋白tic4064和具有昆虫抑制活性的其工程化变体，已显示它们对作物植物的一种或多种害虫表现出抑制活性。tic4064蛋白和tic4064蛋白毒素类别中的变体蛋白可单独或与其他杀昆虫蛋白和毒性剂组合用于制剂和植物中，从而提供目前在农业系统中使用的杀昆虫蛋白和杀昆虫剂化学物质的替代物。
13.在一个实施方案中，本技术公开了一种重组核酸分子，其包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中杀虫蛋白包含seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52的氨基酸序列；或杀虫蛋白包含与如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或99.5％或约100％同一性的氨基酸序列；或所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有如seq id no:7、seq id no:9、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49或seq id no:51所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交。重组核酸分子可包含起到在植物中表达杀虫蛋白的作用的序列，并且当其在植物细胞中表达时，产生杀虫有效量的杀虫蛋白或其杀虫片段。
14.在本技术的另一个实施方案中，重组核酸分子存在于细菌或植物宿主细胞内。所设想的细菌宿主细胞包括至少农杆菌属(agrobacterium)、根瘤菌属(rhizobium)、芽孢杆菌属(bacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、埃希氏菌属(escherichia)、假单胞菌属(pseudomonas)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、泛菌属(pantoea)和欧文氏菌属(erwinia)。在某些实施方案中，芽孢杆菌属物种是蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌，短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)，或埃希氏菌属是大肠杆菌(escherichia coli)。所设想的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。所设想的植物细胞还包括紫花苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔(例如，芥
花)、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(即玉蜀黍，诸如甜玉米或饲料玉米)、三叶草、棉花(棉花属(gossypium)物种)、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、蛇麻子、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦(squash)、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、枫香、甘薯、柳枝稷、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
15.在另一个实施方案中，杀虫蛋白表现出针对鳞翅目昆虫的活性，所述鳞翅目昆虫包括至少黑粘虫(考斯夜蛾)、小地老虎(球菜夜蛾)、玉米穗虫(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(玉米螟)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部粘虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、向日葵尺蠖(两色髯须夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和黧豆毛虫(黎豆夜蛾)。
16.本技术还设想了包含重组核酸分子的植物或植物部分，所述重组核酸分子编码tic4064蛋白毒素类别的杀虫蛋白或其片段。设想了双子叶植物和单子叶植物。在另一个实施方案中，植物进一步选自由以下组成的组：紫花苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔(例如，芥花)、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(即玉蜀黍，诸如甜玉米或饲料玉米)、三叶草、棉花(例如陆地棉(g.hirsutum)、海岛棉(g.barbadense))、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、蛇麻子、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、枫香、甘薯、柳枝稷、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。
17.在某些实施方案中，公开了包含重组核酸分子的种子。
18.在另一个实施方案中，设想了包含本技术中公开的重组核酸分子的昆虫抑制组合物。昆虫抑制组合物还可包含编码不同于所述杀虫蛋白的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。在某些实施方案中，至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsrna分子和辅助蛋白。还设想了昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。在一个实施方案中，昆虫抑制组合物中的至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：cry1a、cry1ab、cry1ac、cry1a.105、cry1ae、cry1b、cry1c、cry1c变体、cry1d、cry1e、cry1f、cry1a/f嵌合体、cry1g、cry1h、cry1i、cry1j、cry1k、cry1l、cry2a、cry2ab、cry2ae、cry3、cry3a变体、cry3b、cry4b、cry6、cry7、cry8、cry9、cry15、cry34、cry35、cry43a、cry43b、cry51aa1、et29、et33、et34、et35、et66、et70、tic400、tic407、tic417、tic431、tic800、tic807、tic834、tic853、tic900、tic901、tic1201、tic1415、tic2160、tic3131、tic4029、tic836、tic860、tic867、tic869、tic1100、vip3a、vip3b、vip3ab、axmi-88、axmi-97、axmi-102、axmi-112、axmi-117、axmi-100、axmi-115、axmi-113、axmi-005、axmi134、axmi-150、axmi-171、axmi-184、axmi-196、axmi-204、axmi-207、axmi-209、axmi-205、axmi-218、axmi-220、axmi-221z、axmi-222z、axmi-223z、axmi-224z和axmi-225z、axmi-238、axmi-270、axmi-279、axmi-345、axmi-335、axmi-r1及其变体、ip3及其变体、dig-3、dig-5、dig-10、dig-657、dig-11蛋白、idp102aa及
其同源物、idp110aa及其同源物、tic868、cry1da1_7、bcw003、tic1100、tic867、tic867_23、tic4029、tic6757、tic7941、idp072aa、tic5290、tic3668、tic3669、tic3670、idp103及其同源物、pip-50和pip-65及其同源物、pip-83及其同源物以及cry1b.34。
19.还设想了包含可检测量的本技术中公开的重组核酸分子和毒素蛋白的商品产品。此类商品产品包括由谷物处理者装袋的商品玉米、玉米片、玉米饼、玉米粉、玉米粕、玉米糖浆、玉米油、玉米青贮、玉米淀粉、玉米谷物等，以及对应的大豆、水稻、小麦、高粱、木豆、花生、水果、瓜类和蔬菜商品产品，在适用时包括果汁、浓缩物、果酱、果冻、酱和含有可检测量的本技术的所述多核苷酸和或多肽的所述商品产品的其他可食用形式、完整或经加工的棉籽、棉油、棉绒、经加工用于饲料或食品的种子和植物部分、纤维、纸、生物质和燃料产品诸如来源于棉油的燃料或来源于轧棉机废弃物的粒料、完整或经加工的大豆种子、大豆油、大豆蛋白、大豆粕、大豆粉、大豆片、大豆麸皮、大豆浆、大豆干酪、大豆酒、包含大豆的动物饲料、包含大豆的纸、包含大豆的奶油、大豆生物质和使用大豆植物和大豆植物部分生产的燃料产品。
20.本技术还设想了一种产生包含重组核酸分子和来自tic4064蛋白毒素类别的毒素蛋白的种子的方法。所述方法包括种植至少一个包含本技术中公开的重组核酸分子的种子；由种子生长出植物；以及从植物收获种子，其中所收获的种子包含所提及的重组核酸分子。
21.在另一个例示性实施方案中，提供了一种抗鳞翅目昆虫侵袭的植物，其中所述植物的细胞包含本文公开的重组核酸分子。
22.本技术还公开了用于防治鳞翅目物种害虫和防治植物(特别是作物植物)的鳞翅目物种害虫侵袭的方法。在一个实施方案中，所述方法包括首先使害虫与杀昆虫有效量的如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或seq id no:32所示的杀虫蛋白接触；或使害虫与杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白接触，所述杀虫蛋白包含与如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或seq id no:32所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或99.5％或约100％同一性的氨基酸序列。
23.本文还提供了一种检测tic4064类别的重组核酸分子的存在的方法，其中所述方法包括使核酸的样品与核酸探针接触，所述核酸探针在严格杂交条件下与来自包含编码本文所提供的杀虫蛋白或其片段的多核苷酸区段的植物的基因组dna杂交，并且在此类杂交条件下不与来自不包含所述区段的其他等基因植物的基因组dna杂交，其中探针与seq id no:7、seq id no:9、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31，或编码包含与如seq id no:7、seq id no:9、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或99.5％或约100％同一性的氨基酸序列
的杀虫蛋白的序列同源或互补；使样品和探针经受严格杂交条件；以及检测探针与样品的dna的杂交。在一些实施方案中，检测tic4064毒素蛋白类别的成员的存在的步骤可包括elisa或蛋白质印迹。
24.本文还提供了检测来自tic4064类别的杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述方法包括使怀疑含有tic4064类别毒素蛋白的样品和与tic4064类别蛋白毒素具有特异性免疫反应性的抗体接触；以及检测抗体与tic4064类别蛋白的结合，从而确认所述蛋白的存在。在一些实施方案中，检测步骤包括elisa或蛋白质印迹。抗体的制备完全在植物分子生物学领域的普通技术人员的技能范围内。
25.本技术还设想了一种用于防治田间的鳞翅目害虫物种或害虫侵袭的方法，其中所述方法包括种植表达杀昆虫有效量的杀虫蛋白的作物植物，所述杀虫蛋白具有如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或seq id no:32所示的氨基酸序列；或种植表达杀昆虫有效量的一种或多种杀虫蛋白的作物植物，所述杀虫蛋白包含与如seq id no:7、seq id no:9、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或99.5％或约100％同一性的氨基酸序列；以及将一种或多种各自携带自限性基因的转基因鳞翅目害虫物种释放到具有含有编码本发明的毒素蛋白的基因的作物的田间，以用于防止或延迟一种或多种鳞翅目害虫物种对毒素蛋白产生抗性。在一个实施方案中，作物植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在另一个实施方案中，单子叶作物植物可以是玉米、小麦、高粱、水稻、黑麦或小米。在另一个实施方案中，双子叶作物植物可以是大豆、棉花或芥花。序列简述
26.seq id no:1是编码获自苏云金芽孢杆菌物种eg9820的tic4064杀虫蛋白的核酸序列。
27.seq id no:2是tic4064杀虫蛋白的氨基酸序列。
28.seq id no:3是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_1杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始。
