暹罗芽孢杆菌CM-19及其培养方法、菌剂和菌肥及其制备方法和应用

暹罗芽孢杆菌cm-19及其培养方法、菌剂和菌肥及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及暹罗芽孢杆菌cm-19及其培养方法、菌剂和菌肥及其制备方法和应用。


背景技术：

2.磷是仅次于氮第二大限制作物生长的营养元素，也是土壤中最难移动，有效性最差的植物必须的大量营养元素。土壤中磷总量虽然丰富，但通常情况下施入土壤中磷肥的当季利用率仅有10％～25％，因为施入土壤中的磷肥会迅速通过土壤吸附、化学固定等方式变成植物难以利用的形态，施入的磷肥中有75％～90％被固定在土壤中，造成土壤全磷含量颇丰，而有效磷含量很低的现象出现。因此如何挖掘土壤磷这一养分库，减少磷肥施用，提高磷肥利用效率是当前农业生产中亟需解决的问题。
3.解磷微生物能够通过产生有机酸、质子和酶类来活化土壤难溶磷，从而将植物难以利用的磷转化为有效态磷，提高作物磷肥的利用效率，世界各国相继开展了相关研究，但目前已报道的溶磷菌，溶磷效果并不明显，而且有些溶磷菌在作物根际土壤中稳定定殖能力差，受土壤环境条件影响较大。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了暹罗芽孢杆菌cm-19、及其培养方法、菌剂及其制备方法和应用。本发明所述暹罗芽孢杆菌cm-19能够有效降解土壤中的难溶性磷，并该菌株能够稳定定殖于植物根际土壤，受土壤环境影响较小。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)cm-19，所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的保藏编号为cgmcc no.18733。
7.本发明提供了上述技术方案所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的培养方法，包括以下步骤：将所述暹罗芽孢杆菌cm-19接种于lb培养基中培养，得到扩繁后的暹罗芽孢杆菌cm-19。
8.优选的，所述培养的ph为5～7，时间为24～48h，温度为27～33℃；培养时，所述暹罗芽孢杆菌cm-19的接种量为lb培养基体积的1～2％。
9.本发明提供了一种菌剂或菌肥，所述菌剂或菌肥的有效成分包括上述技术方案所述的暹罗芽孢杆菌cm-19或所述暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液。
10.优选的，所述菌剂或菌肥中暹罗芽孢杆菌cm-19的有效活菌数优选为10.0～14.0亿/g。
11.优选的，所述菌剂或菌肥还包括辅料；所述辅料和暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液的质量比为3～4:1～1.5。
12.本发明提供了上述技术方案所述菌剂或菌肥的制备方法，包括以下步骤：将暹罗芽孢杆菌cm-19的代谢物与辅料混合，依次进行烘干和粉碎，得菌剂或菌肥。
13.本发明提供了上述技术方案所述的暹罗芽孢杆菌cm-19或上述技术方案所述菌剂或菌肥在提高植物对土壤难溶性磷利用率和/或促进植物生长中的应用。
14.本发明提供了一种提高植物对土壤难溶性磷利用率/或促进植物生长的方法，包括以下步骤：采用所述菌剂或菌肥进行拌种处理后，播种；
15.或播种前施入土壤。
16.优选的，当进行拌种处理时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～2.5/亩；
17.当施入土壤时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～3.0kg/亩。
18.有益效果：本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)cm-19，所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的保藏编号为cgmcc no.18733。该菌株具有高效解磷和促生的作用，具体表现在高效提高作物对土壤难溶性磷的利用效率，提高土壤中的可溶性磷含量，以此来缓解作物利用磷肥利用率低的问题，而且通过荧光标记的方法证明该菌能够稳定定殖于植物根际土壤，受土壤环境影响较小。本发明具体实施例中表明，接种所述暹罗芽孢杆菌cm-19后，能够显著促进植株的生长，提高植物对难溶性磷的利用，减少磷肥用量。
