一条具有辅助治疗溃疡性结肠炎作用的蛋清肽序列及其应用

1.本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一条具有辅助治疗溃疡性结肠炎作用的蛋清肽序列fgy及其应用。


背景技术：

2.溃疡性结肠炎是炎症性肠病的一种，目前在全球范围内有较高的发病率。溃疡性结肠炎病因尚未探明、疾病病程较长。如今，溃疡性结肠炎患者的治疗主要以药物为主，如5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂、生物制剂等。然而，以上药物的长期使用会导致机体产生副作用和耐药性，不利于溃疡性结肠炎患者疾病的缓解。临床药品与功能性食品的有效结合能够缩短溃疡性结肠炎患者的治疗周期，因此，目前亟需一种安全、高效的肠道增稳型功能性食品辅助溃疡性结肠炎的治疗。
3.我国是全球鸡蛋产量第一大国，具有丰富的蛋品资源。蛋清蛋白含有全部8种人体必需氨基酸，是制备生物活性肽最好的来源之一。制备得到的小分子蛋清源生物活性肽具有吸收快速、营养丰富的特点。同时，结构多样的蛋清肽能够在机体内与炎症反应相关的靶点产生相互作用，其有望从抑制炎症反应、调节信号通路的角度辅助治疗溃疡性结肠炎。制备蛋清肽的传统方法是应用酶解法，其主要通过向蛋清蛋白体系中加入酶制剂将蛋白肽键断裂，水解成小分子生物活性肽。然而，酶解法制备蛋清肽在实际生产加工中具有一定的缺陷：向蛋清蛋白中引入酶制剂易造成异味，导致最终产品口味不佳；酶解过程对温度、ph值等条件要求较为精准，导致能源损耗较大、生产成本较高。因此，寻找一种绿色、环保的蛋清肽制备方法对蛋清肽的稳定制备尤为重要。
4.国内外研究表明，通过益生菌发酵法能够水解蛋白结构，从而制备生物活性肽。但益生菌发酵法制备蛋清具有一定的限制：蛋清蛋白呈碱性，不利于益生菌的生长；蛋清蛋白中没有碳源，不能满足益生菌生长繁殖所需要的能源条件等。通过向蛋清体系中引入辅助剂进行协同发酵能够解决这一问题。基于此，本发明应用“益生菌-辅助剂”协同发酵法高效制备了蛋清肽，并在体外模拟消化后基于质谱技术检测到一条序列为fgy的蛋清肽。相关实验结果表明，蛋清肽fgy具有辅助缓解溃疡性结肠炎的功能，能够从缓解体重下降、修复结肠结构、抑制炎症反应等多方面辅助缓解溃疡性结肠炎，有望能够成为溃疡性结肠炎治疗过程中的功能性食品配料。本发明为蛋清源生物活性肽的高效稳定制备和溃疡性结肠炎的辅助治疗提供了新视角和新策略。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一条具有辅助治疗溃疡性结肠炎作用的蛋清肽序列fgy及其应用，以解决开发具有辅助治疗溃疡性结肠炎的功能性食品相关问题。
6.本发明提供一条具有辅助治疗溃疡性结肠炎作用的蛋清肽序列fgy的制备方法，其获得可利用益生菌作为发酵菌种、牛奶作为发酵辅助剂，经体外模拟胃肠道消化后获得。包括以下步骤：
7.1、蛋清肽fgy的制备
8.鲜蛋清洗后经消毒、打蛋、分离后收集鲜蛋清，称取新鲜蛋清100g，向其中加入100g全脂牛奶、8g蔗糖、2g葡萄糖。将原料液于8000rpm条件下进行均质，并置于68℃水浴锅杀菌10min。冷却至室温后，将科汉森aby-8直投式混合菌种以0.4％比例加入混合体系，于39℃下发酵12h。冷却后熟后，于4℃，9000rpm离心10min获得混合肽溶液，经体外模拟胃肠道消化后，将上清液依次通过不同分子量的滤膜，分离纯化出分子量小于1kda的组分，对该组分进行脱盐处理后进一步进行减压浓缩，冷冻干燥后得蛋清肽粉末。然后借助lc-ms/ms鉴定结构，依据质谱图信息，并结合软件分析及蛋白质数据库，确定出蛋清肽的氨基酸序列。
