一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用

一种抗鸡cd86单克隆抗体的制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及一种抗鸡cd86单克隆抗体的制备方法及应用，具体涉及重组蛋白表达、单克隆抗体的制备及其应用，属于禽免疫学、生物制品和诊断试剂领域。


背景技术：

2.cd86作为一种关键的免疫共刺激分子，通常表达于巨噬细胞(mφ)、树突状细胞(dc)以及活化的b细胞表面[1]。在t细胞通过tcr-多肽-mhc复合物发生活化时，cd86可与另一个共刺激分子cd80形成异源二聚体，之后与t细胞上的cd28或ctla-4受体相结合，提供t细胞活化或抑制的第二个共刺激信号；该信号轴在启动、维持和调节t细胞活化、增殖或抑制等方面具有至关重要的作用[2]。目前人和鼠cd86已得到深入研究，利用抗人或鼠cd86抗体能够深入研究抗原提呈细胞(如mφ、dc等)的表型和功能以及t细胞激活机制[3]。然而，截至目前，关于禽类特别是鸡cd86(chcd86)的研究仍十分匮乏。由于缺乏功能性的抗chcd86抗体，至今不能准确定义和研究鸡抗原递呈细胞的表型和功能。
[0003]
在小鼠上，cd86基因编码一个由309个氨基酸组成的糖蛋白，分子量为34.7kda，其包含一个23个氨基酸的信号肽，具有明确的胞内区，跨膜区和胞外区定位，其胞外区约为第24-244位氨基酸；天然的cd86蛋白高度糖基化，分子量约为70kda之间[4]。相较之下，鸡cd86基因编码区包含875个碱基，编码283个氨基酸，包含一个19个氨基酸的信号肽以及5～6个糖基化位点。通过tmhmm-2.0网址预测鸡cd86胞外区序列约为第20-244位氨基酸，与小鼠胞外区序列基本一致。但目前尚不清楚天然的鸡cd86蛋白的真正分子量大小。
[0004]
cd86在t细胞免疫应答中发挥关键作用。有研究表明，cd86与t细胞表面受体cd28的结合能够刺激t细胞活化并启动适应性免疫应答[5]。在肿瘤免疫中，通过阻断cd86与t细胞表面受体ctla-4的结合，促进t细胞激活，能够有限抑制肿瘤的生长，起到了抗肿瘤作用[6]。在移植排斥反应中，cd86和ctla-4通路在控制t细胞对外来抗原反应中扮演着重要角色，为移植排斥反应研究提供了新的靶点。
[0005]
在本发明中，我们公开了一种的鸡cd86真核及原核重组蛋白制备方法，制备了抗鸡cd86单克隆抗体1c2。该单抗经western blot等技术可特异性识别鸡cd86真核及天然蛋白，并能用于流式细胞术检测鸡巨噬细胞膜表面表达的cd86蛋白。该单抗的获得为研究禽免疫学提供了重要工具。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种抗鸡cd86单克隆抗体的制备方法及应用，用以解决上述背景技术提出的技术问题；本发明要解决的技术问题是成功制备出重组chcd86原核蛋白及真核蛋白。本发明还需解决的技术问题是制备抗鸡cd86的单克隆抗体。并利用该抗体实现检测鸡抗原递呈细胞(巨噬细胞和树突状细胞)表面表达的天然cd86蛋白。
[0007]
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种制备重组鸡cd86蛋白的原核表达方法，将chcd86胞外区片段构建到原核表达载体pet-28a，经转化大肠杆菌中进
行诱导表达，获得重组鸡cd86蛋白。
[0008]
chcd86胞外区序列来自genbank序列(genbank登录号:ef554724.1)。
[0009]
一种制备重组鸡cd86蛋白的真核表达方法，完整的鸡cd86基因被构建到真核表达载体pcaggs(pcaggs-chcd86)，重组质粒转染df-1细胞表达鸡cd86真核蛋白。
[0010]
完整鸡cd86基因序列来自genbank序列(genbank登录号:ef554724.1)。
[0011]
一株抗鸡cd86蛋白单克隆抗体1c2，所述单克隆抗体1c2能够特异性识别真核和原核表达的重组鸡cd 86蛋白以及鸡巨噬细胞表面天然表达的cd86蛋白，并能用于流式细胞术表面染色。
[0012]
所述的抗鸡cd86蛋白单克隆抗体1c2杂交瘤细胞株的制备方法，将所述重组鸡cd86蛋白免疫balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，经所述的真核表达鸡cd86蛋白筛选而获得的单克隆抗体细胞株，即杂交瘤细胞株1c2；
[0013]
所述杂交瘤细胞株1c2保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学；保藏日期为2023年6月18日；保藏编号为cctcc no:c2023173。