29.seq id no:4是tic4064_1的氨基酸序列。
30.seq id no:5是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_2杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始。tic4064_2是tic4064_1的截短物，其中编码tic4064_1的原毒素结构域的序列已缺失。
31.seq id no:6是tic4064_2的氨基酸序列。
32.seq id no:7是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_3杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子紧跟在起始甲硫氨酸密码子之后插入并且密码子已改变以相对于tic4064_1引入氨基酸变化s95t。
33.seq id no:8是tic4064_3的氨基酸序列。
34.seq id no:9是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_4杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始；并
且密码子已改变以相对于tic4064_1中的所述位置引入氨基酸变化s95t。tic4064_4是tic4064_3的截短物，其中编码tic4064_3的原毒素结构域的编码序列已缺失。
35.seq id no:10是tic4064_4的氨基酸序列。
36.seq id no:11是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_5杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的所述位置引入氨基酸变化g88k。
37.seq id no:12是tic4064_5的氨基酸序列。
38.seq id no:13是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_6杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的所述位置引入氨基酸变化g88k。tic4064_6是tic4064_5的截短物，其中编码tic4064_5的原毒素结构域的编码序列已缺失。
39.seq id no:14是tic4064_6的氨基酸序列。
40.seq id no:15是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_12_1杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化d85a、s95t、a511h、n513d和r605n。
41.seq id no:16是tic4064_12_1的氨基酸序列。
42.seq id no:17是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_12_2杀虫蛋白的合成编码序列，其中另外的丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化d85a和s95t。
43.seq id no:18是tic4064_12_2的氨基酸序列。
44.seq id no:19是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_13杀虫蛋白的合成编码序列，其中另外的丙氨酸密码子紧跟在起始甲硫氨酸密码子之后插入并且密码子已改变以相对于tic4064_1引入氨基酸变化d85a、s95t、a511h、n513d和r605n。tic4064_13是tic4064_12_1的截短物，其中编码tic4064_12_1的原毒素结构域的编码序列已缺失。
45.seq id no:20是tic4064_13的氨基酸序列。
46.seq id no:21是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_14杀虫蛋白的合成编码序列，其中另外的丙氨酸密码子紧跟在起始甲硫氨酸密码子之后插入并且密码子已改变以相对于tic4064_1引入氨基酸变化s95t、r169k和s332a。
47.seq id no:22是tic4064_14的氨基酸序列。
48.seq id no:23是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_15杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化s95t、r169k和s332a。tic4064_15是tic4064_14的截短物，其中编码tic4064_14的原毒素结构域的编码序列已缺失。
49.seq id no:24是tic4064_15的氨基酸序列。
50.seq id no:25是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_16杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，
并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化s34g、g88k、i386s、g403q和r605n。
51.seq id no:26是tic4064_16的氨基酸序列。
52.seq id no:27是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_17杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化s34g、g88k、i386s、g403q和r605n。tic4064_17是tic4064_16的截短物，其中编码tic4064_16的原毒素结构域的编码序列已缺失。
53.seq id no:28是tic4064_17的氨基酸序列。
54.seq id no:29是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_18杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化g88k、w371l、h555n和r586q。
55.seq id no:30是tic4064_18的氨基酸序列。
56.seq id no:31是编码被设计用于在植物细胞中表达的tic4064_19杀虫蛋白的合成编码序列，其中丙氨酸密码子作为第二密码子插入开放阅读框中，其从位置编号1开始，并且密码子已改变以相对于tic4064_1中的那些位置引入氨基酸变化g88k、w371l、h555n和r586q。tic4064_19是tic4064_18的截短物，其中编码tic4064_18的原毒素结构域的编码序列已缺失。
57.seq id no:32是tic4064_19的氨基酸序列。
58.seq id no:33是编码tic4064_20杀虫蛋白的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化s94t、d84a、a510h、n512d和d608a。
59.seq id no:34是tic4064_20的氨基酸序列。
60.seq id no:35是编码tic4064_21的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化s94t、r168k和s331a。
61.seq id no:36是tic4064_21的氨基酸序列。
62.seq id no:37是编码tic4064_22的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化s33g和s94t。
63.seq id no:38是tic4064_22的氨基酸序列。
64.seq id no:39是编码tic4064_23的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化s94t、e153d、q436i和s596q。
65.seq id no:40是tic4064_23的氨基酸序列。
66.seq id no:41是编码tic4064_24的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化g87k、w370l、h554n和r585q。
67.seq id no:42是tic4064_24的氨基酸序列。
68.seq id no:43是编码tic4064_25的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化s33g、g87k、i385s、g402q和r604n。
69.seq id no:44是tic4064_25的氨基酸序列。
70.seq id no:45是编码tic4064_26的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对
于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化g87k、f199y、v325a、s331a和q631t。
71.seq id no:46是tic4064_26的氨基酸序列。
72.seq id no:47是编码tic4064_27的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的那些位置引入氨基酸变化g87s、i308c、v325a、s331a和q631t。
73.seq id no:48是tic4064_27的氨基酸序列。
74.seq id no:49是编码tic4064_10的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的所述位置引入氨基酸变化s94t。
75.seq id no:50是tic4064_10的氨基酸序列。
76.seq id no:51是编码tic4064_11的合成细菌编码序列，其中密码子已改变以相对于tic4064中的所述位置引入氨基酸变化g87k。
77.seq id no:52是tic4064_11的氨基酸序列。
具体实施方式
78.农业害虫防治领域的一个问题可以表征为需要新的毒素蛋白，所述蛋白对目标害虫有效，对目标害虫物种表现出广谱毒性，能够在植物中表达而不引起不希望的农艺问题，并且与在植物上或植物中商业使用的当前毒素相比提供替代作用方式。
79.以tic4064和工程化的氨基酸序列变体为例的新型杀虫蛋白在本文中公开并解决了本领域中的这些问题中的每一个，特别是抗作物植物的广谱鳞翅目害虫，并且例如抗黑粘虫(考斯夜蛾)、小地老虎(球菜夜蛾)、玉米穗虫(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(玉米螟)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部粘虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、向日葵尺蠖(两色髯须夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和黧豆毛虫(黎豆夜蛾)。
80.本技术中对作为基本上可互换的术语的tic4064、“tic4064蛋白”、“tic4064蛋白毒素”、“tic4064杀虫蛋白”、“tic4064相关毒素”、“tic4064相关毒素”、“tic4064类别”、“tic4064蛋白毒素类别”、“tic4064毒素蛋白类别”等的提及是指任何新型杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白，其包含以下、由其组成、与其基本上同源、与其类似或衍生自：tic4064(seq id no:2)的任何杀虫蛋白或昆虫抑制蛋白序列，以及氨基酸序列变体tic4064毒素蛋白、tic4064_1(seq id no:4)、tic4064_2(seq id no:6)、tic4064_3(seq id no:8)、tic4064_4(seq id no:10)、tic4064_5(seq id no:12)、tic4064_6(seq id no:14)、tic4064_12_1(seq id no:16)、tic4064_12_2(seq id no:18)、tic4064_13(seq id no:20)、tic4064_14(seq id no:22)、tic4064_15(seq id no:24)、tic4064_16(seq id no:26)、tic4064_17(seq id no:28)、tic4064_18(seq id no:30)、tic4064_19(seq id no:32)、tic4064_20(seq id no:34)、tic4064_21(seq id no:36)、tic4064_22(seq id no:38)、tic4064_23(seq id no:40)、tic4064_24(seq id no:42)、tic4064_25(seq id no:44)、tic4064_26(seq id no:46)、tic4064_27(seq id no:48)、tic4064_11(seq id no:50)和tic4064_11(seq id no:52)以及杀虫或昆虫抑制区段，或其组合，它们赋予针对鳞翅目害虫的活性，包括表现出杀虫或昆虫抑制活性的任何蛋白质，如果这种蛋白质与tic4064的比对得到从约98％至约100％百分比的任何分数百分比的氨基酸序列同一性。tic4064蛋白包括所述蛋白质的质体靶向和非质体靶向形式。
