恙虫病诊断用组合物及包含该组合物的试剂盒的制作方法

1.本发明涉及恙虫病诊断用组合物及用于检测其的组合物。具体地，可使用包括于本发明的组合物的引物组，更准确地检测作为恙虫病的致病菌的恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi)，迅速并低廉地诊断恙虫病。


背景技术：

2.恙虫病是由恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi)引起的急性发热性传染病，当人类被感染恙虫病菌的恙虫叮咬时会感染。被恙虫叮咬的部位会结痂，一开始不会痛，所以在多数情况下本人并不知情。经过1至2周的潜伏期，在发病后5至8天左右，皮疹主要出现在躯干，被恙虫咬的部位出现皮肤溃疡。恙虫病是一种主要发生在东南亚及远东地区的感染病，在韩国，感染者遍布全国。由于主要在树丛中感染，因此季节上多发于深秋季节，冬季不发生，主要感染者为农村地区、户外活动多的人群、军人等。
3.经过1～2周的潜伏期，出现高烧、恶寒、头痛、皮疹及淋巴结肿大等症状，皮疹在发病后5～8天左右主要发生在躯干，可出现肝脾肿大、结膜充血等。被恙虫叮咬的皮肤周围形成溃疡或结痂。部分患者无结痂，发热时间短，皮疹出现较多。
4.在急性热性疾病中，若皮肤上有被虫子叮咬的痕迹，所属淋巴结变大、出疹，则怀疑是恙虫病，并且若患者有去过灌木丛的经历，即，野营或野外作业、登山、钓鱼等，则基本上被诊断为恙虫病。然而，即使不去草丛较多的野外，也有被感染的人，而且并非所有症状都会出现，因此仅凭症状很难诊断出恙虫病。
5.此外，在韩国，由恙虫介导的感染病有重症发热伴血小板减少综合征(sfts)，由于其症状与恙虫病相似，很难进行诊断。两种疾病均出现高烧及全身疼痛，这些症状经常被误诊为是重感冒而延误诊断。因此，需要开发一种可快速、准确地诊断恙虫病的手段。


技术实现要素：

6.发明要解决的问题
7.本发明的目的在于，提供一种恙虫病诊断用引物组。
8.本发明的另一目的在于，提供一种包含上述引物组的恙虫病诊断用组合物。
9.本发明的又一目的在于，提供一种包含上述引物组的恙虫病诊断用试剂盒。
10.本发明的又一目的在于，提供一种使用上述引物组从生物试样中诊断恙虫病的方法。
11.用于解决问题的手段
12.用于解决上述问题的一个实现例提供一种引物组，其包含6个引物，各个引物由seq id no.1至seq id no.6的碱基序列表示。
13.上述引物组用于诊断恙虫病，更具体地，可以是用于检测作为恙虫病的致病菌的恙虫病东方体(orientiatsutsugamushi)。
14.已知上述恙虫病东方体包括吉列姆(gilliam)、卡普(karp)、加滕(kato),在韩国
inner primer，fip)及反向内引物(backward inner primer，bip)组成，并由与正向及反向碱基序列对应的核苷酸组成，以制备环介导等温扩增反应所必需的环(loop)。虽然这些内引物不包含在病毒rna中，但为了提高反应的效率性，可设计成还包含特定碱基，例如，一系列胸腺嘧啶碱基。额外2种引物由两种引物即正向环(forward loop，loopf)引物及反向环(backward loop，loopb)引物组成，通过粘附于内(inner)引物不结合的碱基序列(环部位)来加速环介导等温扩增反应。上述环介导等温扩增方法是内引物先与模板结合并延伸，然后外引物沿着各dna螺旋的外侧结合并延伸。此时，由于外引物的延伸而发生链(strand)位移，因此首先合成的链从模板上脱离，脱离的合成链从5'端开始形成环(loop)结构，接着在3'端也以相同的过程形成环结构，并以此为介导发生扩增反应。上述等温扩增或环介导等温扩增反应可以是逆转录反应。
