一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌及其组合物和应用

1.本发明涉及一种预防和缓解结肠炎的乳酸乳球菌及其组合物和应用，尤其涉及一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌及其组合物和应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.现有技术中，乳酸乳球菌的有氧呼吸代谢是否会降低宿主肠道内的氧气含量并不确定。乳酸乳球菌消耗的氧气量是否足以能够抑制沙门氏菌生长也不确定。乳酸乳球菌在宿主体内进行有氧呼吸代谢时血红素的添加量也不确定。即，乳酸乳球菌是否能够通过有氧呼吸代谢恢复宿主肠道内厌氧环境和维护肠道菌群稳态来预防和缓解结肠炎尚不明确。本研究利用前期获得的能够进行有氧呼吸的乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis，l.lactis)klds 4.0325，通过沙门氏菌诱导的肠炎小鼠模型实验，基于分子生物学、组织学、免疫学、肠道内环境和肠道微生态，研究乳酸菌预防和缓解结肠炎的效果，并探讨其作用机制。为开发潜在的抗生素替代品提供理论依据，对于保护人类健康具有重大意义。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是，提供一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌及其组合物和应用。
4.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
5.一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌组合物，包括以下组分：活菌数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
cfu/g的乳酸乳球菌亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325和血红素；血红素与klds 4.0325的质量比为1：(50-150)。
6.本发明的组合物在制备预防结肠炎药物中的应用。
7.本发明的组合物在制备缓解结肠炎药物中的应用。
8.本发明的组合物在制备缓解肠道损伤药物中的应用。
9.组合物降低宿主沙门氏菌载量。
10.组合物改善宿主肠道病理学变化。
11.一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌，包括活菌数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
cfu/g的乳酸乳球菌亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325。
12.本发明的乳酸乳球菌在制备预防结肠炎药物中的应用。
13.本发明的乳酸乳球菌在制备缓解结肠炎药物中的应用。
14.本发明的乳酸乳球菌在制备制备缓解肠道损伤药物中的应用。
15.本发明具有以下有益效果：
16.与模型组相比，l.lactis klds 4.0325联合血红素可提高小鼠存活率和体重，显著降低疾病活动指数；显著降低盲肠和结肠内沙门氏菌载量，并抑制毒力基因sipb、sipc和sope2的表达；显著增加结肠长度，降低脏器指数，并缓解组织病理反应；显著上调结肠zo-1表达，但下调了occludin和muc2表达；显著降低血清中脂多糖和c-反应蛋白浓度。
17.综上所述，l.lactis klds 4.0325能够通过有氧呼吸恢复由于鼠伤寒沙门氏菌感染引起的肠道菌群紊乱，减少宿主肠道内鼠伤寒沙门氏菌载量并限制其移位，降低鼠伤寒沙门氏菌毒力基因的表达水平，促进小鼠肠道细胞的自噬作用并抑制nf-κb通路，从而缓解炎症反应，显著降低血清中脂多糖和c-反应蛋白浓度，改善宿主肠道感染症状。因此，l.lactis klds 4.0325可以通过有氧呼吸预防宿主鼠伤寒沙门氏菌的感染。
附图说明
18.图1为小鼠存活率和体重变化以及dai评分图，其中，(a)小鼠存活率，(b)小鼠体重变化，(c)感染第6天小鼠疾病活动指数(dai)评分结果；