81.术语“区段”或“片段”在本技术中用于描述比描述tic4064或tic4064变体蛋白的
完整氨基酸或核酸序列或编码此类氨基酸序列的相应核苷酸序列短的连续氨基酸或核酸序列。本技术中还公开了表现出昆虫抑制活性的区段或片段，如果所述区段或片段与如seq id no:2所示的tic4064蛋白、如seq id no:4所示的tic4064_1蛋白、如seq id no:6所示的tic4064_2蛋白、如seq id no:8所示的tic4064_3蛋白、如seq id no:10所示的tic4064_4蛋白、如seq id no:12所示的tic4064_5蛋白、如seq id no:14所示的tic4064_6蛋白、如seq id no:16所示的tic4064_12_1蛋白、如seq id no:18所示的tic4064_12_2蛋白、如seq id no:20所示的tic4064_13蛋白、如seq id no:22所示的tic4064_14蛋白、如seq id no:24所示的tic4064_15蛋白、如seq id no:26所示的tic4064_16蛋白、如seq id no:28所示的tic4064_17蛋白、如seq id no:30所示的tic4064_18蛋白、如seq id no:32所示的tic4064_19蛋白、如seq id no:34所示的tic4064_20蛋白、如seq id no:36所示的tic4064_21蛋白、如seq id no:38所示的tic4064_22蛋白、如seq id no:40所示的tic4064_23蛋白、如seq id no:42所示的tic4064_24蛋白、如seq id no:44所示的tic4064_25蛋白、如seq id no:46所示的tic4064_26蛋白、如seq id no:48所示的tic4064_27蛋白、如seq id no:50所示的tic4064_10蛋白或如seq id no:52所示的tic4064_11蛋白的对应部分的比对在所述区段或片段与tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白内的氨基酸的对应区段之间得到从约85％至约100％的任何分数百分比的氨基酸序列同一性。如本文所述的片段可包含至少50个、至少100个、至少250个、至少400个、至少500个、至少600个、至少800个或至少1000个tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白的连续氨基酸残基。如本文所述的片段可表现出tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白中的任一者的杀虫活性。
82.在本技术中对术语“活性的”或“活性”、“杀虫活性(pesticidal activity)”或“杀虫”或“杀昆虫活性(insecticidal activity)”、“昆虫抑制”、“杀虫有效”或“杀昆虫”的提及是指毒性剂诸如含有有效量的tic4064毒素蛋白类别蛋白的蛋白质毒素抑制(抑制生长、摄食、繁殖力或生存能力)、阻遏(阻遏生长、摄食、繁殖力或生存能力)、防治(防治害虫侵袭、防治害虫对特定作物的摄食活动)或杀死(导致其发病、死亡或繁殖力降低)害虫的功效。这些术语旨在包括向害虫提供杀虫有效量的毒性蛋白的结果，其中害虫暴露于毒性蛋白导致发病、死亡、繁殖力降低或发育迟缓。这些术语还包括由于在植物中或植物上提供杀虫有效量的毒性蛋白而从植物、植物组织、植物部分、种子、植物细胞或植物可能生长的特定地理位置驱除害虫。通常，杀虫活性是指毒性蛋白有效抑制生长、发育、生存能力、摄食行为、交配行为、繁殖力或由昆虫摄食引起的不利影响的任何可测量降低的能力。毒性蛋白可由植物产生或可应用于植物或应用于植物所在位置内的环境。术语“生物活性”、“有效”、“有效的”或其变型也是在本技术中可互换使用的术语，以描述本发明的蛋白质对目标害虫的作用。
83.当在目标害虫的饮食中提供时，杀虫有效量的毒性剂在毒性剂接触害虫时表现出杀虫活性。毒性剂可以是杀虫蛋白或本领域已知的一种或多种化学剂。杀虫或杀昆虫化学剂可单独使用或彼此组合使用。化学剂包括但不限于靶向特定基因以用于阻遏目标害虫的dsrna分子、有机氯化物、有机磷酸酯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、新烟碱类和瑞诺烷类(ryanoids)。杀虫或杀昆虫蛋白剂包括本技术所述的蛋白毒素，以及其他蛋白质毒性剂，包括靶向鳞翅目昆虫的那些，以及用于防治其他植物害虫的蛋白毒素，诸如用于防治鞘翅目、
半翅目和同翅目物种的本领域可获得的cry、vip和cyt蛋白。
84.预期对害虫，特别是作物植物的害虫的提及是指作物植物的被tic4064蛋白毒素类别防治的害虫，特别是那些鳞翅目害虫。然而，当靶向这些害虫的毒性剂与tic4064蛋白或氨基酸序列变体tic4064蛋白或者与tic4064蛋白或氨基酸序列变体tic4064蛋白具有85％至约100％同一性的蛋白质共定位或一起存在时，对害虫的提及也可包括植物的鞘翅目、半翅目和同翅目害虫，以及线虫和真菌。短语“一起存在”和“共定位”旨在包括其中目标害虫已被tic4064蛋白毒素类别以及相对于目标害虫也以杀虫有效量存在的任何其他毒性剂接触的任何情况。“接触”旨在指存在于目标害虫的饮食中，并且该饮食至少部分地被目标害虫消耗或摄食，其量足以向目标害虫递送杀虫有效量的毒性剂和tic4064类别毒素蛋白。
85.tic4064蛋白或氨基酸序列变体tic4064蛋白通过共同功能相关并且对来自鳞翅目昆虫物种的害虫(包括成虫、蛹、幼虫和新生虫)表现出杀昆虫活性。
86.鳞翅目的昆虫包括但不限于夜蛾科(noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和棉铃虫(heliothines)，例如秋粘虫(草地贪夜蛾)、甜菜粘虫(甜菜夜蛾(spodoptera exigua))、黑粘虫(考斯夜蛾)、南部粘虫(南部灰翅夜蛾)、贝莎粘虫(bertha armyworm)(蓓带夜蛾(mamestra configurata))、小地老虎(球菜夜蛾)、卷心菜尺蠖(cabbage looper)(粉纹夜蛾(trichoplusia ni))、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(两色髯须夜蛾)、黧豆毛虫(黎豆夜蛾)、苜蓿绿夜蛾(green cloverworm)(绿夜蛾(hypena scabra))、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、颗粒切根虫(granulate cutworm)(粒肤地老虎(agrotis subterranea))、粘虫(一星粘虫(pseudaletia unipuncta))、向日葵尺蠖(两色髯须夜蛾)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、西部切根虫(western cutworm)(西部灰地老虎(agrotis orthogonia))；螟蛾科的蛀虫(borer)、鞘蛾(casebearer)、结网虫(webworm)、锥虫(coneworm)、菜青虫(cabbageworm)和食叶虫(skeletonizer)，例如，欧洲玉米螟(玉米螟)、脐橙虫(navel orange worm)(脐橙螟(amyelois transitella))、玉米根结网虫(corn root webworm)(玉米根草螟(crambus caliginosellus))、草地结网虫(sod webworm)(水稻切叶野螟(herpetogramma licarsisalis))、向日葵螟(sunflower moth)(向日葵同斑螟(homoeosoma electellum))、小玉米茎蛀虫(南美玉米苗斑螟(elasmopalpus lignosellus))；卷蛾科(tortricidae)的卷叶虫(leafroller)、蚜虫(budworm)、种子蠕虫(seed worms)和果实蠕虫(fruit worm)，例如，苹果蠹蛾(codling moth)(苹果小卷蛾(cydia pomonella))、葡萄小卷夜蛾(grape berry moth)(葡萄浆果蛾(endopiza viteana))、梨小食心虫(oriental fruit moth)(东方果蛾(grapholita molesta))、向日葵芽蛾(sunflower bud moth)(向日葵芽卷叶蛾(suleima helianthana))；以及许多其他在经济上重要的鳞翅目，例如，菱纹背蛾(小菜蛾)、棉红铃虫(红铃麦蛾(pectinophora gossypiella))和吉普赛飞蛾(gypsy moth)(舞毒蛾(lymantria dispar))。鳞翅目的其他害虫包括，例如，棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、果树卷夜虫(fruit tree leaf roller)(果树黄卷蛾(archips argyrospila))、欧洲卷叶虫(european leafroller)(玫瑰黄卷蛾(archips rosana))和其他黄卷蛾属物种(二化螟(chilo suppressalis)、亚洲稻螟(asiatic rice borer)或水稻二化螟(rice stem borer))、水稻卷叶虫(rice leaf roller)(稻纵卷叶螟(cnaphalocrocis medinalis))、玉米根结网虫(玉米根草螟(crambus caliginosellus))、
早熟禾结网虫(bluegrass webworm)(早熟禾草螟(crambus teterrellus))、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、埃及金钢钻(spiny bollworm)(棉斑实蛾(earias insulana))、斑点棉铃虫(翠纹钻夜蛾)、美国棉铃虫(棉铃实夜蛾)、玉米穗虫(谷实夜蛾，也称为大豆豆荚虫和棉铃虫)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、草地结网虫(水稻切叶野螟)、西部豆切根虫(西部豆夜蛾)、欧洲葡萄藤蛾(葡萄花翅小卷蛾(lobesia botrana))、柑橘潜叶虫(citrus leafminer)(柑橘潜叶蛾(phyllocnistis citrella))、大白蝶(large white butterfly)(大菜粉蝶(pieris brassicae))、小白蝶(small white butterfly)(菜粉蝶(pieris rapae)，也称为进口菜青虫(imported cabbageworm))、甜菜粘虫(甜菜夜蛾)、烟草切根虫(斜纹夜蛾，也称为丛毛虫)以及番茄潜叶虫(tomato leaf miner)(番茄潜叶蛾(tuta absoluta))。
87.在本技术中对“分离的dna分子”或等同的术语或短语的提及旨在表示dna分子是单独存在的或与其他组合物组合存在，但在其天然环境中不存在。例如，在生物体的基因组的dna中天然存在的核酸元件(诸如编码序列、内含子序列、非翻译前导序列、启动子序列、转录终止序列等)，只要所述元件位于生物体的基因组内并且在其天然存在的基因组内的位置处，就不被认为是“分离的”。然而，只要元件不在生物体的基因组内以及基因组内其天然存在的位置处，这些元件中的每一个以及这些元件的子部件在本公开的范围内将是“分离的”。类似地，只要该编码序列不在编码该蛋白质的序列天然存在的生物体的dna内，编码杀昆虫蛋白或所述蛋白质的任何天然存在的杀昆虫变体的核苷酸序列将是分离的核苷酸序列。出于本公开的目的，编码天然存在的杀昆虫蛋白的氨基酸序列的合成或人工核苷酸序列或其变体序列将被认为是分离的。出于本公开的目的，任何转基因核苷酸序列，即插入到植物或细菌细胞的基因组中或存在于染色体外载体中的dna的核苷酸序列，将被认为是分离的核苷酸序列，无论其存在于用于转化细胞的质粒或类似结构中、植物或细菌的基因组中，还是以可检测量存在于来源于植物或细菌的组织、子代、生物样品或商品产品中。如果蛋白质是在其在自然界中通常不被发现产生的空间中产生的，即在转基因或重组细胞中、在转基因或重组细菌中产生，则所述蛋白质将是分离的。蛋白质和多核苷酸序列/编码序列可以从产生它们的生物体中分离，即本领域已知的任何数量的手段，诸如过滤、沉淀、捕获(使用对蛋白质或核酸结构表现出特异性亲和力的各种分子)等，进一步将分子与产生杂质等的成分“分离”。重组细胞，无论是植物还是细菌，就其本质而言都不是天然存在的，是分离的，并且因此不是自然界的产物，因此在此基础上可在世界各地取得专利。类似地，转基因植物和植物产品不是自然界的产物，不是天然存在的，并且因此与其他自然产物和现象也是分离的，因此在各地都是可取得专利的主题。