19.另外，本发明还提供了培养所述暹罗芽孢杆菌cm-19的方法，该方法通过优化培养条件获得的，明晰了菌株的最适宜生存环境，促进其发挥最大功效，对发展低碳生态绿色农业有重要的应用价值。
20.生物保藏说明
21.本发明所述暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)cm-19，于2019年10月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.18733。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
23.图1为菌株cm-19的系统发育树；
24.图2为暹罗芽孢杆菌cm-19的溶磷圈；
25.图3为培养时间和培养温度对细菌细胞密度od
600
值的响应面图；
26.图4为培养时间和培养温度对细菌细胞密度od
600
值的等高线图；
27.图5为培养时间和培养液ph对细菌细胞密度od
600
值的响应面图；
28.图6为培养时间和培养液ph对细菌细胞密度od
600
值的等高线图；
29.图7为培养温度和培养液ph对细菌细胞密度od
600
值的响应面图；
30.图8为培养温度和培养液ph对细菌细胞密度od
600
值的等高线图；
31.图9为土壤中的暹罗芽孢杆菌cm-19的荧光显微图；
32.图10为含有卡那霉素的平板上生长的暹罗芽孢杆菌cm-19的荧光显微图。
具体实施方式
33.本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)cm-19，所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的保藏编号为cgmcc no.18733。本发明所述暹罗芽孢杆菌cm-19与目前已报道出的菌株相比，溶磷能力有着显著优势，具有较强的环境适应性及生存优势。
34.本发明提供了上述技术方案所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的培养方法，包括以下步骤：将所述暹罗芽孢杆菌cm-19接种于lb培养基中培养，得到扩繁后的暹罗芽孢杆菌cm-19，即暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液。本发明所述发酵液中的有效成分具有溶磷和促进作用。在本发明中，所述发酵液中暹罗芽孢杆菌cm-19的有效活菌数优选为34.0～37.5亿/ml，更优选为34.5～37.0亿/ml。在本发明中，所述培养的ph优选为5～7，更优选为6；所述培养的时间优选为24～48h，更优选为36h；所述培养的温度优选为27～33℃，更优选为30℃。本发明在培养时，所述暹罗芽孢杆菌cm-19的接种量优选为lb培养基体积的1％。本发明所述培养方法是根据所述暹罗芽孢杆菌cm-19的生长特性优化得到。该方法明细了暹罗芽孢杆菌cm-19的最佳生存环境，促进暹罗芽孢杆菌cm-19发挥最大功效。
35.本发明所述暹罗芽孢杆菌cm-19的形态学特征为：该菌株单菌落呈不规则形，边缘锯齿状，菌落乳白色不透明，表面光滑较粘稠。本发明所述暹罗芽孢杆菌cm-19的形态学观察特点为：该菌株为革兰氏阳性细菌，可使淀粉水解，可液化明胶，能还原硝酸盐，不能利用乳糖，可利用蔗糖、木糖及阿拉伯糖。
36.在本发明中，所述暹罗芽孢杆菌cm-19优选以暹罗芽孢杆菌cm-19种子液的形式接种。本发明所述暹罗芽孢杆菌cm-19种子液的制备方法优选包括以下步骤：将活化后的暹罗芽孢杆菌cm-19菌落挑取接种于lb培养基中恒温摇床培养，得到暹罗芽孢杆菌cm-19种子液。本发明所述恒温摇床培养的条件参数优选为：30℃、160r/min振荡培养14h。本发明优选采用接种环接种，挑少许菌落即可。本发明所述活化的方式优选为将暹罗芽孢杆菌cm-19接种于lb固体培养基恒温培养，得到活化的暹罗芽孢杆菌cm-19。本发明所述恒温培养的温度优选为30℃，时间优选为72h。本发明对所述lb培养基和lb固体培养基的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得或参考现有技术制备得到的即可。