19.图2为小鼠肠道内容物中沙门氏菌载量，其中，(a)盲肠内容物中s.typhimurium sl1344载量，(b)结肠内容物s.typhimurium sl1344载量；
20.图3为小鼠结肠长度；
21.图4为小鼠肠道组织病理学变化；
22.图5为小鼠脏器指数；
23.图6为小鼠肝脏组织病理学变化，其中，(a)对照组，(b)模型组，(c)l.lactis klds 4.0325+血红素组，(d)l.lactis klds 4.0325+pbs组(e)lgg组；红色箭头代表肝细胞灶性坏死，黄色箭头代表炎症细胞浸润，蓝色箭头代表脂肪空泡；
24.图7为小鼠体内沙门氏菌毒力基因表达水平，其中，(a)sipb表达水平，(b)sipc表达水平，(c)sope2表达水平；
25.图8为小鼠结肠屏障相关基因表达水平，其中，(a)结肠zo-1水平，(b)结肠occludin水平，(c)结肠muc2水平；
26.图9为小鼠结肠屏障相关蛋白表达水平；
27.图10为小鼠结肠中细胞因子的浓度，其中，(a)结肠tnf-α水平，(b)结肠ifn-γ水平，(c)结肠il-1β水平，(d)结肠il-10水平，(e)结肠siga水平；
28.图11为小鼠血清中lps和crp浓度，其中，(a)血清lps水平，(b)血清crp水平；
29.图12为小鼠血清中细胞因子浓度，其中，(a)血清tnf-α水平，(b)血清il-1β水平，(c)血清il-10水平；
30.图13为小鼠结肠自噬、nf-κb相关基因表达水平，其中，(a)结肠lc3-α水平，(b)结肠nf-κb p65水平；
31.图14为小鼠结肠自噬、nf-κb相关蛋白表达水平，其中，(a)结肠lc3水平，(b)结肠nf-κb p65水平；
32.图15为小鼠肠道菌群的多样性分析，其中，(a)chao 1指数；(b)主成分分析(pca)图；
33.图16为小鼠肠道菌群在门水平上的组成；
34.图17为小鼠肠道菌群在属水平上的组成；
35.图18为肠道微生物的lefse分析；
36.图19为spearman相关性分析热图，其中，红色代表正相关，绿色代表负相关，颜色越深代表相关性越强。*代表差异显著(p《0.05)，**代表差异极显著(p《0.01)；
37.图20为代谢通路差异比较；
38.图21为小鼠肠道内容物中短链脂肪酸的含量；
39.图22为差异表达基因火山图，其中，(a)模型组vs对照组，(b)l.lactis klds 4.0325+血红素组vs模型组。图中红色点表示上调的差异基因，蓝色点表示下调的差异基因，灰色点表示无差异基因；
40.图23为差异表达基因go分类，其中，(a)模型组vs对照组，(b)l.lactis klds 4.0325+血红素组vs模型组；
41.图24为差异表达基因kegg富集气泡图，其中，(a)模型组vs对照组，(b)l.lactis klds 4.0325+血红素组vs模型组。气泡颜色代表p-value的高低变化，气泡大小代表差异表达基因的个数。
具体实施方式
42.下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
43.乳酸乳球菌乳亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325保藏于东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，该菌株采集于中国新疆牧民自制的酸马奶中。现有技术来源为：刘飞，李柏良，杜金城，于上富，丁秀云，徐敏，霍贵成.基于基因水平研究乳酸乳球菌的有氧呼吸代谢[j].现代食品科技，2016，32(09)：56-61+215。公众可以从东北农业大学获得。
[0044]
实施例1
[0045]
1、有氧呼吸乳酸乳球菌预防小鼠沙门氏菌感染的作用
[0046]
1.1、有氧呼吸乳酸乳球菌对沙门氏菌感染小鼠的影响
[0047]