88.本技术中对术语“自限性基因”的提及是指限制宿主存活从而导致宿主种群减少的基因。此类技术由oxitech ltd.和其他无关实体提供。将携带一种或多种转基因自限性基因的转基因雄性昆虫释放并与野生雌性一起繁殖。结果子代继承了自限性基因的拷贝。自限性基因通过在昆虫细胞中过量产生一种蛋白质来破坏所述昆虫细胞的正常功能，从而干扰细胞产生发育所需的其他必需蛋白质的能力。通过破坏昆虫的正常发育，该基因阻止所述昆虫存活到成年期。例如，自限性菱纹背蛾(小菜蛾)虫株ox4319l由oxitech ltd开发并携带一个雄性选择基因，所述基因利用来自性别决定基因双性基因(doublesex)(dsx)的序列。该基因表达性别交替剪接，以工程化自限性基因的雌性特异性表达，这防止雌性后代
存活超过幼虫阶段并允许产生仅雄性的自限性蛾群。释放后，雄性害虫与雌性害虫交配，导致下一代雌性后代数量减少，从而局部阻遏小菜蛾种群。为了促进在菱纹背蛾生产设施内饲养大量雄性以用于释放，通过向幼虫饲料中添加四环素或合适的类似物来阻抑ox4319l虫株中雌性特异性dsx的表达。ox4319l还表达荧光蛋白dsred，以允许有效地监测该虫株在田间的存在(jin等人,2013.engineered female-specific lethality for control of pest lepidoptera.acs synthetic biology,2:160-166)。这种自限性技术，当在具有含有本发明的毒素基因的植物的田间应用时，可以延迟或防止本发明的毒素基因和蛋白质防治的目标害虫物种产生抗性，从而赋予含有本发明的毒素基因和蛋白质的任何植物产品更大的持久性。如本说明书在段落[0086]中所示的昆虫物种中的每一种都旨在处于那些易受本文所述的自限性技术影响并因此服从依赖的昆虫物种的范围内。
[0089]
如本技术中进一步描述的，编码tic4064(seq id no:1)的开放阅读框(orf)发现于获自苏云金芽孢杆菌菌株eg9820的dna中。将编码序列在微生物宿主细胞中克隆并表达以产生用于生物测定的重组蛋白。使用来源于微生物宿主细胞的蛋白质tic4064的生物测定证明了针对以下鳞翅目物种的活性：小地老虎(bcw，球菜夜蛾)、玉米穗虫(cew，谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(ecb，玉米螟)、南部粘虫(saw，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(sbl，大豆夜蛾)、西南玉米螟(swc，西南玉米杆草螟)、烟草蚜虫(tbw，烟芽夜蛾)、向日葵尺蠖(sfl，两色髯须夜蛾)以及黧豆毛虫(vbc，黎豆夜蛾)。
[0090]
使用tic4064氨基酸序列产生工程化细菌表达的氨基酸序列变体，从而产生分别由seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49和seq id no:51编码的氨基酸序列变体tic4064_20(seq id no:34)、tic4064_21(seq id no:36)、tic4064_22(seq id no:38)、tic4064_23(seq id no:40)、tic4064_24(seq id no:42)、tic4064_25(seq id no:44)、tic4064_26(seq id no:46)、tic4064_27(seq id no:48)、tic4064_10(seq id no:50)和tic4064_11(seq id no:52)。
[0091]
产生被设计用于植物细胞的合成(人工)编码序列以表达tic4064和tic4064的氨基酸序列变体，其中丙氨酸密码子已作为第二密码子插入开放阅读框中，从而产生分别由编码序列seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29和seq id no:31、编码tic4064_1(seq id no:4)编码的tic4064_1(seq id no:4)以及氨基酸序列变体tic4064_2(seq id no:6)、tic4064_3(seq id no:8)、tic4064_4(seq id no:10)、tic4064_5(seq id no:12)、tic4064_6(seq id no:14)、tic4064_12_1(seq id no:16)、tic4064_12_2(seq id no:18)、tic4064_13(seq id no:20)、tic4064_14(seq id no:22)、tic4064_15(seq id no:24)、tic4064_16(seq id no:26)、tic4064_17(seq id no:28)、tic4064_18(seq id no:30)和tic4064_19(seq id no:32)。
[0092]
表1示出细菌和植物毒素以及相对于tic4064和tic4064_1的氨基酸序列修饰。表1.tic4064、tic4064_1和氨基酸序列变体。
[0093]
细菌tic4064氨基酸序列变体tic4064_20、tic4064_21、tic4064_22、tic4064_23、tic4064_24、tic4064_25、tic4064_26和tic4064_27仅针对cew进行测定，以确定氨基酸修饰是否影响毒素蛋白的活性。氨基酸修饰均不影响针对cew的活性。细菌tic4064氨基酸序列变体tic4064_10和tic4064_11针对baw、cew、saw、sbl和vbc进行测定，并展示出针对所有五种害虫物种的活性。
[0094]
该植物表达毒素tic4064_1、tic4064_2、tic4064_3、tic4064_4、tic4064_5、tic4064_6、tic4064_12_1、tic4064_12_2、tic4064_13、tic4064_14、tic4064_15、tic4064_16、tic4064_17、tic4064_18和tic4064_19，在叶盘测定中展示出针对sbl和vbc的功效。在防虫网室(screenhouse)试验中，tic4064_3展示出针对sbl和vbc的功效以及对saw的阻遏。当在防虫网室试验中测试时，tic4064_3和tic4064_4还展示出针对sbl、vbc和sfl(向日葵尺蠖、两色髯须夜蛾)的功效，以及对sapw(南美豆荚虫、大豆荚虫)的阻遏。
[0095]
对于在植物细胞中的表达，tic4064_1(seq id no:4)、tic4064_2(seq id no:6)、tic4064_3(seq id no:8)、tic4064_4(seq id no:10)、tic4064_5(seq id no:12)、tic4064_6(seq id no:14)、tic4064_12_1(seq id no:16)、tic4064_12_2(seq id no:18)、tic4064_13(seq id no:20)、tic4064_14(seq id no:22)、tic4064_15(seq id no:24)、tic4064_16(seq id no:26)、tic4064_17(seq id no:28)、tic4064_18(seq id no:30)和tic4064_19(seq id no:32)蛋白可被表达以积聚于胞质溶胶中或植物细胞的各种细胞器中。例如，将蛋白质靶向叶绿体可导致转基因植物中所表达的蛋白质的水平增加，同时防止脱表型(off-phenotype)的发生。靶向还可导致转基因事件中害虫抗性功效的增加。靶向肽或转运肽是本领域中已知的并且当附接至感兴趣的蛋白质时，指导将感兴趣的蛋白质运输至细胞中的特定区域，包括例如细胞核、线粒体、内质网(er)、叶绿体、质外体、过氧化物酶体和质膜。在蛋白质被运输穿过特定的膜后，一些靶向肽通过信号肽酶从感兴趣的蛋白质上裂解。为了靶向叶绿体，蛋白质含有长大约40-50个氨基酸的转运肽。关于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和5,728,925。许多天然存在的叶绿体定位蛋白从核基因表达为前体，并通过叶绿体转运肽(ctp)靶向叶绿体。此类分离的ctp的实例包括但不限于与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基(ssu)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、捕光复合蛋白i和蛋白ii、硫氧还蛋白f、烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合酶(epsps)缔合的那些，以及美国专利号7,193,133中描述的转运肽。已经在体内和体外证明了非叶绿体蛋白质可通过使用与异源ctp的蛋白融合体而被靶向叶绿体，并且ctp足以使蛋白质靶向叶绿体。已经表明掺入合适的叶绿体转运肽诸如拟南芥(arabidopsis thaliana)epsps ctp(ctp2)(参见klee等人,mol.gen.genet.210:437-442,1987)或矮牵牛(petunia hybrida)epsps ctp(ctp4)(参见，della-cioppa等人,proc.natl.acad.sci.usa 83:6873-6877,
1986)在转基因植物中将异源epsps蛋白序列靶向叶绿体(参见美国专利号5,627,061；5,633,435；和5,312,910；以及ep 0218571；ep 189707；ep 508909；和ep 924299)。为了将tic4064或氨基酸序列变体tic4064毒素蛋白靶向叶绿体，将编码叶绿体转运肽的序列放置成与已被设计用于在植物细胞中表达的编码tic4064或氨基酸序列变体tic4064毒素蛋白的合成(人工)编码序列的5'可操作地连接且同框。
[0096]
预期通过使用tic4064的氨基酸序列可以产生与tic4064相关的另外的毒素蛋白序列，以产生具有新型特性的新型蛋白质。可以将tic4064毒素蛋白进行比对，以将氨基酸序列水平的差异组合到新型氨基酸序列变体中，并对编码此类变体的重组核酸序列进行适当的改变。
[0097]
预期可通过使用本领域已知的各种基因编辑方法在植物中工程化tic4064蛋白毒素类别的改良变体。用于基因组编辑的此类技术包括但不限于zfn(锌指核酸酶)、大范围核酸酶、talen(转录活化因子样效应物核酸酶)和crispr(成簇规律间隔的短回文重复序列)/cas(crispr相关)系统。这些基因组编辑方法可用于将在植物细胞内转化的毒素蛋白编码序列改变为不同的毒素编码序列。特别地，通过这些方法，改变毒素编码序列内的一个或多个密码子以工程化新的蛋白质氨基酸序列。可替代地，将编码序列内的片段替换或缺失，或将另外的dna片段插入编码序列中，以工程化新的毒素编码序列。新的编码序列可编码具有新特性的毒素蛋白，所述新特性诸如针对害虫的增大的活性或谱，以及提供针对其中已对原始昆虫毒素蛋白发展出抗性的害虫物种的活性。包含基因编辑的毒素编码序列的植物细胞可通过本领域已知的方法使用以产生表达新毒素蛋白的完整植物。
[0098]
还预期tic4064的片段或其蛋白变体可以是截短形式，其中一个或多个氨基酸从蛋白质的n末端、c末端、中间或其组合缺失，其中所述片段和变体保留了昆虫抑制活性。这些片段可以是tic4064或衍生的蛋白质变体的天然存在的或合成的变体，但应保留至少tic4064的昆虫抑制活性。
[0099]
类似于tic4064蛋白的蛋白质可以使用本领域已知的各种基于计算机的算法来鉴定并相互比较(参见表2至6)。本技术中报告的氨基酸序列同一性是使用以下这些默认参数的clustal w比对的结果：权重矩阵：blosum，空位开放罚分：10.0，空位延伸罚分：0.05，亲水性间隙：开，亲水性残基：gpsndqerk，残基特异性空位罚分：开(thompson等人(1994)nucleic acids research,22:4673-4680)。氨基酸同一性百分比进一步通过下式计算：100％乘以(氨基酸同一性/主题蛋白质的长度)。其他比对算法在本领域中也是可用的并且提供与使用clustal w比对获得的那些相似的结果，并且在本文中被设想。
[0100]
预期的是，对鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性的蛋白质在以下情况下与tic4064相关：如果在例如clustalw比对中的查询中使用该蛋白质，并且如seq id no:2所示的本发明的蛋白质在这样的比对中被鉴定为命中，其中查询蛋白沿着查询蛋白中的氨基酸的长度表现出至少98％至约100％的氨基酸序列同一性，即约98％、99％、100％或者该范围内的任何分数百分比。
[0101]
使用clustal w算法将示例性的细菌表达的tic4064蛋白和氨基酸序列变体相互比对。产生了每个全长蛋白质的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵，如表2和3所报告的。表2.示例性的细菌表达的tic4064蛋白和氨基酸序列变体的成对矩阵显示。
表3.示例性的细菌表达的tic4064蛋白和氨基酸序列变体的成对矩阵显示。
[0102]
使用clustal w算法将示例性的植物表达的tic4064蛋白和氨基酸序列变体相互比对。产生了每个全长蛋白质的氨基酸序列同一性百分比的成对矩阵，如表4和5所报告的。表4示出全长植物表达蛋白的比对。表5示出在原毒素结构域不存在的情况下截短的植物表达蛋白的比对。
[0103]
除了同一性百分比之外，tic4064和tic4064的氨基酸序列变体还可通过一级结构(保守氨基酸基序)、长度和其他特征来关联。表6中报告了tic4064蛋白毒素类别的特征。
表6.tic4064和氨基酸序列变体蛋白毒素的选定特征。
[0104]