9.2、蛋清肽fgy具有辅助缓解溃疡性结肠炎损伤的作用
10.利用葡聚糖硫酸钠构建溃疡性结肠炎模型，并在造模成功后予以蛋清肽fgy灌胃干预。实验结果表明，蛋清肽干预能够恢复由溃疡性结肠炎导致的体重急剧下降。病理切片结果表明，蛋清肽fgy能够恢复由溃疡性结肠炎导致的隐窝消失、杯状细胞数量减少、炎症因子浸润等结构损伤。此外，蛋清肽fgy干预后能够显著降低小鼠结肠组织中促炎因子(tnf-α、il-6)水平、提升抗炎因子(il-10、il-22)水平。综上所述，蛋清肽fgy能够从缓解体重下降、修复结肠损伤、抑制炎症反应的角度辅助缓解溃疡性结肠炎。
11.本发明具有以下有益效果：
12.1、以蛋清为原料，牛奶为发酵辅助剂，利用“益生菌-辅助剂”协同发酵法制备得到蛋清肽。
13.2、蛋清肽fgy在缓解溃疡性结肠炎模型动物实验中，能改善由溃疡性结肠炎导致的结肠组织损伤，能够显著降低小鼠结肠组织中促炎因子(tnf-α、il-6)水平、提升抗炎因子(il-10、il-22)水平。
14.3、本发明不仅能够为蛋清肽的绿色制备和蛋品的精深加工提供新思路，还能够为溃疡性结肠炎的辅助缓解提供新策略。
附图说明
15.图1实验小鼠的体重变化情况
16.图2实验小鼠的结肠病理切片
17.图3实验小鼠结肠内炎症因子分泌水平
具体实施方式
18.下面结合具体实施例对本发明进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。
19.实施例1：蛋清肽fgy的制备，分离及鉴定
20.(1)鲜蛋清洗后经消毒、打蛋、分离后收集鲜蛋清，称取新鲜蛋清100g，向其中加入100g全脂牛奶、8g蔗糖、2g葡萄糖。将原料液于8000rpm条件下进行均质，并置于68℃水浴锅杀菌10min。
21.(2)冷却至室温后，将科汉森aby-8直投式混合菌种以0.4％比例加入混合体系，于39℃下发酵12h。
22.(3)冷却后熟后，于4℃，9000rpm离心10min获得混合肽溶液，经体外模拟胃肠道消化后，将上清液依次通过不同分子量的滤膜，分离纯化出分子量小于1kda的组分，对该组分进行脱盐处理后进一步进行减压浓缩，冷冻干燥后得蛋清肽粉末。
23.(4)应用lc-ms/ms鉴定结构，依据质谱图信息，并结合软件分析及蛋白质数据库，确定出蛋清肽的氨基酸序列(phe-gly-tyr)。
24.实施例2：蛋清肽具有预防溃疡性结肠炎损伤的作用
25.(1)实验动物分组及造模方法：选取6-8周龄雄性balb/c小鼠(spf级)24只，并在标准条件下饲养。在自由进食和饮水的适应期后，将所有小鼠随机分为四组(n＝6)。各组设置如下：对照组(ck，实验期间正常饮食饮水)、模型组(m，实验1-7天(造模期)自由饮用3％dss溶液，8-15天(干预期)自由饮水)、阳性药物组(5-asa，实验1-7天(造模期)自由饮用3％dss溶液，8-15天(干预期)灌胃200mg/kg小鼠体重剂量的5-氨基水杨酸)、蛋清肽fgy组(fgy，实验1-7天(造模期)自由饮用3％dss溶液，8-15天(干预期)灌胃200mg/kg小鼠体重剂量的蛋清肽fgy)。整个实验期间内，记录小鼠的体重情况及健康状况。
26.(2)样品收集：经阳性药物及蛋清肽两周后，禁食12h并采用戊巴比妥钠麻醉法处死小鼠，收集小鼠血液、远端结肠和盲肠内容物进行后续分析。采集的结肠，固定于4％的组织固定液中，用于h&e病理切片分析。血液样品静置保存于冰盒中，待部分血清析出后，在4℃下，以3500r/min离心10min，取上清液检测炎症因子tnf-α、il-6、il-10、il-22。
27.(3)统计学分析：所有实验重复至少3次，实验结果均用平均值
±
标准差(mean
±