为了研究有氧呼吸乳酸乳球菌是否能减轻鼠伤寒沙门氏菌给小鼠带来的损伤，实验动物采用7周龄雄性c57bl/6j小鼠，共计100只。小鼠自由摄取水与饲料，适应喂养1周后，随机分为5组(表1)，分别为：对照组(n)、模型组(m)、有氧呼吸组(h)、发酵代谢组(c)和lgg处理组(g)，每组20只；实验周期为25d，1～14d为预防期，第15天为建模期，16～25d为观察期。预防期期间，每只小鼠的灌胃剂量为0.2ml/d，实验组小鼠所需的血红素或pbs添加到菌悬液中再灌胃，添加量为原培养基体积的2％，连续14d后停止灌胃；第15天，所有小鼠禁水禁食2h，对照组小鼠灌胃0.1ml pbs溶液，其他组小鼠灌胃0.1ml s.typhimurium sl1344菌悬液，灌胃后立即供水，2h后喂食饲料。第22天，部分小鼠麻醉后处死，收集相关组织进行后续检测。从给小鼠灌胃鼠伤寒沙门氏菌s.typhimurium sl1344开始，每天观察并记录小鼠的活动情况。
[0048]
表1有氧呼吸乳酸乳球菌对沙门氏菌的体内抑制实验动物分组tab.1animal experimental design of inhibitory effects of aerobic respiration l.lactis klds 4.0325on mice
[0049]
infected with s.typhimurium sl1344
[0050][0051]
由生存曲线变化(图1a)可知，小鼠死亡首先开始于感染后第4天的g组，主要集中在感染第6天之后。感染后的第10天，n组无死亡发生；m组(3/9)和g组(3/9)存活率最低，为33.33％；h组(5/9)和c组(5/9)的存活率为55.56％。
[0052]
小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后，体重总体呈现先上升后下降的趋势，而未感染的n组小鼠体重始终呈现上升趋势(图1b)。灌胃s.typhimurium sl1344当天对小鼠体重进行了测量，各组间无显著差异(p》0.05)。小鼠体重在感染后的第3天开始下降，到感染后第6天，m组小鼠的体重显著低于其他四组(p《0.05)，表明l.lactis klds 4.0325和lgg能够缓解s.typhimurium sl1344感染引起的体重下降。
[0053]
通过对小鼠活动情况的观察发现，相比于n组，小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌后第3天开始精神萎靡，食欲不振，出现抱团现象；第4天开始出现轻微便稀现象，但粪便形态依旧成形；第6天后出现抽搐甚至死亡等现象。计算了取材前一天(感染后第6天)的dai评分(图1c)，与n组正常小鼠相比，经鼠伤寒沙门氏菌感染的m组小鼠dai分数显著提高(p《0.05)，l.lactis klds 4.0325和lgg干预处理均能够显著减少鼠伤寒沙门氏菌感染引起的dai上调(p《0.05)，且h组能恢复至接近n组水平(p》0.05)，而c组小鼠dai分数显著高于n组(p《0.05)，表明l.lactis klds 4.0325联合血红素比其单独灌胃能够更好的改善鼠伤寒沙门氏菌感染引起的疾病状态。
[0054]
1.2、小鼠肠道内容物沙门氏菌载量
[0055]
本研究利用具有链霉素抗性的s.typhimurium sl1344感染小鼠，通过选用能够分离肠道致病菌的麦康凯琼脂培养基，并加入链霉素，特异性筛选所检沙门氏菌，从而对各组小鼠肠道内容物中s.typhimurium sl1344载量进行检测(图2)。结果表明，三个处理组(h组、c组、g组)均能显著减少结肠和盲肠内容物中的鼠伤寒沙门氏菌载量(p《0.05)，在结肠内容物中，h组和c组显著低于g组(p《0.05)，表明l.lactis klds 4.0325减少鼠伤寒沙门氏菌在宿主结肠内定植的效果更好。
[0056]
1.3、小鼠肠道病理学变化
[0057]
结肠的长度一定程度上能够反映小鼠肠道炎症的严重程度，结肠越短，严重程度越高，因此可以作为表征炎症程度的生物学指标。实验取材时，用直尺对各组小鼠的结肠长度进行了测量(图3)，n组小鼠的结肠长度最长，经鼠伤寒沙门氏菌感染后的小鼠结肠长度显著降低(p《0.05)，与m组相比，h组、c组和g组均显著增加了结肠长度(p《0.05)，其中h组略高于c和g组(p》0.05)。
[0058]