[0014]
所述的抗鸡cd86蛋白单克隆抗体1c2用于western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测鸡免疫细胞和组织中cd86表达变化的应用。
[0015]
通过本发明，构建pet28a-ed-chcd86和pcaggs-chcd86质粒，并分别在bl21(de3)菌和df-1细胞中表达chcd86重组蛋白。重组chcd86原核蛋白免疫balb/c小鼠三次，取脾脏与sp2/0细胞融合并筛选出阳性杂交瘤细胞，对不同杂交瘤细胞株分泌的抗体进行chcd86真核蛋白鉴定，并制备腹水、纯化抗体，通过western blot鉴定测定不同抗体与chcd86真核蛋白及天然蛋白的反应性。
[0016]
有益效果：本发明通过原核表达系统制备鸡cd86重组蛋白，并将其作为免疫原制备了抗chcd86单克隆抗体，该抗体能特异性识别chcd86天然蛋白。本发明填补了鸡cd86蛋白免疫检测知识和技术空白，并为研究鸡cd86在生理与病理条件下的表达变化提供了有效工具。本发明中的chcd86抗体易于大量生产，便于后期在养鸡业和家禽免疫学基础研究中的应用。
[0017]
本发明制备了鸡cd86原核重组蛋白，将其作为免疫原通过杂交瘤技术制备了抗鸡cd86单克隆抗体；该抗体能够识别天然的鸡cd86蛋白，并能应用于流式细胞术表面染色。本发明制备的抗鸡cd86单克隆抗体可作为免疫检测工具，检测表达鸡cd86的免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞等。生产的抗鸡cd86单克隆抗体可进行大量制备，并作为一种流式抗体应用于鸡免疫细胞的流式表面染色，在鸡病预防和疫苗开发中具有重要的经济价值。
附图说明
[0018]
图1为pet28a-ed-chcd86重组质粒的构建，包括chcd86 pcr扩增(a)、质粒图谱(b)及质粒酶切鉴定(c)；m:dna marker；1:chcd86；2:pet28a-ed-chcd86质粒双酶切鉴定。
[0019]
图2为chcd86原核表达(a)、蛋白纯化与复性(b)；其中:
[0020]
a图，m:prestained protein ladder；1:pet-28a载体未诱导裂解产物2：pet-28a载体诱导裂解产物3:pet28a-ed-chcd86未诱导组4:pet28a-ed-chcd86诱导裂解产物5:pet28a-ed-chcd86诱导后裂解沉淀6：pet28a-ed-chcd86诱导后裂解上清；
[0021]
b图，m:prestained protein ladder；7:pet28a-ed-chcd86未诱导裂解沉淀8：
pet28a-ed-chcd86诱导后裂解沉淀9：纯化复性后的chcd86蛋白。
[0022]
图3为pcaggs-chcd86真核质粒的构建，包括chcd86 pcr扩增(a)、质粒图谱(b)及质粒酶切鉴定(c)；m:dna marker 1:chcd86-cds；2:pcaggs-chcd86质粒双酶切鉴定。
[0023]
图4为chcd86真核表达的鉴定，包括ifa(a)和western blot(b)；其中：
[0024]
a图，a:pcaggs+阴性血清b:pcaggs+多抗血清c：pcaggs-chcd86+阴性血清d：pcaggs-chcd86+多抗血清；
[0025]
b图，m:prestained protein ladder 1:pcaggs-chcd86转染的df-1细胞上清2：pcaggs-chcd86转染的df-1裂解后细胞。
[0026]
图5为3株chcd86单抗对真核表达chcd86的识别。
[0027]
图6为3株抗chcd86单抗对鸡巨噬细胞膜表面cd86蛋白的识别。
[0028]
图7为3株chcd86单抗与chcd86天然蛋白的反应性；图m:dna marker；1:1c2杂交瘤培养上清；2:1d3杂交瘤培养上清3:3c3杂交瘤培养上清。
[0029]
图8为3株抗chcd86单抗用于流式细胞术检测cd86阳性的巨噬细胞。
具体实施方式
[0030]
为了全面了解和应用本发明，下文将给出参考实施例和附图详细讲述本发明。
[0031]
实施例1chcd86重组蛋白制备；
[0032]
1.chcd86原核蛋白表达；
[0033]
由于鸡cd86包括疏水性氨基酸的跨膜区，故选取易于表达的chcd86胞外区序列。采用primer5.0软件设计chcd86胞外区pcr引物，并引入酶切位点bamhⅰ和xhoⅰ，进行rt-pcr扩增，并克隆到原核表达载体pet-28a中(图1)，最终转化至bl21(de3)表达宿主菌中。