37.本发明提供了一种菌剂或菌肥，所述菌剂或菌肥的有效成分包括上述技术方案所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液，也称为暹罗芽孢杆菌cm-19的培养液。本发明所述菌剂或菌肥优选还包括辅料；所述辅料优选包括草炭，作为吸附剂。本发明所述辅料和暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液的质量比优选为3～4:1～1.5，更优选为3:1.5。在本发明中，所述菌剂或菌肥中所述暹罗芽孢杆菌cm-19的有效活菌数优选为10.0～14.0亿/克，更优选为12.0～14.0亿/克。
38.施用本发明所述菌剂后，能够显著提高植物的生长的同时，还能提高植物对土壤中难溶性磷的利用率，提高植物的吸磷量，最终达到降低磷肥施用量的目的。
39.本发明提供了上述技术方案所述菌剂或菌肥的制备方法，包括以下步骤：将暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液与辅料混合，依次进行烘干、粉碎，得菌剂或菌肥。本发明所述暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液和辅料在前述技术方案已经进行了详细的论述，在此不作赘述。在本发明中，所述烘干的温度优选为30℃，时间优选为12～16h，更优选为13～15h；所述粉碎后所得物料的粒径优选为2～3mm。
40.所述粉碎后，本发明还优选包括对粉碎所得物料进行包装装袋，得到菌剂或菌肥。本发明对所述包装装袋的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
41.基于上述优势，本发明提供了上述技术方案所述的暹罗芽孢杆菌cm-19或上述技术方案所述菌剂或菌肥在提高植物对土壤难溶性磷利用率和/或促进植物生长中的应用。
42.本发明提供了一种提高植物对土壤难溶性磷利用率/或促进植物生长的方法，包
括以下步骤：采用所述菌剂或菌肥对种子进行拌种处理后，播种；或播种前施入土壤。
43.本发明采用所述菌剂或菌肥对种子进行拌种处理后，播种。当本发明进行拌种处理时，所述菌剂或菌肥的用量优选为1.5～2.5kg/亩，还优选为1.8～2.2kg/亩。
44.本发明在播种前施入土壤，在本发明中，所述施入土壤的方式优选包括条施、穴施或滴灌。本发明施入土壤时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～3.0kg/亩，进一步优选为1.6～2.8kg/亩，还优选为2～2.5kg/亩。当采用条施时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～3.0kg/亩，进一步优选为1.6～2.8kg/亩，还优选为2～2.5kg/亩；当采用穴施时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～3.0kg/亩，进一步优选为1.6～2.8kg/亩，还优选为2～2.5kg/亩；当采用滴灌时时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～3.0kg/亩，进一步优选为1.6～2.8kg/亩，还优选为2～2.5kg/亩。本发明对所述条施、穴施和滴灌的具体方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。
45.本发明所述菌剂或菌肥已经在前述技术方案进行了详细的论述，在此不再赘述。本发明对所述拌种和播种的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。本发明所述植物优选包括经济类作物，更优选包括玉米、大豆、茄子或番茄，还优选为玉米、大豆、大棚茄子或大棚番茄，更优秀为玉米。采用本发明所述菌剂或菌肥能够显著提高植物的干重和吸磷量。
46.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
47.实施例1菌株的分离和鉴定
48.cm-19分离于黑龙江省园艺分院大棚连作茄子健康植株根际土壤。对分离的cm-19进行pcr扩增并进行测序，其16s rdna的序列为tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgtt gtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctt
tatggagccagcc(sqe id no.1)，将pcr测序列提交到ncbi中，在genbank中进行blast相似性分析，采用mega7.0(molecular evolutionary genetics analysis)软件neighbor-joining进行聚类分析，将genbank中与菌株基因序列相似性较高的前15种细菌构建系统进化树，形态学观察特点：单菌落呈不规则形，边缘锯齿状，菌落乳白色不透明，表面光滑较粘稠；该菌株为革兰氏阳性细菌，可使淀粉水解，可液化明胶，能还原硝酸盐，不能利用乳糖，可利用蔗糖、木糖及阿拉伯糖，系统发育树详见图1，图1中的sj-1为菌株cm-19，结合菌株cm-19的形态学观察、生理生化指标分析及16s rdna基因序列比对结果综合分析，最终鉴定菌株cm-19为暹罗芽孢杆菌(bacillus siamensis)又翻译为西姆芽孢杆菌。该菌种于2019年10月24保存于中国科学院微生物研究所(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌株在该保藏中心登记入册编号为cgmccno.18733。
49.实施例2暹罗芽孢杆菌cm-19的溶磷效果评价
50.1.lb固体培养基平板上的溶磷评价
51.将上述分离得到的暹罗芽孢杆菌cm-19，以及枯草芽孢杆菌(由河北省保定市科绿丰生化科技有限公司生产)和韦氏芽孢杆菌(由本实验室分离)挑取单菌落划线于lb固体培养基平板上，接种量为1接种环，在恒温培养箱中30℃培育72h进行活化后，用接种环涂布于含ca3(po4)2的pko平板中央，ca3(po4)2的浓度为5g/l，ca3(po4)2的量为75mg，30℃培养5d后，测定溶磷圈直径(d)和菌落直径(d)，以d/d值来初步确定菌株的溶磷能力，每组试验进行3个平行实验。测定结果如表1所示。
52.表1菌株的溶磷能力的检测结果
[0053][0054]
由表1可知，暹罗芽孢杆菌cm-19具有较强的解磷能力，如图2所示。暹罗芽孢杆菌cm-19在平板上出现的d/d值最大为1.29
±
0.06，显著高于其它溶磷菌。
[0055]
2.液体lb培养基对难溶性磷的溶解作用
[0056]
将活化的暹罗芽孢杆菌cm-19接种于液体lb培养基，25℃、150r/min培养14h，采用接种环接种，挑少许菌落即可，得到种子液；用无菌水将种子液制备成od
600
为1的菌悬液，以1％(v/v)接种于pko液体培养基中。具体步骤为：将od
600
为1的菌悬液接种于50ml含有ca3(po4)2的pko液体培养基的三角瓶中，其中该pko液体培养基中ca3(po4)2的浓度为5g/l，置于恒温摇床上振荡，温度为25℃、转速为160r/min、培养时间为5d，并在0h、3h、17h、24h、41h、48h、53h、72h、96h、120h测定菌液的可溶性磷含量和ph值，具体步骤为：不同培养时间得到的培养液转移至离心管中，在温度为4℃、转速为10000r/min条件下离心15min，离心后收集上清液，用钼蓝比色法测定上清液中可溶性磷的含量；ph值通过ph计测定。0h、3h、17h、24h、41h、48h、53h、72h、96h、120h每个培养时间进行3个平行实验。测定结果见表2。
[0057]
表2暹罗芽孢杆菌cm-19液体培养基上清液可溶性磷含量及ph值
[0058][0059]
由表2记载的可知，在0～48h，暹罗芽孢杆菌cm-19的溶磷量不断增加，在48h时，溶磷量达到最大值，为131.4mg/l，随后开始下降；ph在53h时达到最低5.06。由相关性分析可知，暹罗芽孢杆菌cm-19溶磷量与ph值之间存在显著负相关关系(r＝-0.695，p《0.01)，考虑发酵液中ph值随溶磷量的上升而下降，可能是溶磷菌在发挥作用时分泌出某些酸性物质所致。
[0060]
实施例3
[0061]
暹罗芽孢杆菌cm-19种子液的制备及生长曲线测定
[0062]
暹罗芽孢杆菌cm-19种子液制备：将暹罗芽孢杆菌cm-19转接于lb固体培养基平板上，接种量为1接种环，在恒温培养箱中30℃培育72h进行活化，得到活化暹罗芽孢杆菌cm-19。用接种环挑取活化暹罗芽孢杆菌cm-19的菌落接种于lb液体培养基中，lb液体培养基的用量为100ml，初始ph为7，置于恒温摇床30℃、160r/min振荡培养14h作为暹罗芽孢杆菌cm-19种子液。
[0063]
生长曲线测定：将暹罗芽孢杆菌cm-19种子液以1％(v/v)的接种量，接入100ml lb液体培养基中，160r/min、30℃恒温振荡培养，lb液体培养基的初始ph为7，分别于10h、12h、14h、24h、36h、48h、60h、72h、84h取发酵液利用紫外分光光度计测定吸光值(od
600
)，每个时间段的发酵液进行3次平行实验，振荡比浊法测定暹罗芽孢杆菌生长曲线，见表3。