21.上述等温扩增反应可在50至70℃、52至70℃、52至68℃、52至65℃、55至65℃、50至60℃、或65℃下执行。并且，上述等温扩增方法可执行10至90分钟、20至90分钟、25至90分钟、10至80分钟、20至80分钟、25至80分钟、10至70分钟、20至70分钟、25至70分钟、10至60分钟、20至60分钟、25至60分钟、或30分钟。
22.在一具体例中，使用上述引物组，可在包含40pg以下、30pg以下、或20pg以下，例如，1pg至40pg、5pg至40pg、10pg至40pg、或20pg至40pg的极少量靶基因的样本中检测出恙虫病东方体菌株。并且，在一般等温扩增反应条件下，可在短时间内检测出恙虫病东方体菌株。例如，使用0.2至1.6μm的上述引物组的各引物，在60至65℃，具体地，在65℃下约30分钟，例如，可进行等温扩增反应30分钟至60分钟、30分钟至50分钟、或30分钟至40分钟，确认检测结果。在上述引物组中，具体地，优选为，就fip及bip引物而言，分别以1.6μm使用，就f3及b3引物而言，分别以0.2μm使用，以及就fl及bl引物而言分别以0.4μm使用。由于等温扩增反应需要在等温这一受限的环境中尽快导出结果，因此引物的组合及各组分比例是获得显著反应结果的重要因素。
23.本发明的另一具体例包括恙虫病诊断用组合物或试剂盒，其包含上述引物组。
24.上述恙虫病诊断用组合物或试剂盒还可包含用于执行等温扩增反应的适合的反应物及试剂。这种反应物及试剂可包含例如，额外引物、dntp及酶(dna聚合酶或逆转录酶)等，为了反应的效率，还可包含无机盐类或表面活性剂，如氯化钾、硫酸镁、硫酸铵。在一具体例中，上述反应物及试剂可以是包含10至20mm的tris-hcl、1至10mm的(nh4)2so4、10至50mm的kcl、0.1至2mm的mgso4、及0.01至0.1％的tween-20的溶液，更具体地，可以是包含20mm的tris-hcl、10mm的(nh4)2so4、50nm的kcl、2mm的mgso4、及0.1％的tween-20的ph7至9的溶液，ph优选为8.8。
25.在一具体例中，上述恙虫病诊断用组合物或试剂盒还可包含可肉眼确认反应结果物的试剂。然而，试剂通常可使用已知或商业上可购买的，例如，有比色环介导等温扩增方法预混液(colorimetric lamp mix)，但不限于此。为了确保反应有效发生，这种试剂可包含如上所述的tris-hcl、(nh4)2so4、kcl、mgso4、及tween-20。
26.为了准确地读取诊断结果，上述恙虫病诊断用组合物或试剂盒还可包括阴性对照物质及阳性对照物质。作为阴性对照物质，可使用与恙虫病东方体无关的模板rna或dna，作为阳性对照物质，可使用从恙虫病东方体感染患者获得的生物试样或与部分恙虫病东方体菌基因组对应的模板rna或dna。这些对照物质可根据需要在一个管中与生物试样一起或单
独地适用于基因扩增反应。
27.本发明的另一具体例提供一种诊断恙虫病的方法，包括如下的步骤：混合上述引物组及生物试样；以及将上述混合液用等温扩增反应扩增基因。
28.上述生物试样是从作为检查对象的个体中获取的，可通过鼻拭子或咽拭子或鼻腔冲洗获得的，可使用支气管灌洗或吸出物、气管之间吸出物及支气管活检、咳痰、支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage)、唾液、血液、尿液、粪便等。
29.为了提高扩增反应的效率，上述生物试样可进行预处理。预处理可以是用水稀释10倍、50倍、100倍、200倍、或400倍，可以是处理蛋白酶k(proteinase k)，然后进行热处理，可以是使用通常已知的方法，如阴离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、液相色谱法、连续提取、离心或凝胶电泳等，或使用商购的试剂盒，从生物试样中提取基因或纯化至规定水平。当从生物试样中提取rna并使用时，在扩增靶基因之前，还可包括逆转录成cdna的步骤。上述预处理可意味着处理包含0.1％～0.5w/w％的brij-35、10mm～300mm的tris-hcl(ph7.0～8.0)、及1mm～10mm的cacl2的溶液，具体地，可意味着处理包含0.3w/w％的brij-35、100mm的tris-hcl(ph7.5)、及5mm的cacl2的溶液，具体地，可意味着用上述溶液处理后，通过常规方法来纯化，从试样中仅获取基因。上述预处理溶液的组合可容易地从样本中提取基因，可提高本发明的引物组的等温扩增反应效率。
