一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法与流程

1.本发明涉及一种鉴别翘嘴鳜的方法。


背景技术：

2.翘嘴鳜(siniperca chuatsi)隶属于鲈形目(perciformes)真鲈科(percichthyidae)鳜属(siniperca)，其肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富、无肌间刺，是我国特有的名优淡水经济鱼类，也是重要的名优鱼类养殖对象。翘嘴鳜在黑龙江、长江、珠江等流域均有分布，以珠江流域种群为主的广东省是我国翘嘴鳜的养殖主产地，养殖产量占全国产量的40％，也是翘嘴鳜苗种的主要培育基地和输出地。黑龙江流域翘嘴鳜俗称鳌花，位居东北地区“三花五罗”之首，也是重要的养殖经济鱼类。
3.由于黑龙江流域翘嘴鳜苗种的繁育规模有限，苗种数量无法满足养殖市场需求，导致大量珠江流域的翘嘴鳜苗种流入北方地区养殖。然而，黑龙江流域和珠江流域的翘嘴鳜种群对低温的耐受性差异较大，珠江流域的翘嘴鳜苗种难以适应我国东北高寒地区的低温，致使养殖越冬死亡率高，尤其是大规格鱼种和商品鱼死亡率较高；而黑龙江流域的翘嘴鳜苗种耐寒能力和抗病能力较强，养殖和越冬成活率高。如何有效的解决养殖翘嘴鳜苗种来源不清、种质混杂的问题，成为黑龙江翘嘴鳜养殖中亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明为了解决现有养殖翘嘴鳜苗种来源不清、种质混杂的问题，而提供了一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法。
5.本发明鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法按照以下步骤进行：
6.一、采集翘嘴鳜待检样本；
7.二、提取待检样本基因组dna；
8.三、pcr反应，所用特异标记为gy074、gy112或gy122；
9.四、凝胶电泳判别翘嘴鳜样本种群：
10.gy074扩增图谱中条带大于200bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；gy074扩增图谱中条带小于186bp的个体来源于珠江翘嘴鳜种群；
11.gy112扩增图谱中具有150bp条带的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；gy112扩增图谱中无150bp条带且条带大于160bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；
12.gy122扩增图谱中条带小于138bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜；gy122扩增图谱中条带大于146bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；
13.根据特异标记扩增图谱即实现了黑龙江与珠江翘嘴鳜的鉴别。
14.本发明有益效果：本发明是国内外首次基于分子生物学技术建立的区分翘嘴鳜种群的新方法，成功开发了特异的微卫星共显性标记(gy074、gy112和gy122)，对黑龙江与珠江翘嘴鳜种群进行分析。本发明用于黑龙江与珠江翘嘴鳜种群的鉴别，群体鉴定比例达到100％。本发明方法准确性高、技术重复性好、操作简单、检测效率高，利用本发明的方法对
翘嘴鳜苗种或成鱼的抽检，确定养殖翘嘴鳜种群的来源，解决了现有养殖翘嘴鳜苗种来源不清、种质混杂的问题。利用本发明的方法可以在北方养殖中制定合理的越冬措施，避免因苗种来源造成养殖损失，推动翘嘴鳜养殖产业的健康发展。
附图说明
15.图1为gy074引物扩增图谱；
16.图2为gy112引物扩增图谱；
17.图3为gy122引物扩增图谱。
具体实施方式
18.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
19.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
20.具体实施方式一：本实施方式鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法按照以下步骤进行：
21.一、采集翘嘴鳜待检样本；
22.二、提取待检样本基因组dna；
23.三、pcr反应，所用特异标记为gy074、gy112或gy122；
24.四、凝胶电泳判别翘嘴鳜样本种群：
25.gy074扩增图谱中条带大于200bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；gy074扩增图谱中条带小于186bp的个体来源于珠江翘嘴鳜种群；
26.gy112扩增图谱中具有150bp条带的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；gy112扩增图谱中无150bp条带且条带大于160bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；
27.gy122扩增图谱中条带小于138bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜；gy122扩增图谱中条带大于146bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；
28.根据特异标记扩增图谱即实现了黑龙江与珠江翘嘴鳜的鉴别。
29.具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中翘嘴鳜待检样本为受精卵、幼鱼或成鱼的鳍条。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
30.具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中提取基因组dna的方法：采用有机抽提法或者试剂盒提取，控制消化时间为20～40min，用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μl。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
31.本实施方式严格控制消化时间是为了得到合格的dna样本。
32.具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中gy074的微卫星序列位于翘嘴鳜基因组7号连锁群，其核心重复序列为(gtct)8(atct)
11