sd)来表示，使用dss 25软件进行各样本间的差异性分析，采用单因素方差分析(anova)比较各样本间的差异性，其中显著差异分析选择“duncan”检验，*表示模型组与各组间差异显著(p《0.05)，**表示模型组与各组间差异极显著(p《0.01)。
28.(4)实验结果：
29.图1实验小鼠体重变化情况
30.实验期间没有小鼠死亡。经造模期自由饮用3％dss溶液后，小鼠出现食欲减退、精神萎靡等症状，个别小鼠具有肛门红肿、粪便溏稀、潜血便血等现象，小鼠体重显著下降，以上结果表明自由饮用3％dss溶液能够诱导小鼠患溃疡性结肠炎。灌胃蛋清肽fgy进行干预后，溃疡性结肠炎小鼠体重明显回升。结果证明蛋清肽fgy能够从恢复结肠炎小鼠体重方面辅助缓解溃疡性结肠炎。
31.图2实验小鼠的结肠病理切片
32.结肠病理切片能够直观评价结肠病变程度及缓解情况。经自由饮用3％dss溶液后，模型组小鼠结肠组织发生显著病变。h&e病理切片结果表明，模型组小鼠结肠中隐窝结构丢失、杯状细胞数量减少或消失以及炎症因子浸润等现象。经5-氨基水杨酸和蛋清肽fgy干预后，小鼠结肠组织被重塑，隐窝结构重新出现，杯状细胞数量增加，炎性细胞浸润等现象消失，以上结果表明蛋清肽fgy能够从重塑结肠组织结构方面辅助缓解溃疡性结肠炎。
33.图3实验小鼠的血清炎症因子浓度
34.血清促炎因子水平的增加和抗炎因子水平降低是炎症的重要指标，常见的促炎因子如tnf-α和il-6增加，常见于dss诱导的结肠炎动物和溃疡性结肠炎患者。结肠组织中炎症因子的结果如图3所示。与对照组相比，模型组小鼠的结肠中促炎因子水平显著上升，抗炎因子水平显著下降。以上结果会造成严重的结肠损伤。经过蛋清肽fgy灌胃干预后，小鼠
结肠中促炎因子水平显著下降，抗炎因子水平显著上升。与模型组组相比，蛋清肽fgy灌胃组的促炎因子tnf-α、il-6分别降低了20.08％和71.14％。抗炎因子il-10、il-22分别升高了12.37％和40.63％。上述结果证实，蛋清肽fgy能够从抑制炎症反应的角度辅助缓解溃疡性结肠炎。
35.以上所述仅为本发明的优选实施例，对于本领域的普通技术人员，可以在不脱离本发明的原理和精神的情况下，对上述实施例进行多种改进和润饰，这些改进和润饰都属于本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有辅助治疗溃疡性结肠炎损伤作用的蛋清肽序列fgy(phe-gly-tyr)在开发肠道增稳型蛋清源生物活性肽类功能性食品并推广其在溃疡性结肠炎辅助治疗中的应用；其特征在于，所述含蛋清肽fgy的功能性食品与模型组组相比，蛋清肽fgy灌胃组的促炎因子tnf-α、il-6分别降低了20.08％和71.14％；抗炎因子il-10、il-22分别升高了12.37％和40.63％。

技术总结
本发明属于生物活性肽领域，具体涉及一条具有辅助治疗溃疡性结肠炎作用的蛋清肽序列及其应用。具体而言，该蛋清肽的制备通过“益生菌-辅助剂”协同发酵法，经体外模拟胃肠道消化后，通过质谱手段确定其序列。蛋清肽FGY(Phe-Gly-Tyr)可以显著缓解由溃疡性结肠炎导致的结肠组织溃疡、隐窝丢失和炎症因子浸润等症状，同时降低小鼠血清中促炎因子(TNF-α、IL-6)水平，提高抗炎因子(IL-10、IL-22)水平。本发明为蛋品精深加工和高活性蛋清肽定向制备提供了新思路，为溃疡性结肠炎辅助治疗中应用的功能性食品开发提供了新视角。功能性食品开发提供了新视角。功能性食品开发提供了新视角。


技术研发人员：张婷 吕思雯 潘风光 刘静波 赵颂宁
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/8/31