30.上述恙虫病诊断方法包括检测扩增基因的步骤。上述扩增产物的检测可通过使用sybr green i的荧光测定、酚红等指示剂的颜色变化、浊度、沉淀形成、dna梯度(laddering)、毛细管电泳、dna芯片、凝胶电泳、放射性测量或磷光测量来进行，但不限于此。
31.本发明的试剂盒进一步包括装有各反应试剂的容器或用于测试的工具及记载最佳反应进行条件的用户指南等。
32.发明效果
33.可使用本发明的引物组特异性的检测恙虫病，并可使用等温扩增反应迅速准确地进行现场检测。
34.并且，等温扩增反应不需要高价设备及专业人员来调整进行扩增反应的特定温度及条件，因此能够以有效且低廉的费用进行，从而可对多数检查对象进行早期诊断。
附图说明
35.图1为示出使用本发明一个实施例的引物组对恙虫病东方体进行等温扩增反应的检测结果的图像。
36.图2是通过电泳确认使用本发明一个实施例的引物组对恙虫病东方体进行等温扩增反应的检测结果的图像。
37.图3为示出使用本发明一个实施例的引物组通过等温扩增反应以5分钟间隔检测恙虫病东方体的结果的图像及电泳结果。
38.图4是通过颜色变化和电泳确认使用本发明一个实施例的引物组对虚拟患者样本中的恙虫病致病菌进行等温扩增反应的检测结果的图像。
39.图5是使用本发明一个实施例的引物组来通过颜色变化和电泳确认在干扰物质环境下进行等温扩增反应检测虚拟患者样本中的恙虫病致病菌的结果的图像。
40.图6是确认可使用本发明一个实施例的引物组来区分恙虫病及重症发热伴血小板减少综合征患者的图像。
具体实施方式
41.本发明涉及一种恙虫病诊断用引物组，由seq id no.1至seq id no.6的碱基序列表示。
42.以下，为了便于理解本发明，详细说明实施例等。然而，本发明的实施例可变形为各种不同的形式，本发明的范围不应被解释为限于以下实施例。本发明的实施例是为了向本领域的普通技术人员更完整地说明本发明而提供。
43.实施例1：制备引物
44.为了使用环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification，lamp)检测恙虫病东方体而设计并制备引物。通过20个菌株间的blast分析，收集保守区域(conserved region)的基因碱基序列，以确认碱基序列。之后，以此为模板制备外引物、内引物及环引物，将其序列示出在以下表1中。就引物组1而言，为了促进环(loop)形成并提高反应速度，在fip引物和bip引物内部包含4个胸腺嘧啶。
45.表1
[0046][0047]
※
f3：正向引物(forward primer)；b3：反向引物(backward primer)；fip：正向内引物(forward inner primer)；bip：反向内引物(backward inner primer)；lf：正向环引物(forward loop primer)；lb：反向环引物(backward loop primer)
[0048]
实施例2：基因扩增确认
[0049]