如本技术的实施例中进一步描述的，设计编码tic4064_1、tic4064_2、tic4064_3、tic4064_4、tic4064_5、tic4064_6、tic4064_12_1、tic4064_12_2、tic4064_13、tic4064_14、tic4064_15、tic4064_16、tic4064_17、tic4064_18和tic4064_19的合成核酸分子序列以用于在植物中使用，其分别由seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29和seq id no:31编码。相对于tic4064蛋白，变体蛋白中的每一个具有紧跟在起始甲硫氨酸之后添加在氨基酸序列的位置二(2)处的丙氨酸氨基酸。
[0105]
可以构建包含重组核酸分子序列的表达盒和载体并根据本领域已知的转化方法和技术将其引入植物，特别是玉米、大豆或棉花植物细胞中。例如，农杆菌介导的转化描述在以下中：美国专利申请公布2009/0138985a1(大豆)、2008/0280361a1(大豆)、2009/0142837a1(玉米)、2008/0282432(棉花)、2008/0256667(棉花)、2003/0110531(小麦)、
2001/0042257a1(糖用甜菜)、美国专利号5,750,871(芥花)、7,026,528(小麦)和6,365,807(水稻)，以及arencibia等人(1998)transgenic res.7:213-222(甘蔗))，所述文献全部通过引用整体并入本文。转化的细胞可以再生成表达tic4064和氨基酸序列变体蛋白的转化植物，并且通过使用从转化植物获得的植物叶盘在鳞翅目害虫幼虫的存在下进行的生物测定而展示出杀虫活性。植物可通过再生、种子、花粉或分生组织转化技术由植物细胞衍生。转化植物的方法是本领域已知的。
[0106]
作为传统转化方法的替代方案，可将dna序列(诸如转基因，一个或多个表达盒等)经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的一个或多个重组dna构建体和一个或多个分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一种转基因、表达盒或其他dna序列，以用于插入到植物或植物细胞的基因组中。这种用于定点整合的供体模板还可包含侧接插入序列(即，待被插入到植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的一个或多个重组dna构建体还可包含一个或多个表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或任何一个或多个相关蛋白质以进行定点整合。这一个或多个核酸酶表达盒可与供体模板存在于同一分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，这些方法涉及切割基因组dna以在期望的基因组位点或基因座处产生双链断裂(dsb)或切口的不同的蛋白质(或蛋白质复合物和/或指导rna)。简单来说，如本领域中所理解的，在修复由核酸酶引入的dsb或切口的过程中，供体模板dna可在dsb或切口的位点处被整合到基因组中。供体模板中一个或多个同源臂的存在可促进在通过同源重组实现的修复过程中插入序列被采用并被靶向到植物基因组中，尽管插入事件可通过非同源末端连接(nhej)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、tale-核酸内切酶和rna指导的核酸内切酶(例如，cas9或cpf1)。对于使用rna指导的位点特异性核酸酶(例如，cas9或cpf1)的方法，一个或多个重组dna构建体还将包含编码一个或多个指导rna以将核酸酶引导至植物基因组内的期望位点的序列。
[0107]
编码细菌和植物表达的tic4064、tic4064_1或tic4064氨基酸序列变体蛋白的重组核酸分子组合物可以用重组dna构建体表达，其中具有编码该蛋白质的orf的多核苷酸分子可操作地连接至基因表达元件，诸如启动子以及用于在构建体预期使用的系统中表达所需的任何其他调控元件。非限制性实例包括与用于在植物中表达蛋白质的tic4064_1蛋白或蛋白质变体编码序列可操作地连接的植物功能性启动子，或与用于在bt细菌或其他芽孢杆菌属物种中表达蛋白质的tic4064蛋白或tic4064蛋白质变体编码序列可操作地连接的bt功能性启动子。其他元件可以与tic4064蛋白毒素类别蛋白质编码序列可操作地连接，包括但不限于增强子、内含子、非翻译前导序列、编码的蛋白质固定标签(his标签)、易位肽(即，质体转运肽、信号肽)、用于翻译后修饰酶的多肽序列、核糖体结合位点和rnai靶位点。与本文一起提供的示例性重组多核苷酸分子包括但不限于与诸如seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49和seq id no:51的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸编码具有如seq id no:2、
seq id no:4、seq id no:6、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50和seq id no:52所示的氨基酸序列的相应多肽或蛋白质。异源启动子还可以与编码质体靶向的tic4064_1或tic4064_1蛋白变体的合成dna编码序列可操作地连接。编码本文公开的蛋白质的重组核酸分子的密码子可以用同义密码子取代(本领域已知为沉默取代)。
[0108]
包含编码来自tic4064蛋白毒素类别的一种或多种蛋白质的序列的重组dna构建体可进一步包含编码以下的dna区域：一种或多种昆虫抑制剂，其可被构造成与来自tic4064蛋白毒素类别的另一蛋白质同时表达或共表达；另一种昆虫防治蛋白毒素；昆虫抑制dsrna分子；或辅助蛋白。辅助蛋白包括但不限于辅因子、酶、结合伴侣或其他剂，其用于辅助昆虫抑制剂的有效性，例如通过辅助其表达、影响其在植物中的稳定性、优化用于低聚反应的自由能、增强其毒性，以及增大其活性谱。辅助蛋白可例如促进一种或多种昆虫抑制剂的摄取，或增强毒性剂的毒性作用。
[0109]
可以组装重组dna构建体，使得所有蛋白质或dsrna分子从一个启动子表达，或者每个蛋白质或dsrna分子处于单独的启动子控制下，或其一些组合。本发明的蛋白质可以从多基因表达系统表达，其中tic4064蛋白毒素类别的一种或多种蛋白质从共同核苷酸区段表达，根据所选择的表达系统的类型，所述区段还包含其他开放阅读框和启动子。例如，细菌多基因表达系统可以利用单个启动子驱动单个操纵子内的多个连接的/串联开放阅读框的表达(即，多顺反子表达)。在另一个实例中，植物多基因表达系统可利用多个未连接或连接的表达盒，每个表达盒表达不同的蛋白质或其他剂，诸如一种或多种dsrna分子。
[0110]
包含tic4064蛋白毒素类别编码序列的重组多核苷酸或重组dna构建体可通过载体递送至宿主细胞，所述载体例如质粒、杆状病毒、合成染色体、病毒体、粘粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体。此类载体可用于实现tic4064蛋白毒素类别编码序列在宿主细胞中的稳定或瞬时表达，或所编码的多肽的后续表达。包含tic4064蛋白毒素类别编码序列并被引入宿主细胞中的外源重组多核苷酸或重组dna构建体在本技术中被称为“转基因”。
[0111]
本文提供了转基因细菌、转基因植物细胞、转基因植物和转基因植物部分，其包含表达tic4064、tic4064_1或其氨基酸序列变体，或相关家族毒素蛋白编码序列中的任何一种或多种的重组多核苷酸。术语“细菌细胞”或“细菌”可包括但不限于农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属(salmonella)、假单胞菌属、短芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或根瘤菌属细胞。术语“植物细胞”或“植物”可包括但不限于双子叶植物或单子叶植物。术语“植物细胞”或“植物”还可包括但不限于紫花苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔(例如，芥花)、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米(即玉蜀黍，诸如甜玉米或饲料玉米)、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、蛇麻子、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、枫香、甘薯、柳枝稷、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞或植物。在某些实施方案中，提供了从转基因植物细胞再生的转基因植物和转基因植物部分。在某些实施方
no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49和seq id no:51中的每一个中引入核苷酸序列变异。此类“诱变”寡核苷酸可用于鉴定在转基因植物宿主细胞中表现出一定范围的昆虫抑制活性或不同表达的tic4064蛋白毒素类别氨基酸序列变体。
[0117]
核苷酸序列同源物，例如，由在严格杂交条件下与本技术中公开的每个或任一个序列杂交的核苷酸序列编码的杀昆虫蛋白，也是本发明的一个实施方案。本发明还提供了一种用于检测与第二核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列的方法，其中第一核苷酸序列(或其反向互补序列)编码杀虫蛋白或其杀虫片段并与第二核苷酸序列杂交。在这种情况下，第二核苷酸序列可以是在严格杂交条件下示出为seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:9、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49或seq id no:51的任何核苷酸序列。核苷酸编码序列在适当的杂交条件(诸如严格杂交条件)下相互杂交，并且由这些核苷酸序列编码的蛋白质与针对任一种其他蛋白质产生的抗血清交叉反应。如本文所定义，严格杂交条件包括至少在42℃下杂交，然后在室温下洗涤两次，每次用2x ssc、0.1％sds洗涤五分钟，然后在65℃下洗涤两次，每次在0.5x ssc、0.1％sds中洗涤三十分钟。在甚至更高的温度下洗涤构成甚至更严格的条件，例如68℃的杂交条件，接着在68℃下在含有0.1％sds的2xssc中洗涤。
[0118]
本领域技术人员将认识到，由于遗传密码的冗余性，许多其他序列能够编码此类相关蛋白，并且在其用于在芽孢杆菌属菌株或在植物细胞中表达杀虫蛋白的程度上，那些序列是本发明的实施方案，当然也认识到许多这样的冗余编码序列在这些条件下将不与编码tic4064和tic4064氨基酸序列变体的天然芽孢杆菌属序列杂交。本技术设想了使用这些和本领域普通技术人员已知的其他鉴定方法来鉴定tic4064和tic4064氨基酸序列变体蛋白编码序列以及与tic4064和tic4064氨基酸序列变体蛋白编码序列具有显著同一性百分比的序列。
[0119]
本公开还设想了使用本领域已知的分子方法来工程化和克隆包含来自杀虫蛋白的蛋白质的嵌合体的商业上有用的蛋白质；例如，嵌合体可由tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白的区段组装，以得到另外的有用实施方案，包括tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白的区段与不同于tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白和相关蛋白的不同蛋白质的区段的组装体。tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白可相互比对并且与其他芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或其他杀虫蛋白(无论这些蛋白在系统发生上是近缘还是远缘的)进行比对，并且可鉴定可用于在比对的蛋白质之间进行取代的每种这样的蛋白质的区段，从而导致嵌合蛋白的构建。可对此类嵌合蛋白进行害虫生物测定分析，并且表征与嵌合体中的每个这样的区段所来源的亲本蛋白相比增大的生物活性或扩大的目标害虫谱的存在或不存在。可通过与其他蛋白质交换结构域或区段或通过使用本领域已知的定向进化方法对多肽的杀虫活性进行进一步工程化，以得到针对特定害虫或更广谱害虫的活性。
[0120]
本技术中公开了用tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白防治作物植物的昆虫(特别是鳞翅目)侵袭的方法。此类方法可包括种植包含昆虫或鳞翅目抑制量的tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的植物。在某些实施方案中，此类方法还可包括以下中的任何一个或多个：(i)将包含或编码tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的任何组合物应用于植物或产生植物的种子；以及(ii)用编码tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的多核苷酸转化植物或产生植物的植物细胞。一般而言，预期可在组合物中、在微生物中或在转基因植物中提供tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白，以赋予针对鳞翅目昆虫的昆虫抑制活性。