；特异标记gy112的微卫星序列位于11号连锁群，其核心重复序列为(acat)
11
；特异标记gy122的微卫星序列位于12号连锁群，其核心重复序列为(caga)
12
。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
33.具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述步骤三中的3个特异标记的微卫星序列及引物序列分别为：
34.gy074微卫星序列如seq id no：1所示：
35.上游引物：5
’‑
ggatgaaccttgctttaggg-3’36.下游引物：5
’‑
tccctttgcagaagaatcgc-3’37.gy112微卫星序列如seq id no：2所示：
38.上游引物：5
’‑
tctttacctggagaggacgg-3’39.下游引物：5
’‑
ggcatgttatggtcaggagg-3’40.gy122微卫星序列如seq id no：3所示：
41.上游引物：5
’‑
atcacccaactgcagattcc-3’42.下游引物：5
’‑
tccacagctaagttagtcgc-3。
43.其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
44.本实施方式鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的特异标记信息如表1所示。
45.表1鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的特异标记信息
[0046][0047][0048]
实施例1采用本发明的方法，对黑龙江流域翘嘴鳜样本采自黑龙江抚远江段(36尾)和广东省清远市宇顺农牧渔业科技服务有限公司珠江流域翘嘴鳜(34尾)进行鉴定，其中珠江流域翘嘴鳜其原始群体采自珠江广东江段。
[0049]
本实施例具体的鉴定方法按照以下步骤进行：
[0050]
一、采集翘嘴鳜待检样本，翘嘴鳜待检样本为鳍条；
[0051]
二、提取待检样本基因组dna；
[0052]
三、pcr反应，所用特异标记为gy074、gy112或gy122；其中gy074的微卫星序列位于翘嘴鳜基因组7号连锁群，其核心重复序列为(gtct)8(atct)
11
；特异标记gy112的微卫星序列位于11号连锁群，其核心重复序列为(acat)
11
；特异标记gy122的微卫星序列位于12号连锁群，其核心重复序列为(caga)
12
；
[0053]
四、聚丙烯酰胺凝胶电泳，读取基因型数据，判别gy074扩增图谱中条带大于200bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；条带小于186bp的个体来源于珠江翘嘴鳜种群；gy112扩增图谱中具有150bp条带的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；无150bp条带且条带大于160bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；gy122扩增图谱中条带小于138bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜；条带大于146bp的个体来源于珠江翘嘴鳜，即实现了黑龙江与珠江翘嘴鳜的鉴别。
[0054]
所述步骤一中剪取上述待检样品部分鳍条组织，编号置于滤纸干燥；
[0055]
所述步骤二中用组织基因组dna提取试剂盒(天根生物)提取dna，用紫外分光度计(nanodrop8000)测定纯度和浓度，调整浓度到50ng/μl。严格控制消化时间是为了得到合格
的dna样本。
[0056]
所述步骤三中的3个特异标记的微卫星序列及引物序列分别为：
[0057]
gy074微卫星序列如seq id no 1所示：
[0058]
上游引物：5
’‑
ggatgaaccttgctttaggg-3’[0059]
下游引物：5
’‑
tccctttgcagaagaatcgc-3’[0060]
gy112微卫星序列如seq id no 2所示：
[0061]
上游引物：5
’‑
tctttacctggagaggacgg-3’[0062]
下游引物：5
’‑
ggcatgttatggtcaggagg-3’[0063]
gy122微卫星序列如seq id no 3所示：
[0064]
上游引物：5
’‑
atcacccaactgcagattcc-3’[0065]
下游引物：5
’‑
tccacagctaagttagtcgc-3’；
[0066]
在用特异标记进行pcr扩增，建立15μl pcr反应体系，包括2
×
pcr mix 7.5μl(含有1u taq dna聚合酶)；上、下游引物(10μmol/l)各0.5μl；dna模板2μl；ddh2o4.5μl。pcr反应程序为94预变性3min；94℃变性30s，退火温度复性30s，72℃延伸30s，25个循环；最后72℃延伸5min。反应结束后，pcr产物加2μl溴酚蓝-二甲苯青载样缓冲液并混合均匀，取1μl pcr混合液用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，0.1％agno3染色，拍照。以dl500(takara公司)作为分子量标准，用gelpro 45软件分析等位基因片段大小，单位为碱基对(bp)。所述步骤四中读取个体基因型数据，图1为gy074引物扩增图谱，gy074扩增图谱中黑龙江流域样本扩增片段为206～214bp，均大于200bp；珠江流域样本扩增片段为166～186bp，均小于186bp。图2为gy112引物扩增图谱，gy112扩增图谱中黑龙江流域样本均扩增出150bp条带；而珠江流域样本扩增片段为162～178bp，并且没有扩增出150bp条带)。图3为gy122引物扩增图谱，gy122扩增图谱中黑龙江流域样本扩增片段为130～138bp，均小于138bp；珠江流域样本的扩增片段为146～150bp，均大于146bp。综合以上3个特异标记的扩增结果，对黑龙江与珠江流域样本的检测准确率达到100％。
[0067]
黑龙江与珠江翘嘴鳜外形相似，多数标记扩增图谱中条带相似或交叉，为寻找到特异性标记带来了干扰，利用本发明成功开发了特异的微卫星共显性标记(gy074、gy112和gy122)，对黑龙江与珠江翘嘴鳜种群进行分析，结果黑龙江与珠江翘嘴鳜两个群体的条带变异范围不同，完成了黑龙江与珠江翘嘴鳜的鉴别。
[0068]
本发明方法准确性高、操作简单，利用本发明的方法对翘嘴鳜苗种或成鱼的抽检，确定养殖翘嘴鳜种群的来源，以便在北方养殖中制定合理的越冬措施，避免因苗种来源造成养殖损失。