上述表1的引物组由与以下表2相同的成分及浓度的引物混合物(primer mix)制备。获取已知在韩国发现的恙虫病东方体(otsutsugamushi)菌株，用包含0.3w/w％的brij-35、100mm的tris-hcl(ph7.5)、及5mm的cacl2溶液对其进行预处理，然后使用dna提取试剂盒(quiagen)，提取dna并进行定量。将所提取的1μl的dna中混合2μl的10x引物混合物(10x primer mix)、10μl的比色法环介导等温扩增2x预混液体(colorimetric lamp 2x master mix)(生物实验公司(biolabs inc))、及7μl的单蒸水(dh2o)，制备成共20μl的混合液。对照组中未加入模板dna。上述混合液具有如下表3所示的成分。将制
备的混合液在65℃下进行等温扩增反应30分钟，然后停止反应，用肉眼确认颜色变化。
[0050]
结果表明，就引物混合物1而言，在等温扩增反应中用肉眼观察到最明显颜色变化，验证额外的扩增效果。
[0051]
表2
[0052]
引物10x浓度(stock)(μm)1x浓度(final)(μm)fip161.6bip161.6f320.2b320.2lf40.4lb40.4
[0053]
表3
[0054] dna靶检测组对照组比色法环介导等温扩增2x预混液体10μl10μl引物混合物(10x)2μl2μl靶dna1μl0dh2o7μl8μl总体积20μl20μl
[0055]
试验例1：分析能力评价
[0056]
使用在上述实施例2中选择的引物组1，对本发明引物组的分析能力进行评价。
[0057]
具体地，通过载体克隆在实施例1中获取的保守区域的基因碱基序列(约700bp)来获得模板(恙虫病东方体阳性对照(orientia tsutsugamushi positive control))，使用其连续稀释至20pg、30pg及40pg，按浓度准备各1μl。其中，以与上述实施例2相同的方式进行了等温扩增反应。之后，用肉眼确认颜色变化，通过电泳确认结果。若反应产物的颜色维持粉红色，则判断为阴性，若反应产物的颜色变为黄色，则判断为阳性。并且，通过电泳直接确认扩增产物。
[0058]
结果表明，如图1所示，在所有试验的浓度下，反应产物的颜色都变为黄色，如图2所示，可通过电泳确认扩增产物的存在。
[0059]
试验例2：分析特异性评价
[0060]
使用在上述实施例2中选择的引物组1，对本发明引物组针对恙虫病东方体(o.tsutsugamushi)的分析特异性进行评价。
[0061]
作为本评价的对照组，使用了通过恙虫针对人类诱发相似症状疾病的红斑热立氏立克次体(rickettsia rickettsii)、伤寒立克次体(rickettsia typhi)、伯氏疏螺旋体病致病菌(borrelia burgdorferi)、问号钩端螺旋体(leptospira interrogans)、及作为重症发热伴血小板减少综合征致病菌的布尼亚病毒(bunyavirus)。如实施例2所示，从各菌株中提取核算并用作模板。分别对恙虫病东方体及上述对照组使用5pg水平的模板，分别使用上述表1的引物组1至3，以与上述实施例2相同的方式准备用于扩增反应的混合液，并进行等温扩增反应。用肉眼确认反应产物的颜色变化，通过电泳再次验证。结果表明，就使用引物组1而言，在对照组中未观察到颜色变化，仅在恙虫病东方体中观察到颜色变化为黄色。
相反，就引物组2而言，虽然相对于恙虫病东方体颜色较浅，但在包含立氏立克次体和布尼亚病毒的试样中观察到轻微的颜色变化，就引物组3而言，观察到恙虫病东方体水平的颜色变化。
[0062]
因此，确认了本发明的引物组具有诊断恙虫病的特异性。
[0063]
试验例3：分析能力评价
[0064]
使用在上述实施例2中选择的引物组1，对本发明的引物组的分析能力进行评价。
[0065]
具体地，将5pg模板以与试验例1相同的方式使用为模板，与实施例2相同的方式准备用于扩增反应的混合液，以5分钟的间隔进行5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、及40分钟的等温扩增反应。作为阴性对照组的ntc进行扩增反应40分钟。之后，用肉眼确认颜色变化，通过电泳确认结果。若反应产物的颜色维持粉红色，则判断为阴性，若反应产物的颜色变为黄色，则判断为阳性。