[0121]
在某些实施方案中，tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的重组核酸分子是昆虫抑制组合物的杀昆虫活性成分，所述组合物通过以下方式制备：在适于表达tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的条件下培养被转化来表达tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的重组芽孢杆菌属或任何其他重组细菌细胞。这样的组合物可以通过干燥、冻干、均质化、提取、过滤、离心、沉降或浓缩表达/产生所述重组多肽的此类重组细胞的培养物来制备。这样的过程可以得到芽孢杆菌属或其他昆虫病原性细菌细胞提取物、细胞悬液、细胞匀浆、细胞裂解物、细胞上清液、细胞滤液或细胞沉淀。通过获得如此产生的重组多肽，包含重组多肽的组合物可以包括细菌细胞、细菌孢子和伴孢包涵体，并且可以被配制用于各种用途，包括作为农业昆虫抑制喷雾产品或作为饮食生物测定中的昆虫抑制制剂。
[0122]
在一个实施方案中，为了降低抗性发展的可能性，包含tic4064或tic4064氨基酸序列变体蛋白的昆虫抑制组合物还可包含对相同鳞翅目昆虫物种表现出昆虫抑制活性，但不同于tic4064或tic4064氨基酸序列变体毒素蛋白的至少一种另外的多肽。用于这种组合物的可能的另外的多肽包括昆虫抑制蛋白和昆虫抑制dsrna分子。baum等人描述了使用此类核糖核苷酸序列来防治害虫的一个实例(美国专利公布2006/0021087a1)。用于防治鳞翅目害虫的此类另外的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于cry1a(美国专利号5,880,275)、cry1ab、cry1ac、cry1a.105、cry1ae、cry1b(美国专利公布号10/525,318)、cry1c(美国专利号6,033,874)、cry1d、cry1da及其变体、cry1e、cry1f和cry1a/f嵌合体(美国专利号7,070,982；6,962,705；以及6,713,063)、cry1g、cry1h、cry1i、cry1j、cry1k、cry1l、cry1型嵌合体诸如但不限于tic836、tic860、tic867、tic869和tic1100(国际申请公布wo2016/061391(a2))、tic2160(国际申请公布wo2016/061392(a2))、cry2a、cry2ab(美国专利号7,064,249)、cry2ae、cry4b、cry6、cry7、cry8、cry9、cry15、cry43a、cry43b、cry51aa1、et66、tic400、tic800、tic834、tic1415、vip3a、vip3ab、vip3b、axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035、axmi-045(美国专利公布2013-0117884a1)、axmi-52、axmi-58、axmi-88、axmi-97、axmi-102、axmi-112、axmi-117、axmi-100(美国专利公布2013-0310543a1)、axmi-115、axmi-113、axmi-005(美国专利公布2013-0104259a1)、axmi-134(美国专利公布2013-0167264a1)、axmi-150(美国专利公布2010-0160231a1)、axmi-184(美国专利公布2010-0004176a1)、axmi-196、axmi-204、axmi-207、axmi-209(美国专利公布2011-0030096a1)、axmi-218、axmi-220(美国专利公布2014-0245491a1)、axmi-221z、axmi-222z、axmi-223z、axmi-224z、axmi-225z(美国专利公布2014-0196175a1)、axmi-238(美国专利公布2014-0033363a1)、axmi-270(美国专利公布2014-0223598a1)、axmi-345(美国专利公布2014-0373195a1)、axmi-335(国际申请公布wo2013/134523(a2))、dig-3(美国专利公布
2013-0219570a1)、dig-5(美国专利公布2010-0317569a1)、dig-11(美国专利公布2010-0319093a1)、afip-1a及其衍生物(美国专利公布2014-0033361a1)、afip-1b及其衍生物(美国专利公布2014-0033361a1)、pip-1apip-1b(美国专利公布2014-0007292a1)、pseen3174(美国专利公布2014-0007292a1)、aecfg-592740(美国专利公布2014-0007292a1)、pput_1063(美国专利公布2014-0007292a1)、dig-657(国际申请公布wo2015/195594a2)、pput_1064(美国专利公布2014-0007292a1)、gs-135及其衍生物(美国专利公布2012-0233726a1)、gs153及其衍生物(美国专利公布2012-0192310a1)、gs154及其衍生物(美国专利公布2012-0192310a1)、gs155及其衍生物(美国专利公布2012-0192310a1)、如美国专利公布2012-0167259a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2012-0047606a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0154536a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2011-0112013a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0192256a1中所述的seq id no:2和4及其衍生物、如美国专利公布2010-0077507a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0077508a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2009-0313721a1中所述的seq id no:2及其衍生物、如美国专利公布2010-0269221a1中所述的seq id no:2或4及其衍生物、如美国专利号7,772,465(b2)中所述的seq id no:2及其衍生物、如wo2014/008054a2中所述的cf161_0085及其衍生物、如美国专利公布us2008-0172762a1、us2011-0055968a1和us2012-0117690a1中所述的鳞翅目毒性蛋白及其衍生物；如us7510878(b2)中所述的seq id no:2或4及其衍生物、如美国专利号7812129(b1)中所述的seq id no:2或4及其衍生物；ipd110aa和同源物(国际申请公布wo2019/178038a2)；tic868(美国专利us10233217)、cry1da1_7(美国专利us10059959)、bcw003(美国专利us10703782)、tic1100(美国专利us10494408)、tic867(美国专利us10669317)、tic867_23(美国专利us10611806)、tic6757(美国专利us10155960)、tic7941(美国专利公布2020-0229445a1)、对鳞翅目物种有毒的蕨类毒素，诸如美国专利10,227,608中公开的那些等等。
[0123]
在其他实施方案中，这样的组合物/制剂还可包含对不被本发明的其他昆虫抑制蛋白抑制的昆虫表现出昆虫抑制活性的至少一种另外的多肽，以扩大所获得的昆虫抑制谱。例如，为了防治半翅目害虫，本发明的昆虫抑制蛋白的组合可与半翅目活性蛋白诸如tic1415(美国专利公布2013-0097735a1)、tic807(美国专利号8609936)、tic834(美国专利公布2013-0269060a1)、axmi-036(美国专利公布2010-0137216a1)和axmi-171(美国专利公布2013-0055469a1)一起使用。此外，用于防治鞘翅目害虫的多肽可选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白，诸如但不限于cry3bb(美国专利号6,501,009)、cry1c变体、cry3a变体、cry3、cry3b、cry34/35、5307、axmi134(美国专利公布2013-0167264a1)、axmi-184(美国专利公布2010-0004176a1)、axmi-205(美国专利公布2014-0298538a1)、axmi-207(美国专利公布2013-0303440a1)、axmi-218、axmi-220(美国专利公布20140245491a1)、axmi-221z、axmi-223z(美国专利公布2014-0196175a1)、axmi-279(美国专利公布2014-0223599a1)、axmi-r1及其变体(美国专利公布2010-0197592a1、tic407、tic417、tic431、tic807、tic853、tic901、tic1201、tic3131、dig-10(美国专利公布2010-0319092a1)、ehips(美国专利申请公布号2010/0017914)、ip3及其变体(美国专利公布2012-0210462a1)、假单胞菌毒素idp072aa(美国专利申请公布号2014/055128)以及六毒素-hv1a(美国专利申请公布
us2014-0366227a1)。
[0124]
可与tic4064家族的昆虫抑制蛋白组合的用于防治鞘翅目、鳞翅目和半翅目害虫的另外的多肽可以在由neil crickmore维护的苏云金芽孢杆菌毒素命名网站(在万维网btnomenclature.info)上找到。在广义上，预期本领域技术人员已知的任何昆虫抑制蛋白都可以与tic4064家族组合用于植物中(通过育种或分子堆积组合)或者作为生物杀虫剂或生物杀虫剂的组合用于组合物或制剂中。
[0125]
本领域已经记录了昆虫对某些杀昆虫剂发展出抗性的可能性。一种昆虫抗性管理策略是采用表达通过不同的作用方式发挥作用的两种不同的昆虫抑制剂的转基因作物。因此，对任一种昆虫抑制剂具有抗性的任何昆虫都可以通过另一种昆虫抑制剂来防治。另一种昆虫抗性管理策略使用没有针对目标鳞翅目害虫物种被提供保护的植物，以为此类未受保护的植物提供庇护。一个具体实例描述于美国专利号6,551,962中，所述美国专利通过引用整体并入。
[0126]
其他实施方案，诸如被设计用于防治也由本文公开的蛋白质防治的害虫的待与蛋白质一起用于种子处理、在制剂上喷雾、滴落或擦拭的局部应用的杀虫化学剂可直接应用于土壤(土壤浇灌)、应用于表达本文公开的蛋白质的生长中的植物，或被配制以应用于包含编码一种或多种所公开的蛋白质的一种或多种转基因的种子。用于种子处理的此类制剂可以与本领域已知的各种粘着剂和增粘剂一起应用。此类制剂可包含在作用方式上与所公开的蛋白质协同作用的杀虫剂，使得制剂杀虫剂通过不同的作用方式起作用以防治可由所公开的蛋白质防治的相同或相似害虫，或这样的杀虫剂用于防治更宽宿主范围内的害虫或无法由tic4064和tic4064氨基酸序列变体杀虫蛋白有效防治的植物害虫物种。
[0127]
前述组合物/制剂还可包含农业上可接受的载剂(诸如饵剂)、粉剂、粉尘剂、丸剂、颗粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体混悬剂、水溶液、芽孢杆菌孢子/晶体制剂、种子处理剂、转化以表达一种或多种蛋白质的重组植物细胞/植物组织/种子/植物，或转化以表达一种或多种蛋白质的细菌。取决于重组多肽中固有的昆虫抑制或杀昆虫抑制水平和待应用于植物或饮食测定的制剂水平，组合物/制剂可包含按重量计各种量的重组多肽，例如0.0001重量％至0.001重量％至0.01重量％至1重量％至99重量％的重组多肽。
[0128]
鉴于前述内容，本领域技术人员应认识到，可以对所公开的特定方面做出改变，并且仍然获得相似或类似的结果，而不脱离本发明的精神和范围。因此，本文公开的特定结构和功能细节不应解释为限制性的。应理解的是，本文引用的每篇参考文献的全部公开内容并入本技术的公开内容内。实施例实施例1tic4064和tic4064的工程化氨基酸序列变体的发现、克隆和表达
[0129]
对编码新型苏云金芽孢杆菌(bt)杀虫蛋白的序列进行了鉴定、克隆、序列验证，并在昆虫生物测定中测试。杀虫蛋白tic4064是从bt物种eg9820分离的并且代表新型cry9aa相关蛋白。bt菌株eg9820最初被鉴定为含有bt或bt样细菌的菌株的产芽胞、晶体和质粒。从eg9820分离dna并测序。然后对组装的序列进行分析并通过对内毒素结构域的命中和与已知cry9aa毒素的同一性进行pfam分析来鉴定编码tic4064蛋白的开放阅读框。全长tic4064蛋白氨基酸序列表现为与注释为尚未针对害虫物种进行测定的假设蛋白的genbank登录号
wp_087976765具有98.1％的同一性。genbank登录号caa41425与全长tic4064蛋白具有97.58％的同一性。caa41425在饮食生物测定中针对苹果褐卷蛾(epiphyas postvittana)(浅褐色苹果蛾)的一龄幼虫展示出70％的死亡率，但是作者无法分离出足够量的蛋白质来测定其他害虫(gleave等人,journal of general microbiology138:55-62,1992)。设计聚合酶链式反应(pcr)引物以从分离自bt物种eg9820的总基因组dna扩增tic4064的编码区的全长拷贝。pcr扩增子还包括编码序列的翻译起始密码子和终止密码子。