[0034]
pcr引物序列：
[0035]
f:5’ggatcc(bamhi)aacgtacatcacgtgaagtcatttctc-3’；
[0036]
r:5’ctcgag(xhoi)tcacttcaccggttccatttcttctgc-3’；
[0037]
将含有pet-28a空载体质粒以及含目的基因的质粒转化至bl21(de3)宿主菌经iptg小量诱导后，分别提取细菌裂解上清蛋白和菌体蛋白；经sds-page分析发现chcd86重组蛋白大量表达于细菌裂解沉淀中。取200ml菌液经iptg大量诱导后，冰水浴超声30min，离心弃上清，15ml 8m尿素重悬并溶解沉淀，冰水浴继续超声15min，离心后收集上清。根据ni sepharose柱说明书进行变性条件下的his标签蛋白的纯化，纯化后的蛋白经过梯度尿素缓冲液进行透析复性，最后超滤得到chcd86原核重组蛋白(图2)。
[0038]
实施例2chcd86真核蛋白的表达；
[0039]
2.chcd86真核蛋白表达；
[0040]
制备鸡脾脏单个核细胞，经lps(200ng/ml)刺激12h后，提取rna，并反转录成cdna作为模板。根据ncbi上chcd86编码区序列设计引物，并引入ecori和xhoi酶切位点，进行rt-pcr扩增，并克隆到pcaggs质粒(图3)，并提取超纯质粒。
[0041]
pcr引物序列：
[0042]
f:5’gaattc(ecori)atggaggtctgcatattctttctttatgccataatac t-3’；
[0043]
r:5’gatcc(xhoi)ttacttcaccggttccatttcttctgccggtatct-3’；
[0044]
将目的质粒转染至df-1细胞内，经间接免疫荧光(ifa)和western blot检测，df-1
细胞中有chcd86重组蛋白产生(图4)。
[0045]
实施例3抗chcd86单克隆抗体的制备；
[0046]
单抗制备的主要步骤有：小鼠免疫、细胞融合、筛选阳性杂交瘤细胞、细胞亚克隆、抗体亚类鉴定、制备腹水及纯化抗体。
[0047]
1.阳性杂交瘤细胞的筛选；
[0048]
选用6周龄雌性balb/c小鼠，初次免疫以50μg原核表达的chcd86蛋白与弗氏完全佐剂混合并充分乳化，二免、三免均以50μg原核表达的chcd86蛋白与弗氏不完全佐剂混合并充分乳化。每次免疫方式均为腹腔注射，免疫间隔时间为两周，三免后第7天尾静脉采血测定多抗血清效价后，选取效价较高的小鼠进行冲击免疫，冲击免疫3天后，在50％ peg-1500条件下将sp2/0细胞与小鼠脾细胞进行融合，并加入到含hat培养基的饲养细胞中，置于细胞培养箱进行培养。5天后半换液，10天全换液，全换液使用含有ht的dmem完全培养液。
[0049]
通过elisa和ifa两种检测方法5块96孔板中的阳性孔，将elisa和ifa双阳性的孔作为阳性杂交瘤，采取有限稀释法进行2～3次亚克隆，最后扩大培养，并冻存。收集单抗杂交瘤细胞培养上清，使用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒进行亚类鉴定。
[0050]
2.单抗腹水制备及纯化方法；
[0051]
选取8～10周龄的balb/c公鼠，腹腔注射0.5ml降植烷，7～10天后腹腔接种5
×
105个阳性杂交瘤细胞。接种后5～7天观察腹部，若腹部明显膨胀，则可以进行腹水采集，两天采集一次，将腹水离心去除沉淀物，收集上清，测效价，-80℃保存。最后使用protein a+g预装柱进行腹水纯化。
[0052]
实施例4chcd86克隆抗体与真核表达chcd86反应性；
[0053]
将pcaggs-chcd86质粒转染df-1细胞中，30h后弃掉培养基，pbs洗涤2次，用-20℃预冷的甲醇丙酮混合液(1:1)固定5min，经5％脱脂乳室温封闭1h后，孵育不同杂交瘤细胞培养上清、无单抗(control)，37℃孵育2h，洗涤3次，室温孵育goat-anti-mouse igg af488二抗45min，洗涤5次，于倒置荧光显微镜下观察。结果(图5，表1)表明，不同chcd86单克隆抗体均能与真核chcd86反应,其中单抗1c2亚型为igg1,κ；单抗1d3及3c3均为igg1,κ亚型。
[0054]
实施例5不同chcd86单克隆抗体与鸡巨噬细胞膜表面cd86蛋白的反应性；分离鸡外周血单个核细胞，于96孔平底板中贴壁培养12h，弃上清，保留孔底贴壁的巨噬细胞，pbs洗涤2次，使用-20℃预冷的甲醇丙酮混合液(1:1)固定5min，经2％鸡血清室温封闭1h后，孵育不同杂交瘤细胞培养上清，4℃孵育过夜后，洗涤3次；室温孵育goat-anti-mouse igg af488荧光二抗45min，洗涤5次；最后室温孵育dapi染液10min，于倒置荧光显微镜下观察结果(图6)。