[0066]
结果表明，如图3所示，30分钟后反应产物的颜色变为黄色，据此，可通过电泳确认扩增产物的存在。
[0067]
试验例4：使用虚拟样本的分析能力评价
[0068]
为了评价是否可对实际临床样本进行分析，通过制备虚拟样本来评价本发明的引物组的分析能力。
[0069]
样本取自15名从未被恙虫叮咬或感染恙虫病的健康人的鼻咽和口咽部，各样本分为两组(8个样本、7个样本)，然后在8个样本组中混合与在试验例1中制备的相同的模板5pg，并用作虚拟患者样本。使用上述15个试样准备用于扩增反应的混合液，进行等温扩增反应。
[0070]
结果表明，如图4所示，反应产物的颜色仅在虚拟患者样本中变为黄色，在剩余试样中颜色不变。因此，确认了即使在实际临床样本中也可发挥优异的分析能力。
[0071]
试验例5：使用干扰物质的分析能力评价
[0072]
确认分析能力是否会受到可在实际临床样本中混合的各种生物成分及可流入样本的纯化的溶剂等的影响。
[0073]
将取自上述试验例4中并制备的15人的样本分成3组，每组5个样本，然后一组不加干扰物质，另外两组分别混合0.1v/v％的人全血及0.1v/v％的乙醇。接着，各组的样本分成两个试样，仅将一个试样以与试验例4相同的方式制备成虚拟患者样本，准备用于扩增反应的混合液，进行等温扩增反应。
[0074]
结果表明，如图5所示，在所有3个组中，反应产物的颜色仅在虚拟患者样本中变为黄色，在剩余试样中颜色不变。因此，确认了即使在可能影响分析能力的环境下，也可发挥优异的分析能力。
[0075]
试验例6：诊断准确度的交叉试验
[0076]
在韩国，由恙虫介导的感染病有恙虫病及重症发热伴血小板减少综合征(sfts)，由于两种疾病的症状相似，很难进行诊断。因此，确认了本发明是否可准确地诊断恙虫病。
[0077]
具体地，分离由结痂是否形成及血小板是否减少等来区分的患者群体，将由此获得的血液作为试样，以与实施例2相同的方式准备用于扩增反应的混合液，进行等温扩增。
[0078]
结果表明，如图6所示，确认可在各区分的患者群体中准确地识别恙虫病及重症发热伴血小板减少综合征。
[0079]
工业实用性
[0080]
本发明涉及恙虫病诊断用组合物及用于检测其的组合物。具体地，可使用包括可检测诱发恙虫病的细菌的引物组的组合物及试剂盒，更准确地检测作为恙虫病的致病菌的恙虫病东方体(orientia tsutsugamushi)，迅速并低廉地诊断恙虫病。
[0081]
[0082]
[0083]

技术特征：
1.一种恙虫病诊断用引物组，其特征在于，由seq id no.1至seq id no.6的碱基序列表示。2.根据权利要求1所述的恙虫病诊断用引物组，其特征在于，上述引物组能够通过环介导等温扩增诊断恙虫病。3.根据权利要求1所述的恙虫病诊断用引物组，其特征在于，上述引物组用于检测恙虫病东方体。4.一种恙虫病诊断用组合物，其特征在于，包含根据权利要求1所述的引物组。5.一种恙虫病诊断用试剂盒，其特征在于，包含根据权利要求4所述的组合物。6.一种恙虫病诊断方法，其特征在于，包括如下的步骤：混合根据权利要求4所述的组合物及生物试样；以及通过上述混合液的等温扩增反应扩增基因。7.一种恙虫病诊断装置，其特征在于，包含根据权利要求4所述的组合物。

技术总结
本发明涉及恙虫病诊断用引物组及包含其的组合物。具体地，可使用包括可检测诱发恙虫病的细菌的引物组的组合物及试剂盒，更准确地检测作为恙虫病的致病菌的恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi)，迅速并低廉地诊断恙虫病。恙虫病。恙虫病。


技术研发人员：金钟喆
受保护的技术使用者：艾德纽特丽珍公司
技术研发日：2021.10.20
技术公布日：2023/8/31