技术特征：
1.一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法，其特征在于鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法按照以下步骤进行：一、采集翘嘴鳜待检样本；二、提取待检样本基因组dna；三、pcr反应，所用特异标记为gy074、gy112或gy122；四、凝胶电泳判别翘嘴鳜样本种群：gy074扩增图谱中条带大于200bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；gy074扩增图谱中条带小于186bp的个体来源于珠江翘嘴鳜种群；gy112扩增图谱中具有150bp条带的个体来源于黑龙江翘嘴鳜种群；gy112扩增图谱中无150bp条带且条带大于160bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；gy122扩增图谱中条带小于138bp的个体来源于黑龙江翘嘴鳜；gy122扩增图谱中条带大于146bp的个体来源于珠江翘嘴鳜；根据特异标记扩增图谱即实现了黑龙江与珠江翘嘴鳜的鉴别。2.根据权利要求1所述的一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法，其特征在于步骤一中翘嘴鳜待检样本为受精卵、幼鱼或成鱼的鳍条。3.根据权利要求1所述的一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法，其特征在于步骤二中提取基因组dna的方法：采用有机抽提法或者试剂盒提取，控制消化时间为20～40min，用紫外分光度计测定纯度和浓度，稀释到50ng/μl。4.根据权利要求1所述的一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法，其特征在于步骤三中gy074的微卫星序列位于翘嘴鳜基因组7号连锁群，其核心重复序列为(gtct)8(atct)
11
；特异标记gy112的微卫星序列位于11号连锁群，其核心重复序列为(acat)
11
；特异标记gy122的微卫星序列位于12号连锁群，其核心重复序列为(caga)
12
。5.根据权利要求1所述的一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法，其特征在于步骤三中的3个特异标记的微卫星序列及引物序列分别为：gy074微卫星序列如seq id no：1所示：上游引物：5
’‑
ggatgaaccttgctttaggg-3’下游引物：5
’‑
tccctttgcagaagaatcgc-3’gy112微卫星序列如seq id no：2所示：上游引物：5
’‑
tctttacctggagaggacgg-3’下游引物：5
’‑
ggcatgttatggtcaggagg-3’gy122微卫星序列如seq id no：3所示：上游引物：5
’‑
atcacccaactgcagattcc-3’下游引物：5
’‑
tccacagctaagttagtcgc-3。

技术总结
一种鉴别黑龙江与珠江翘嘴鳜的方法，本发明涉及一种鉴别翘嘴鳜的方法。本发明解决了现有养殖翘嘴鳜苗种来源不清、种质混杂的问题。方法：一、采集翘嘴鳜待检样本；二、提取待检样本基因组DNA；三、PCR反应；四、聚凝胶电泳判别翘嘴鳜样本种群，根据特异标记扩增图谱即实现了黑龙江与珠江翘嘴鳜的鉴别。本发明方法准确性高、技术重复性好、操作简单、检测效率高，利用本发明的方法对翘嘴鳜苗种或成鱼的抽检，确定养殖翘嘴鳜种群的来源，解决了现有养殖翘嘴鳜苗种来源不清、种质混杂的问题。利用本发明的方法可以在北方养殖中制定合理的越冬措施，避免因苗种来源造成养殖损失，推动翘嘴鳜养殖产业的健康发展。产业的健康发展。产业的健康发展。


技术研发人员：孙志鹏 鲁翠云 郑先虎 刘天奇 那荣滨 何立川
受保护的技术使用者：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/31