[0055]
实施例6不同chcd86单克隆抗体与天然的chcd86蛋白的反应性；
[0056]
取鸡pbmc，贴壁培养12h后，分离贴壁的巨噬细胞，提取细胞蛋白，加入5
×
loading buffer，样品于99℃金属浴中煮样10min后，12000
×
g离心1min后，即为chcd86天然蛋白样品。后进行wb检测，pvdf膜经5％脱脂乳室温封闭1h后，4℃过夜孵育不同单克隆抗体，孵育完成后，使用tbst溶液洗涤3遍后，孵育hrp goat anti-mouse二抗(1:10000)37℃，45min，tbst洗3遍后加入化学显影液进行显影。图7结果显示，不同单克隆抗体与chcd86天然蛋白进行反应，大小约为65kda。
[0057]
实施例7不同chcd86单克隆抗体应用于流式细胞术表面染色；
[0058]
取鸡pbmc，贴壁培养12h后，分离贴壁的巨噬细胞并进行细胞计数，将其浓度调整为20
×
106/ml，各取100μl加入至96孔v型板中进行流式细胞术表面染色。首先将不同的单克隆抗体作为一抗，室温孵育1h，0.5％ bsa洗涤，再室温孵育goat-anti-mouse igg(af647)二抗(1：1000)45min，0.5％ bsa洗涤3次，最后室温孵育鸡kul-01(pe)抗体(1：100)30min，0.5％ bsa洗涤，于流式细胞仪上机检测。图8结果显示，3株单抗(1c2、1d3、3c3)有明显的cd86
+
细胞分群。
[0059]
表1.抗chcd86单抗ig亚型鉴定与腹水效价测定
[0060][0061]
参考文献：
[0062]
[1]陈洁,孙中文.cd80和cd86介导的共刺激信号的比较及其生物学作用[j].国际免疫学杂志,2006,(01):1-4.
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技术特征：
1.一种制备重组鸡cd86蛋白的原核表达方法，其特征在于，将鸡cd86胞外区片段构建到原核表达载体pet-28a，经转化大肠杆菌中进行诱导表达，获得重组鸡cd86蛋白。2.根据权利要求1所述的一种制备重组鸡cd86蛋白的原核表达方法，其特征在于，鸡cd86胞外区序列来自genbank序列(genbank登录号: ef554724.1)。3.一种制备重组鸡cd86蛋白的真核表达方法，其特征在于，完整的鸡cd86基因被构建到真核表达载体pcaggs上，重组质粒（pcaggs-chcd86）转染df-1细胞表达鸡cd86真核蛋白。4.根据权利要求3所述的一种制备重组鸡cd86蛋白的真核表达方法，其特征在于，完整的鸡cd86基因序列来自genbank序列(genbank登录号: ef554724.1)。5.一株抗鸡cd86蛋白单克隆抗体1c2，其特征在于，所述单克隆抗体1c2能够特异性识别真核和原核表达的重组鸡cd 86蛋白以及鸡巨噬细胞表面表达的天然cd86蛋白，并能用于流式细胞术表面染色。6.权利要求5所述的抗鸡cd86蛋白单克隆抗体1c2杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述重组鸡cd86蛋白免疫balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，经权利要求3所述的真核表达鸡cd86蛋白筛选而获得的单克隆抗体细胞株，即杂交瘤细胞株1c2；所述杂交瘤细胞株1c2保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉，武汉大学；保藏日期为2023年6月18日；保藏编号为cctcc no: c2023173。7.权利要求5所述的抗鸡cd86蛋白单克隆抗体1c2用于western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术检测鸡免疫细胞和组织中cd86表达的应用。

技术总结
本发明涉及一种抗鸡CD86单克隆抗体的制备方法及应用，通过原核表达系统制备鸡CD86重组蛋白，并将其作为免疫原制备了抗chCD86单克隆抗体，该抗体能特异性识别chCD86天然蛋白。本发明填补了鸡CD86蛋白免疫检测的知识和技术空白，并为研究CD86在鸡生理与病理条件下的表达变化提供了有效工具。本发明中的chCD86抗体易于大量生产，便于后期在养鸡业和家禽免疫学基础研究中的应用。学基础研究中的应用。学基础研究中的应用。


技术研发人员：商绍彬 尹诗 贺双江 郝小利 杨奕
受保护的技术使用者：扬州大学
技术研发日：2023.06.25
技术公布日：2023/8/31