[0064]
表3不同培养时间暹罗芽孢杆菌cm-19生长曲线(od
600
)
[0065]
19的od
600
值达到0.895。由此可见，在5～7为较适ph范围，即在ph 5～7范围内较适宜暹罗芽孢杆菌cm-19的生长。
[0087]
实施例7
[0088]
将实施例3制备得到的暹罗芽孢杆菌cm-19种子液以1％(v/v)的接种量，接入50ml lb液体培养基中，该lb培养基的ph为7，以160r/min、30℃恒温振荡培养培养24h，进行3次平行实验。
[0089]
实施例8
[0090]
与实施例7步骤相同，区别仅为：培养时间为36h。
[0091]
实施例9
[0092]
与实施例7步骤相同，区别仅为：培养时间为48h。
[0093]
对比例5
[0094]
与实施例7步骤相同，区别仅为：培养时间为60h。
[0095]
对比例6
[0096]
与实施例7步骤相同，区别仅为：培养时间为72h。
[0097]
对实施例7～9和对比例5～6的所得培养液分别测定得到的培养液的od
600
值，测定结果见表5。
[0098]
表5培养时间对暹罗芽孢杆菌cm-19的细菌数量的影响
[0099][0100]
由表5记载的可知，培养基初始ph和培养温度一定时，不同的培养时间下暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度随着时间的增加呈现先增加后降低的趋势，培养时间24h～36h暹罗芽孢杆菌cm-19的od
600
值呈现上升趋势，培养时间为36h时od
600
值最大，达到1.204。培养时间36h～60h暹罗芽孢杆菌cm-19的od
600
值呈现缓慢下降的趋势，且36h达到最高，60h已经开始下降。因此，可确定暹罗芽孢杆菌cm-19培养时间最佳为24～48h。
[0101]
实施例10
[0102]
将实施例3制备得到的暹罗芽孢杆菌cm-19种子液以1％(v/v)的接种量，接入50ml lb液体培养基中，该lb培养基的ph为7，以160r/min、27℃恒温振荡培养培养24h，进行3次平行实验。
[0103]
实施例11
[0104]
与实施例10步骤相同，区别仅为：温度为30℃。
[0105]
实施例12
[0106]
与实施例10步骤相同，区别仅为：温度为33℃。
[0107]
对比例7
[0108]
与实施例10步骤相同，区别仅为：温度为24℃。
[0109]
对比例8
[0110]
与实施例10步骤相同，区别仅为：温度为36℃。
[0111]
对实施例10～12和对比例7～8的所得培养液分别测定得到的培养液的od
600
值，测定结果见表6。
[0112]
表6培养温度对暹罗芽孢杆菌cm-19的细菌数量的影响
[0113][0114]
由表6可知，培养基初始ph和培养时间一定时，培养温度对暹罗芽孢杆菌cm-19生长的影响较大，各处理间差异达到显著水平。可以看到菌株在24～36℃均有活性，但在适宜的温度下生长更好，过高或过低的温度都不利于该菌生长，温度培养对细胞浓度的影响最高的为30℃，od
600
值高达到0.877。由此确定，暹罗芽孢杆菌cm-19较适培养温度为27℃～33℃。
[0115]
实施例13暹罗芽孢杆菌cm-19的培养条件优化
[0116]
在对实施例4～实施例12和对比例1～8进行的单因素筛选培养条件结果的基础上，利用design
–
expert 13.0软件，设计多因素正交旋转组合试验。以培养基初始ph(a)、培养时间(b)和培养温度(c)3个因素为自变量，以细菌细胞密度(od
600
)为检测值，设计3因素3水平正交旋转组合共17个试验点进行响应面分析试验，试验因素水平及编码见表7，响应面分析试验组合见表8，以求解培养条件的最优参数组合。
[0117]
表7响应面因素水平编码
[0118][0119]
表8响应面分析试验组合表
[0120][0121]
由表8可知，对影响暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度od
600
值的培养基初始ph、培养时间、培养温度进行正交旋转组合17组试验，每组试验进行三次平行实验，取平均值，使用软件design
–
expert 13.0对测试数据进行多变量的回归拟合，od
600
值为响应值见表9。
[0122]
表9响应面分析试验数据表
[0123]
[0124][0125]
由表9可知，培养时间(a)、培养温度(b)、ph值(c)是单独变量，获得多元二次方程：y＝1.18+0.0300a+0.0134b+0.0014c+0.0792ab-0.0448ac-0.0250bc-0.1331a