[0130]
使用本领域已知的方法将tic4064编码序列克隆到与bt可表达启动子可操作地连接的bt表达载体中。孢子和可溶性蛋白制剂用于生物测定。此外，产生了包含选定氨基酸取代的tic4064的变体。合成编码这些tic4064氨基酸序列变体的编码序列并将其克隆到用于在大肠杆菌中表达蛋白质的细菌表达载体中。tic4064氨基酸序列变体的蛋白质制剂用于生物测定。表7示出细菌tic4064氨基酸序列变体和相对于细菌tic4064蛋白质序列引入的氨基酸取代。表7.tic4064氨基酸序列变体和氨基酸取代。表7.tic4064氨基酸序列变体和氨基酸取代。实施例2tic4064和tic4064氨基酸序列变体在昆虫生物测定中展示出鳞翅目活性
[0131]
使杀虫蛋白tic4064和tic4064氨基酸序列变体tic4064_20、tic4064_21、tic4064_22、tic4064_23、tic4064_24、tic4064_25、tic4064_26、tic4064_27、tic4064_10和tic4064_11在bt或大肠杆菌中表达，并测定其对鳞翅目的各个物种的毒性。还测定了tic4064对鞘翅目、半翅目和双翅目的各个物种的毒性。
[0132]
测定了tic4064对鳞翅目昆虫物种小地老虎(bcw，球菜夜蛾)、玉米穗虫(cew，谷实夜蛾，也称为大豆豆荚虫)、欧洲玉米螟(ecb，玉米螟)、秋粘虫(faw，草地贪夜蛾)、南部粘虫(saw，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(sbl，大豆夜蛾)、西南玉米螟(swc，西南玉米杆草螟)、烟草
蚜虫(tbw，烟芽夜蛾)、向日葵尺蠖(sfl，两色髯须夜蛾)和黎豆毛虫(vbc，黎豆夜蛾)；鞘翅目物种科罗拉多马铃薯甲虫(cpb，马铃薯甲虫(leptinotarsa decemlineata))和西部玉米根虫(wcr，西方玉米根虫(diabrotica virgifera))；半翅目物种新热带棕臭虫(nbsb，褐蝽(euschistus heros))；以及双翅目物种黄热病蚊(yfm，埃及伊蚊(aedes aegypti))的毒性。使用tic4064的微生物宿主细胞衍生蛋白进行的生物测定展示出针对鳞翅目物种bcw、cew、ecb、saw、sbl、swc、sfl、tbw和vbc的活性。还观察到针对双翅目物种yfm的活性。
[0133]
细菌tic4064氨基酸序列变体tic4064_20、tic4064_21、tic4064_22、tic4064_23、tic4064_24、tic4064_25、tic4064_26和tic4064_27仅针对cew进行测定，以确定氨基酸修饰是否影响cew活性。所有tic4064氨基酸序列变体都保留了针对cew的活性。针对cew、saw、sbl和vbc对tic4064_10和tic4064_11进行测定，并且其展示出针对每种害虫物种的活性。此外，在稀释测定中针对黑粘虫(baw，考斯夜蛾)对tic4064_10和tic4064_11进行测定。tic4064_10和tic4064_11都展示出针对baw的活性。实施例3用于在植物中表达的tic4064和tic4064氨基酸序列变体的合成编码序列的设计。
[0134]
编码tic4064和tic4064的氨基酸序列变体的合成(人工)编码序列被设计用于在植物细胞中表达。此外，还设计了编码tic4064和包含原毒素结构域的缺失的tic4064氨基酸序列变体的编码序列。
[0135]
合成序列是根据美国专利5,500,365中一般性地描述的方法合成的，以避免某些不合理的问题序列，诸如富含attta和a/t的植物聚腺苷酸化序列，同时保留天然芽孢杆菌属蛋白的氨基酸序列。tic4064_1(seq id no:3)是tic4064的植物合成编码序列，并且编码tic4064_1蛋白(seq id no:4)，其相对于tic4064蛋白紧跟在起始甲硫氨酸之后包含另外的丙氨酸残基。还合成了编码tic4064_1的氨基酸序列变体的合成编码序列，其中特定氨基酸被取代。此外，合成了编码tic4064_1氨基酸序列变体的原毒素结构域的截短物的合成编码序列。所有tic4064_1氨基酸序列变体都包含紧跟在起始甲硫氨酸之后的另外的丙氨酸残基。表8示出各tic4064_1变体以及相对于tic4064_1和细菌tic4064的对应氨基酸变化。
[0136]
使用本领域已知的方法构建包含靶向和未靶向的tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体合成编码序列的二元植物转化载体。所得的转化载体包含用于表达tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体杀虫蛋白的第一转基因盒，所述第一转基因盒包含组成型启动子，所述组成型启动子在5'可操作地连接至前导序列，所述前导序列在5'可操作地连接至编码质体靶向的或未靶向的tic4064_1或tic4064_1氨基酸序列变体蛋白的合成编码序列，所述合成编码序列继而在5'可操作地连接至3'utr；以及用于使用大观霉素选择来选择转化的植物细胞的第二转基因盒。
实施例4tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体在稳定转化的大豆植物中展示出鳞翅目活性
[0137]
使用本领域已知的方法克隆包含被设计成表达质体靶向的和未靶向的tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体杀虫蛋白的转基因盒的二元植物转化载体。所得载体用于稳定转化大豆植物。从转化体收获组织并将其用于针对各种鳞翅目昆虫物种的昆虫生物测
定。
[0138]
使用农杆菌介导的转化方法，用实施例3中描述的二元转化载体转化大豆植物。通过本领域已知的方法诱导转化的细胞形成植物。使用植物叶盘进行的生物测定与美国专利号8,344,207中描述的那些类似地进行。将一只不到一天大的新孵化的新生幼虫放在每个叶盘样品上，并喂养大约四天。使用未转化的大豆植物获得组织以用作阴性对照。针对南部粘虫(saw，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(sbl，大豆夜蛾)、大豆豆荚虫(spw，谷实夜蛾)和藜豆毛虫(vbc，黎豆夜蛾)评估来自每个二元载体的多重转化r0单拷贝插入事件。基于每个事件的生物测定中的叶片损伤百分比和享有最低的损伤百分比范围(外显率)的事件百分比，将范围从0到3的功效评级得分分配给每个事件，如表9所示。表9.功效评级得分。功效得分叶片损伤百分比外显率0》50％》80％1《50％》20％2《30％》20％3《10％》50％
[0139]
表10示出表达实施例3的表8中描述的tic4064_1或tic4064_1氨基酸序列变体的r0稳定转化的大豆植物的功效得分。括号中的数字代表享有最低的损伤百分比范围的事件的数量/所测定事件的总数。对于tic4064_3、tic4064_4、tic4064_5、tic4064_13、tic4064_14、tic4064_15、tic4064_17、tic4064_18和tic4064_19，使用多个构建体来转化植物，每个构建体包含不同的表达元件。表达毒素蛋白tic4064_3、tic4064_4、tic4064_13、tic4064_14、tic4064_15、tic4064_17、tic4064_18和tic4064_19的构建体各自包含连接至杀虫蛋白的氨基末端叶绿体转运肽，以用于将相应的蛋白质靶向叶绿体。
[0140]
如表10中可以看出，表达tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体的稳定转化的r0大豆植物展示出针对sbl和vbc的功效。大多数r0稳定转化的大豆植物展示出对saw的功效或阻遏。表10.表达tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体的r0大豆植物的功效评级得分。
[0141]
使选定的表达tic4064_1、tic4064_2、tic4064_3、tic4064_4和tic4064_6的r0事件自花授粉并产生r1种子。使用r1种子生长出r1植物。选择杀虫蛋白表达盒纯合的r1植物用于针对saw、sbl、spw和vbc的叶盘生物测定。如下表11中可以看出，表达tic4064_1、tic4064_2、tic4064_3、tic4064_4和tic4064_6的r1植物展示出针对sbl和vbc的功效以及对saw的阻遏。
表11.表达tic4064_1和tic4064_1氨基酸序列变体的r1大豆植物的功效评级得分。毒素构建体质体靶向sawsblspwvbctic4064_1 否2(7/10)3(9/10)0(10/10)3(9/10)tic4064_2 否1(7/10)3(9/10)0(10/10)3(9/10)tic4064_3构建体-6否3(7/13)3(9/13)0(13/13)3(11/13)tic4064_4构建体-2否2(11/14)3(8/14)0(14/14)3(14/14)tic4064_6 否2(4/6)3(6/6)0(6/6)3(6/6)
[0142]
tic4064_1、tic4064_2、tic4064_3、tic4064_4、tic4064_5、tic4064_6、tic4064_12_1、tic4064_12_2、tic4064_13、tic4064_14、tic4064_15、tic4064_16、tic4064_17、tic4064_18和tic4064_19对sbl和vbc有效。tic4064_1和tic4064_2对saw有效。大多数tic4064_1氨基酸序列变体展示出对saw的阻遏。实施例5tic4064_3和tic4064_4对大豆尺蠖、向日葵尺蠖和藜豆毛虫有效，并在防虫网室试验中提供对南美豆荚虫、南部粘虫和向日葵尺蠖的阻遏。
[0143]
在美国和阿根廷的防虫网室试验中，测定了大豆植物表达tic4064_3和截短的tic4064_3、tic4064_4对抗选定的害虫物种的保护作用。
[0144]
在美国，在几个地点，在防虫网室试验中针对南部粘虫(saw，南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(sbl，大豆夜蛾)、大豆豆荚虫(spw，谷实夜蛾)和藜豆毛虫(vbc，黎豆夜蛾)对表达tic4064_3的大豆植物进行测定。防虫网室试验在伊利诺伊州泽西维尔(jerseyville,il)针对saw和sbl进行，在田纳西州联合市(union city,tn)针对sbl进行，并且在伊利诺伊州沃特曼(waterman,il)针对vbc和spw进行。使用随机完全区集设计评估事件。每个地块都种植成单个六(6)英尺的行，每英尺大约有八(8)颗种子。每个事件在防虫网室中由随机位于防虫网室中的三(3)个独立地块代表。未转化的事件用作阴性对照，并且还将该事件随机分配到防虫网室内的位置。
[0145]
spw和vbc的侵袭是使用蛾成虫完成的。在养虫室(insectary)中将昆虫在成虫羽化笼(adult emergence cage)中饲养成蛹，并维持在气候控制的孵化器中。将蛹运送至特定位置，以释放于防虫网室中。防虫网室中的每次释放都使用大约一千二百(1,200)至两千(2,000)只成虫。对于spw，从大豆发育的r1到r2阶段，每周在防虫网室中释放成虫。关于vbc，在v4至r3的发育阶段之间每两周在防虫网室中释放成虫。蛾成虫需要持续接触百分之十(10％)的蔗糖溶液才能获得正常的寿命和繁殖。向塑料食品容器中装入脱脂棉，然后将糖溶液倒入容器中，使棉花完全浸透。每天补充糖溶液直到成虫活动平息，这通常是在成虫最终释放后两周左右。直接虫卵侵袭用于saw，因为这种昆虫不优先或均匀地排卵在大豆上。每次侵袭使用大约二十五万(250,000)到三十二万(320,000)个卵，并且从r1到r3发育阶段每两周应用一次。通过将数张包含相等数量的saw卵的纸折叠在上冠中的结实的叶柄上并将纸牢固地装订在一起，从而将纸附着在植物上。一张纸放在地块前端一(1)英尺内的植物上，第二张纸放在地块中间的植物上，并且第三张纸放在地块后端一(1)英尺内的植物上。
[0146]
在植物发育的不同阶段评估落叶百分比。对于saw，在伊利诺伊州泽西维尔在
r2.8、r4.1、r4.8和r6.0发育阶段评估落叶百分比。对于sbl，在田纳西州联合市在r2.0、r3.1、r4.2和r5.5发育阶段并且在伊利诺伊州泽西维尔在r5.4和r5.8发育阶段测定落叶百分比。对于vbc，在伊利诺伊州沃特曼在r3.9、r5.0和r5.4发育阶段评估落叶百分比。对于spw，在伊利诺伊州沃特曼在r4.1、r4.7、r5.4和r5.8发育阶段评估落叶百分比。最大落叶百分比由在每种昆虫的不同发育阶段中观察到的最高落叶百分比得到。表12示出针对saw、sbl和vbc，表达tic4064_3的植物的平均最大落叶百分比。针对spw的平均最大落叶百分比与阴性对照相似并且在表12中未给出。表12.美国防虫网室试验中表达tic4064_3的大豆植物的平均最大落叶百分比。
[0147]
如表12中可以看出，表达tic4064_3的植物在防治sbl和vbc方面是有效的。此外，表达tic4064_3的植物表现出对saw的阻遏。
[0148]