取固定盲肠和结肠进行切片和he染色，观察肠道组织的病理学变化(图4)。n组正常小鼠的肠道组织结构正常，黏膜结构整齐紧密，隐窝结构清晰完整，无细胞浸润。与之相反，鼠伤寒沙门氏菌感染后的肠道组织结构异常，盲肠部分黏膜层上皮细胞脱落，固有层裸露，黏膜下层间隙增大，出现炎症细胞浸润现象；结肠黏膜下层有水肿，组织间隙增大，组织可见炎症细胞灶性浸润。三个处理组(h组、c组、g组)的肠道组织损伤均有所改善，上皮细胞排列整齐，黏膜下层无水肿或轻度水肿，炎症细胞浸润现象减少，且h组的改善效果最明显。图4中，红色箭头代表上皮细胞脱落，蓝色箭头代表组织间隙增大，黄色箭头代表炎症细胞浸润。
[0059]
1.4、小鼠脏器病理学变化
[0060]
脏器指数能够反应免疫功能的强弱，其计算公式如下。
[0061][0062]
本研究在实验取材时对脾脏和肝脏进行了称重，并计算出脏器指数(图5)。相比于n组，感染鼠伤寒沙门氏菌的m组小鼠的脾脏指数和肝脏指数均显著增加(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)均能显著降低鼠伤寒沙门氏菌感染后的脾脏指数，且h组效果最好(p《0.05)；对于肝脏指数，h组小鼠显著低于m组(p《0.05)，c组和g组略低于m组，但无显著差异(p》0.05)。上述结果表明，l.lactis klds 4.0325联合血红素缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的脾脏和肝脏肿大效果更好。
[0063]
通过he染色观察小鼠肝脏的病理学变化(图6)，n组正常小鼠肝组织结构正常，胞核圆润，肝窦大小均匀，无炎症细胞浸润。而经鼠伤寒沙门氏菌感染后的小鼠肝脏出现明显病灶，组织结构异常，出现大量肝细胞灶性坏死，可观察到大量炎症细胞浸润。三个处理组对肝损伤均有不同程度的缓解：h组无明显炎症浸润，仅肝细胞轻度变性，有少量脂肪空泡；c组炎症浸润现象减少；g组干细胞结构完整，但仍存在炎症浸润现象。上述结果表明，l.lactis klds 4.0325和lgg均可在一定程度上缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的肝损伤，l.lactis klds 4.0325联合血红素时效果最好。
[0064]
1.5、有氧呼吸乳酸乳球菌对宿主体内沙门氏菌毒力基因的影响
[0065]
由现有技术可知，在体外，l.lactis klds 4.0325能够通过有氧呼吸抑制鼠伤寒沙门氏菌sipb、sipc和sope2毒力基因的表达。因此，本研究利用rt-qpcr检测宿主体内定植的鼠伤寒沙门氏菌毒力基因的表达情况(图7)。与n组正常小鼠相比，m组的毒力基因均显著上调(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)均能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌毒力基因的表达(p《0.05)，且l.lactis klds 4.0325联合血红素比单独使用的效果更好。
[0066]
1.6、有氧呼吸乳酸乳球菌对小鼠肠道屏障的影响
[0067]
1.6.1、肠道屏障基因的mrna表达
[0068]
肠道是人体的第一道防护屏障，肠道屏障通透性的改变会导致多种抗原进入全身
循环，从而诱发炎症和肠外器官损伤。本研究利用rt-qpcr检测小鼠结肠紧密连接蛋白基因zo-1和occludin以及黏蛋白基因muc2的表达情况。
[0069]
紧密连接蛋白的转录表达结果显示，相比于n组，鼠伤寒沙门氏菌感染后的m组小鼠结肠zo-1表达显著下调(p《0.05)，g组小鼠结肠zo-1表达同样显著下调(p《0.05)，而h组小鼠结肠zo-1表达恢复至n组正常小鼠水平(p》0.05)(图8a)；对于结肠occludin表达，经鼠伤寒沙门氏菌感染的m组显著上调(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)均显著降低由于鼠伤寒沙门氏菌感染引起的occludin表达上调(p《0.05)(图8b)。
[0070]
黏蛋白muc2转录表达结果显示，鼠伤寒沙门氏菌感染后的m组小鼠结肠muc2表达显著上调(p《0.05)，三个处理组干预后均有所恢复，其中h组恢复至接近n组正常小鼠(p》0.05)，而g组muc2表达相比于n组显著下调(p《0.05)(图8c)。
[0071]
1.6.2、肠道屏障蛋白的表达
[0072]