2-0.2479b
2-0.1983c2。
[0126]
经软件design
–
expert 12.0拟合后获得的多元二次模型方差分析及显著性结果如表10所示，此模型p《0.01，失拟项p值为0.9268(p》0.05)，可知该模型回归极显著并且失拟项不显著，可见模型适宜。模型的r2＝0.9902，说明该模型的拟合较好，可以很好模拟不同培养条件下暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度的理论预测。同时一次项a的p值为0.0225(p《0.05)，表明培养液初始培养温度对暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度od
600
值的影响达显著水平。二次项a2、b2、c2的p值都小于0.01，表明培养液初始ph、培养时间和培养温度对暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度od
600
值的影响达极显著水平。根据f值大小可知影响暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度od
600
值的因素排序为培养液初始培养时间》培养温度》ph。
[0127]
交互项ab、ac的p值分别为0.0010、0.0179，表明培养时间和培养温度的交互作用及培养时间和培养液初始ph的交互作用对暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度od
600
值的影响显著(p《0.05)。
[0128]
表10二次模型方差分析
[0129]
[0130][0131]
使用design-expert 12.0获得所需的响应曲面及等高线图，如图3～图8所示，图5～图8初始ph为培养基初始ph。图3～图8为其中一个变量取固定水平时，其余两个变量对暹罗芽孢杆菌cm-19的细胞浓度od
600
值的影响。通过等高线图的形状来反映两因素间的交互作用，经软件预测分析可得出最优条件，各因素交互作用等高线是椭圆形时，表示两因素间交互作用显著，而呈圆形时，表示两因素间交互作用不显著。因此，通过响应曲面和等高线图直观地观察到ab，a c和bc之间相互作用的重要性。其中，培养时间和培养温度的交互作用与培养温度及培养液ph的交互作用影响显著，模型显示优化后预测值换算为实际值培养时间36h、发酵温度30℃、培养基初始ph值6是最适合暹罗芽孢杆菌cm-19cm-19生长。
[0132]
实施例13优化培养条件后活性检测
[0133]
为了验证软件预测分析模型的准确性，对预测的最佳培养条件进行试验。考虑到操作可行性，将理论最佳条件调整为：最佳发酵条件为发酵时间36h、发酵温度30℃、培养液初始ph值6，以最优培养条件进行暹罗芽孢杆菌cm-19液体培养，获得暹罗芽孢杆菌cm-19发酵液，记为实验组，制备暹罗芽孢杆菌cm-19发酵液的具体步骤为：将实施例3制备得到的暹罗芽孢杆菌cm-19种子液以1％(v/v)的接种量，接入50ml lb液体培养基中，该lb培养基的ph为7，以160r/min、30℃恒温振荡培养培养36h，进行3次平行实验。
[0134]
以接入暹罗芽孢杆菌cm-19正常发酵条件为对照组，具体为：将实施例3制备得到的暹罗芽孢杆菌cm-19种子液以1.0～1.5％(v/v)的接种量，接入50ml lb液体培养基中，该lb培养基的ph为6.0，以160r/min、30℃恒温振荡培养培养36h，进行3次平行实验。
[0135]
使用分光光度计测定od
600
值，血细胞计数法计算实验组和对照组中暹罗芽孢杆菌cm-19数量，同时调查菌液中的可溶性含磷量，调查结果见表11。
[0136]
表11优化条件后暹罗芽孢杆菌cm-19活性数量和可溶性磷含量
[0137][0138]
如表11所示，优化前测定暹罗芽孢杆菌cm-19的od
600
平均值为0.91，优化后暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液od
600
平均值可达1.19，优化后菌液od
600
值显著高于优化前，且活菌数量增加30.77％。表明优化后的发酵培养条件可提高暹罗芽孢杆菌cm-19的数量，进一步验证响应面优化条件的可行性。对优化后菌液中的可溶性磷含量测定结果表明，菌液可溶性磷含量为192.25mg/l，比对照(167.18mg/l)增加可溶性磷含量增加了15.0％，表明优化后的发酵培养条件显著提高活菌数量，使菌液中可溶性磷含量显著增加。