另外在阿根廷的两个地点布宜诺斯艾利斯弗兰路易斯(fran luis,ba)和布宜诺斯艾利斯佩尔加米诺(pergamino,ba)对表达tic4064_3和tic4064_4的大豆植物进行了防虫网室试验。防虫网室试验以与美国的那些类似的方式进行。防虫网室中的每个地块包括一行两(2)米的一行四十二(42)颗种子。每个事件在防虫网室中由三(3)个随机定位的独立地块代表。针对指定的鳞翅目害虫进行防虫网室试验。
[0149]
在植物发育的不同阶段评估落叶百分比。对于sbl，在布宜诺斯艾利斯弗兰路易斯在r5.0、r5.5和r6.0发育阶段并且在布宜诺斯艾利斯佩尔加米诺在r4.0、r5.1和r5.6发育阶段评估落叶百分比。对于vbc，在布宜诺斯艾利斯弗兰路易斯在r5.5、r6.0和r6.5发育阶段并且在布宜诺斯艾利斯佩尔加米诺在r5.0、r5.6和r6.0发育阶段评估落叶百分比。对于sfl，在布宜诺斯艾利斯弗兰路易斯在r5.0、r5.3、r5.5和r6.0发育阶段并且在布宜诺斯艾利斯佩尔加米诺在r3.0、r4.0、r5.2和r6.2发育阶段评估落叶百分比。对于sapw，在布宜诺斯艾利斯弗兰路易斯在r4.4、r5.1、r5.5和r6.0发育阶段并且在布宜诺斯艾利斯佩尔加米诺在r3.0、r4.0、r5.1、r6.2发育阶段评估落叶百分比。如上确定每种害虫在每个地点的最大落叶百分比。表13示出表达tic4064_3和tic4064_4的植物的平均最大落叶百分比。表13.阿根廷防虫网室试验中表达tic4064_3和tic4064_4的大豆植物的平均最大落叶百分比。
[0150]
如表13中可以看出，表达tic4064_3和tic4064_4的大豆植物对sbl、vbc和sfl有效，并表现出对sapw的阻遏。
[0151]
tic4064_3tic4064_4对sbl、vbc和sfl有效，并提供对saw和sapw的阻遏。
[0152]
本文公开并且要求保护的所有组合物可以根据本公开在无需过度实验的情况下进行和实施。虽然已经根据前述例示性实施方案描述了本发明的组合物，但是对于本领域技术人员来说将显而易见的是，可对本文所述的组合物应用变型、变化、修改和变更，而不脱离本发明的真实观念、精神和范围。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学上相关的某些剂可取代本文所述的剂，而将获得相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类类似的取代和修改均被认为是在附加的权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
[0153]
在说明书中引用的所有出版物和公布的专利文件通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指示通过引用并入一般。

技术特征：
1.一种重组核酸分子，其包含可操作地连接至编码杀虫蛋白或其杀虫片段的多核苷酸区段的异源启动子，其中，任选地：a.所述杀虫蛋白包含如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52所示的氨基酸序列；b.所述杀虫蛋白包含与如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或约100％同一性的氨基酸序列；或c.所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有如seq id no:7、seq id no:9、seq id no:1、seq id no:3、seq id no:5、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29、seq id no:31、seq id no:33、seq id no:35、seq id no:37、seq id no:39、seq id no:41、seq id no:43、seq id no:45、seq id no:47、seq id no:49或seq id no:51所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交。2.如权利要求1所述的重组核酸分子：a.其在植物细胞中表达以产生杀虫有效量的所述杀虫蛋白或杀虫片段；或b.与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒以及细菌或酵母人工染色体。3.如权利要求1所述的重组核酸分子，其存在于宿主细胞内，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞和植物细胞组成的组。4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌的属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌属是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌，并且所述埃希氏菌属是大肠杆菌。6.如权利要求2所述的重组核酸，其中所述植物细胞是双子叶或单子叶植物细胞。7.如权利要求6所述的重组核酸，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：紫花苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、蛇麻子、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白质表现出针对鳞翅目昆虫的活性。
9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述鳞翅目昆虫选自由以下组成的组：黑粘虫(考斯夜蛾)、小地老虎(球菜夜蛾)、玉米穗虫(谷实夜蛾)、欧洲玉米螟(玉米螟)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部粘虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆夜蛾)、西南玉米螟(西南玉米杆草螟)、向日葵尺蠖(两色髯须夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和黧豆毛虫(黎豆夜蛾)。10.一种包含如权利要求1所述的重组核酸分子的植物，或其部分。11.如权利要求10所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，或其部分。12.如权利要求10所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的组：紫花苜蓿、香蕉、大麦、豆类、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、蛇麻子、韭菜、生菜、火炬松、小米、瓜类、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香、甘薯、柳枝稷、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。13.如权利要求10所述的植物，其中所述植物的其所述部分是种子并且其中所述种子包含所述重组核酸分子。14.一种昆虫抑制组合物，其包含如权利要求1所述的重组核酸分子。15.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，其还包含编码不同于所述杀虫蛋白的至少一种其他杀虫剂的核苷酸序列。16.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制蛋白、昆虫抑制dsrna分子、化学分子和辅助蛋白，其中所述至少一种其他杀虫剂与所述杀虫蛋白或其杀虫片段对相同害虫有毒。17.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。18.如权利要求15所述的昆虫抑制组合物，其中所述至少一种其他杀虫蛋白选自由以下组成的组：cry1a、cry1ab、cry1ac、cry1a.105、cry1ae、cry1b、cry1c、cry1c变体、cry1d、cry1e、cry1f、cry1a/f嵌合体、cry1g、cry1h、cry1i、cry1j、cry1k、cry1l、cry2a、cry2ab、cry2ae、cry3、cry3a变体、cry3b、cry4b、cry6、cry7、cry8、cry9、cry15、cry34、cry35、cry43a、cry43b、cry51aa1、et29、et33、et34、et35、et66、et70、tic400、tic407、tic417、tic431、tic800、tic807、tic834、tic853、tic900、tic901、tic1201、tic1415、tic2160、tic3131、tic836、tic860、tic867、tic869、tic1100、vip3a、vip3b、vip3ab、axmi-88、axmi-97、axmi-102、axmi-112、axmi-117、axmi-100、axmi-115、axmi-113和axmi-005、axmi134、axmi-150、axmi-171、axmi-184、axmi-196、axmi-204、axmi-207、axmi-209、axmi-205、axmi-218、axmi-220、axmi-221z、axmi-222z、axmi-223z、axmi-224z和axmi-225z、axmi-238、axmi-270、axmi-279、axmi-345、axmi-335、axmi-r1及其变体、ip3及其变体、dig-3、dig-5、dig-10、dig-657、dig-11蛋白、idp102aa及其同源物、idp110aa及其同源物、tic868、cry1da1_7、bcw003、tic1100、tic867、tic867_23、tic6757、tic7941、idp072aa、tic5290、tic3668、tic3669、tic3670、idp103及其同源物、pip-50和pip-65及其同源物、pip-83及其同源物以及cry1b.34。19.如权利要求14所述的昆虫抑制组合物，其定义为包含表达杀昆虫有效量的所述杀
id no:11、seq id no:13、seq id no:15、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:21、seq id no:23、seq id no:25、seq id no:27、seq id no:29或seq id no:31，或编码包含与如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30或seq id no:32所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或约100％同一性的氨基酸序列的杀虫蛋白的序列同源或互补；b.使所述样品和所述探针经受严格杂交条件；以及c.检测所述核酸探针与所述多核苷酸区段的杂交。26.一种检测包含蛋白质的样品中杀虫蛋白或其片段的存在的方法，其中所述杀虫蛋白包含如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52所示的氨基酸序列；或所述杀虫蛋白包含与如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52所示的氨基酸序列具有至少98％或99％或约100％同一性的氨基酸序列；所述方法包括：a.使所述样品与免疫反应性抗体接触；以及b.检测所述杀虫蛋白或其片段的存在。27.如权利要求26所述的方法，其中所述检测步骤包括elisa或蛋白质印迹。28.一种杀虫有效量的蛋白质，其包含如seq id no:8、seq id no:10、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:6、seq id no:12、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:18、seq id no:20、seq id no:22、seq id no:24、seq id no:26、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:32、seq id no:34、seq id no:36、seq id no:38、seq id no:40、seq id no:42、seq id no:44、seq id no:46、seq id no:48、seq id no:50或seq id no:52所示的氨基酸序列。

技术总结
公开了对鳞翅目害虫物种表现出抑制、阻遏和毒性活性的杀虫蛋白，并且包括但不限于TIC4064和TIC4064氨基酸序列变体。提供了DNA构建体，其包含编码一种或多种所公开的杀虫蛋白的重组核酸序列。提供了抗鳞翅目昆虫侵袭的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，其包含编码本发明的杀虫蛋白的重组核酸序列。还提供了用于检测生物样品中本发明的重组核酸序列或蛋白质的存在的方法，以及使用TIC4064和TIC4064氨基酸序列变体杀虫蛋白中的任一种防治鳞翅目物种害虫的方法。治鳞翅目物种害虫的方法。


技术研发人员：D
受保护的技术使用者：孟山都技术公司
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2023/8/31