采用western-blot再次检测小鼠结肠屏障蛋白的表达情况，三种蛋白的表达水平变化与其mrna表达变化结果一致。
[0073]
紧密连接蛋白表达结果显示，与n组正常小鼠相比，m组小鼠结肠zo-1表达显著下降(p《0.05)，与m组相比，h组结肠zo-1表达显著升高(p《0.05)，而g组小鼠结肠zo-1表达最低(图9)；对于结肠occludin表达，m组显著高于n组(p《0.05)，而相比于m组，三个处理组(h组、c组、g组)均显著降低结肠occludin表达(p《0.05)(图9)。
[0074]
黏蛋白muc2表达结果显示，与n组相比，m组小鼠结肠muc2表达显著升高(p《0.05)，与m组相比，三个处理组(h组、c组、g组)均显著降低结肠muc2表达(p《0.05)，其中h组恢复至接近n组正常小鼠(p》0.05)(图9)。
[0075]
上述结果表明，有氧呼吸代谢l.lactis klds 4.0325能够恢复由鼠伤寒沙门氏菌感染引起的肠屏障改变，稳定紧密连接zo-1，降低由鼠伤寒沙门氏菌提高的occludin和muc2。不同字母表示具有显著差异(p《0.05)
[0076]
1.7、有氧呼吸乳酸乳球菌对小鼠肠道免疫的影响
[0077]
发炎的肠道内产生的炎性细胞因子在其病理过程中发挥非常重要的作用，调节这些因子平衡能够帮助阻止炎症反应。本研究利用elisa试剂盒检测小鼠结肠组织中tnf-α、inf-γ、il-1β、il-10和siga水平(图10)。与n组正常小鼠相比，感染鼠伤寒沙门氏菌的m组小鼠结肠中促炎细胞因子tnf-α、ifn-γ和il-1β显著升高(p《0.05)，而抑炎细胞因子il-10和免疫球蛋白siga显著下降(p《0.05)，这表明鼠伤寒沙门氏菌感染能够引起小鼠结肠炎症；与m组相比，三个处理组(h组、c组、g组)均显著降低了结肠tnf-α、ifn-γ和il-1β水平(p《0.05)，并显著提高了结肠il-10水平(p《0.05)，但三个处理组(h组、c组、g组)的siga水平仅略高于m组，无显著差异(p》0.05)。上述结果表明，有氧呼吸代谢l.lactis klds 4.0325能够调节结肠免疫，抑制促炎细胞因子水平，提高抑炎细胞因子水平，从而缓解鼠伤寒沙门氏菌感染引起的炎症反应。
[0078]
1.8、有氧呼吸乳酸乳球菌对小鼠抗全身性感染能力的影响
[0079]
lps(脂多糖)是许多致病菌细胞壁中的成分，其对宿主具有致病性。相较于n组，m组小鼠经鼠伤寒沙门氏菌感染后，血清中lps浓度显著升高(p《0.05)，而三个处理组(h组、c组、g组)小鼠血清lps水平显著低于m组(p《0.05)(图11a)。
[0080]
血液中crp水平是临床中诊断细菌感染的一项指标。经鼠伤寒沙门氏菌感染的小
鼠血清中crp浓度显著升高(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)均显著降低了血清中的crp含量(p《0.05)(图11b)。
[0081]
炎症发生时，细胞因子也会分泌到血液当中，因此检测了小鼠血清中tnf-α、il-1β和il-10水平(图12)。与n组正常小鼠相比，经鼠伤寒沙门氏菌感染的m组小鼠血清中促炎细胞因子tnf-α和il-1β显著升高(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)均显著降低了tnf-α和il-1β水平(p《0.05)，且il-1β恢复至接近正常水平(p》0.05)。与n组正常小鼠相比，m组显著降低了抑炎细胞因子il-10水平(p《0.05)，h组和c组显著提高了鼠伤寒沙门氏菌感染后il-10水平(p《0.05)，g组略有升高，但并未达到显著性差异(p》0.05)。上述结果表明，有氧呼吸代谢l.lactis klds 4.0325能够降低血清中由鼠伤寒沙门氏菌引起的促炎细胞因子水平，提高抑炎细胞因子水平，缓解鼠伤寒沙门氏菌引起的全身性感染。
[0082]
1.9、有氧呼吸乳酸乳球菌对小鼠自噬和nf-κb通路的影响
[0083]
1.9.1、通路相关基因的mrna表达
[0084]
为阐明有氧呼吸乳酸乳球菌抵抗鼠伤寒沙门氏菌侵袭的机制，本研究利用rt-qpcr检测结肠自噬和nf-κb信号通路过程的关键基因的表达水平。
[0085]