[0139]
实施例14
[0140]
荧光标记方法
[0141]
解磷菌cm-19(暹罗芽孢杆菌cm-19)自然感受态细胞的制备
[0142]
挑取lb平板上过夜活化的暹罗芽孢杆菌cm-19单菌落于液体lb培养基中，31℃、150r/min振荡培养过夜；次日吸取一定体积的暹罗芽孢杆菌cm-19过夜培养物于新鲜无菌的gche培养液(gche培养液中含1％葡萄糖，0.2％l-谷氨酸钾，0.1mol/l磷酸钾缓冲液(ph＝7)，0.003mol/l柠檬酸三钠，0.003mol/lmgso4，0.022mg/l柠檬酸铁铵，0.05mg/l l-色氨酸和0.1％酪蛋白水解物)中，并使其溶液od
600
在0.3左右；31℃、200r/min剧烈振荡培养至od
600
约1.4左右；加入等体积的gc培养液(gc培养液中含1％葡萄糖，0.1mol/l磷酸钾缓冲液(ph＝7)，0.003mol/l柠檬酸三钠，0.003mol/lmgso4，0.022mg/l柠檬酸铁铵和0.05mg/l l-色氨酸)稀释，相同条件继续振荡1～1.5h；将此时的细菌培养物均匀分成两份，在5000r/min下于室温离心5min；上清液重悬沉淀后，即为感受态细胞悬液。
[0143]
解磷菌cm-19的自然转化及标记菌株的筛选
[0144]
取200μl感受态细胞悬液，加入2ml混有1μg gfp质粒的转化缓冲液(转化缓冲液：0.015mol/l(nh4)2so4，0.08mol/l k2hpo，0.045mol/l h2kpo4，0.035mol/l柠檬酸钠，0.001mol/l乙二醇二乙醚二胺四乙酸(egta)，0.025mol/l葡萄糖和0.03mol/l mgcl2)，轻轻混匀后放置于31℃培养箱1h，期间每10～15min轻轻颠倒混匀1次，向其中加入含亚致死浓度(0.1μg/ml)的卡那霉素的lb培养液，31℃、150r/min培养2～3h，8000r/min离心5min，取400μl上清液重悬沉淀后均匀涂布于含卡那霉素的lb平板上，31℃过夜培养。
[0145]
过夜培养，把在平板中生长的菌落拿到荧光显微镜下，可以观察到该菌落带有强烈的绿色荧光，如图10所示，说明质粒gfp已转入暹罗芽孢杆菌cm-19中，且gfp基因成功表达，把获得的含有质粒gfp的暹罗芽孢杆菌cm-19作为荧光标记解磷菌cm-19。
[0146]
实施例15
[0147]
菌肥制备：
[0148]
将实施例14中制备得到的荧光标记解磷菌cm-19在优化的ph为6、温度为30、培养时间36h最佳发酵条件下在发酵罐发酵制备发酵液，具体步骤同实施例13中实验组制备暹罗芽孢杆菌cm-19发酵液的具体步骤。市售草碳作为吸附剂，调节ph为6～6.5，121℃灭菌2～3h，自然冷却后备用。
[0149]
然后将上述得到的发酵液加入草碳吸附剂中，草碳与发酵液的质量比为3∶1.5，搅拌均匀，30℃烘干，粉碎，包装装袋，得到菌肥。菌肥成品经活菌计数，总菌数达到14.0亿/克。
[0150]
菌肥的应用：
[0151]
试验土壤取自东北农业大学试验基地，将取回的土壤风干后过2mm筛备用。2022年8月5日播种，于播种玉米前用上述菌肥进行拌种，用量为每盆20g，折算为：菌肥的用量为2.5kg/亩，容器规格为20cm
×
15cm，每盆装土2.6kg，记为实验组。实验用磷肥为难溶性磷ca3(po4)2，用量为150mg/kg土壤。以未施菌肥作为对照组，以施用枯草芽孢杆菌为主的商品磷素活化剂(由河北省保定市科绿丰生化科技有限公司生产)为对比组，对比组的施用量为2.5kg/亩。
[0152]
2022年8月16日定植，选择长势一致四叶一心的玉米幼苗，每盆两株。每个处理进行4次平行实验，试验在东北农业大学温室进行，于2022年11月29日收获。实验结束后，对玉米的干重以及吸磷量进行调查，吸磷量的调查方法为植株收获后，烘干、称重、粉碎。然后称取一定重量植株消煮，用钒钼黄比色法测定植株含磷量，然后乘以植株干重得到植株吸磷量；调查结果见表12。
[0153]
表12玉米的干重以及吸磷量调查结果
[0154][0155]
由表12可知，接种暹罗芽孢杆菌cm-19显著促进了玉米植株的生长，提高了玉米对难溶性磷的利用。暹罗芽孢杆菌cm-19处理的植株干物重是对照的1.44倍，吸磷量是对照的
1.42倍，是商品磷素活化剂的1.28倍，结果表明暹罗芽孢杆菌cm-19具有显著活化土壤难溶性磷的能力，提高作物磷的利用效率，减少化肥用量。
[0156]
荧光标记菌株在土壤中的定殖
[0157]
土壤中标记菌数量检测：收获时将采用抖根法收集根际土，取1g根际土壤与9ml无菌水混匀，逐级稀释，取10-5
、10-6
、10-7
稀释度土壤悬浊液100μl涂含卡那霉素的lb平板，其中卡那霉素的浓度为0.1μg/ml，30℃培养48h，用荧光显微镜观察平板。如图9所示，在荧光显微镜下观察到明显绿光，说明暹罗芽孢杆菌可在土壤中有效定殖。
[0158]
综上所述可知，本发明提供的暹罗芽孢杆菌cm-19具有高效降磷和促生的作用，具体表现在高效提高作物对土壤难溶性磷的利用效率，提高土壤中的可溶性磷含量，减少磷肥的施用量，以此来缓解土壤磷肥利用率低的问题，还能够稳定定殖于植物根际土壤，不受土壤环境影响。
[0159]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

技术特征：
1.一株暹罗芽孢杆菌(bacillussiamensis)cm-19，其特征在于，所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的保藏编号为cgmccno.18733。2.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌cm-19的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述暹罗芽孢杆菌cm-19接种于lb培养基中培养，得到扩繁后的暹罗芽孢杆菌cm-19。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述培养的ph为5～7，时间为24～48h，温度为27～33℃；培养时，所述暹罗芽孢杆菌cm-19的接种量为lb培养基体积的1％～2％。4.一种菌剂或菌肥，其特征在于，所述菌剂或菌肥的有效成分包括权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌cm-19或所述暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液。5.根据权利要求4所述的菌剂或菌肥，其特征在于，所述菌剂或菌肥中暹罗芽孢杆菌cm-19的有效活菌数为10.0～14.0亿/克。6.根据权利要求4所述的菌剂或菌肥，其特征在于，所述菌剂或菌肥还包括辅料；所述辅料和暹罗芽孢杆菌cm-19的发酵液的质量比为3～4:1～1.5。7.权利要求4～6任一项所述菌剂或菌肥的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将暹罗芽孢杆菌cm-19发酵液与辅料混合，依次进行烘干和粉碎，得菌剂或菌肥。8.权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌cm-19或权利要求4～6任一项所述菌剂或菌肥在提高植物对土壤难溶性磷利用率和/或促进植物生长中的应用。9.一种提高植物对土壤难溶性磷利用率/或促进植物生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用所述菌剂或菌肥进行拌种处理后，播种；或播种前施入土壤。10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，当进行拌种处理时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～2.5kg/亩；当施入土壤时，所述菌剂或菌肥的用量为1.5～3.0kg/亩。

技术总结
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及暹罗芽孢杆菌CM-19及其培养方法、菌剂和菌肥及其制备方法和应用。本发明提供了一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)CM-19，所述的暹罗芽孢杆菌CM-19的保藏编号为CGMCCNo.18733。本发明所述暹罗芽孢杆菌CM-19能够高效溶解难溶性磷，还能够显著促进植株的生长，提高植物对难溶性磷的利用，减少磷肥用量。减少磷肥用量。减少磷肥用量。


技术研发人员：李淑敏 张宇航 孟雨霏 尹滕娇 成泽禹 霍红蕊 赵舒畅 赵浩兵
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/31