微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，lc3)是自噬的一个重要调节因子，其通过与自噬效应因子相互作用而与膜结合，从而启动自噬体的发生。lc3-α是lc3的一个亚型，是自噬激活的重要标志物。与m组相比，l.lactis klds 4.0325干预后显著上调lc3-α表达量(p《0.05)，且h组lc3-α水平显著高于其他各组(p《0.05)，而c组与m组无显著差异(p》0.05)(图13a)。
[0086]
nf-κb信号通路能够参与机体的免疫反应和炎症反应，其转录活性受翻译后修饰的完全激活所调节。与n组正常小鼠相比，m组小鼠结肠中p65表达显著上调(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)中p65表达也显著上调(p《0.05)，但相对于m组，h组和g组p65表达水平显著下降(p《0.05)(图13b)。
[0087]
1.9.2、通路相关蛋白的表达
[0088]
结果与其mrna表达变化结果相符。
[0089]
lc3
‑ⅰ
和lc3
‑ⅱ
是lc3的两种形式，自噬发生时，胞质形式的lc3
‑ⅰ
会转化为膜型的lc3
‑ⅱ
，因此lc3
‑ⅱ
/lc3
‑ⅰ
可用作自噬标志物。自噬通路关键蛋白表达结果显示，与m组小鼠相比，h组和c组小鼠lc3
‑ⅱ
/lc3
‑ⅰ
水平显著升高(p《0.05)(图14a)。
[0090]
nf-κb信号通路关键蛋白表达结果显示，与n组正常小鼠相比，m组小鼠结肠中nf-κb p65水平显著增加(p《0.05)，三个处理组(h组、c组、g组)均能够降低鼠伤寒沙门氏菌感染后p65水平(p《0.05)，且h组和g组抑制nf-κb活性效果更好(图14b)。
[0091]
上述结果表明，有氧呼吸代谢l.lactis klds 4.0325能够激活自噬和抑制nf-κb信号通路，从而清除鼠伤寒沙门氏菌并抑制肠道炎症。
[0092]
1.10、小鼠结肠内容物的菌群结构
[0093]
1.10.1、菌群多样性的变化
[0094]
为研究不同干预处理对小鼠肠道微生物的影响，利用16s rdna测序技术进行检测。首先比较了小鼠肠道菌群α多样性和β多样性的变化。
[0095]
α多样性聚焦于样本内菌群的多样性，本研究采用chao 1指数来评估α多样性，chao 1指数越大代表物种总数越多。结果显示，鼠伤寒沙门氏菌感染的m组小鼠菌群chao 1
指数略低于n组，干预处理后h组和g组小鼠菌群chao1指数略高于m组，且h组的chao 1指数更高，但各组间无显著差异(p》0.05)(图15a)。
[0096]
β多样性聚焦于不同样本间的菌群组成的差异，本研究采用主成分分析(pca)来衡量β多样性。结果显示，n组与m之间的距离大于n组与h组之间的距离(图15b)，这表明鼠伤寒沙门氏菌会干扰小鼠肠道菌群组成，而l.lactis klds 4.0325联合血红素能够一定程度恢复小鼠肠道菌群组成。
[0097]
1.10.2、菌群结构在门水平变化
[0098]
在分析了菌群多样性后，本研究比较了小鼠肠道菌群在门水平上的组成(图16)。结果显示，拟杆菌门(bacteroidota)、厚壁菌门(firmicutes)、变形菌门(proteobacteria)和放线菌门(actinobacteriota)是小鼠肠道菌群主要构成菌。对照组小鼠的优势菌群为厚壁菌门(50.54％)、拟杆菌门(41.37％)、脱硫杆菌门(desulfobacterota，5.05％)和放线菌门(2.37％)；与之相比，鼠伤寒沙门氏菌感染后的m组小鼠厚壁菌门(24.20％)、放线菌门(1.76％)和脱硫杆菌门(0.46％)丰度降低，而变形菌门丰度显著增加，从n组的0.07％增加至18.08％。三个处理组(h组、c组、g组)均可以在不同程度上恢复这种紊乱，但h组恢复程度最接近n组小鼠。通过l.lactis klds 4.0325联合血红素对小鼠进行干预处理，能够增加厚壁菌门(32.79％)、放线菌门(2.19％)和脱硫杆菌门(2.12％)的丰度，降低变形菌门(0.29％)丰度。另外，经鼠伤寒沙门氏菌感染的m组小鼠肠道内能够引起细菌性胃肠炎的弯曲杆菌门(campilobacterota)丰度增加，而patescibacteria和疣微菌门(verrucomicrobiota)丰度减少，h组可改善这一变化。
[0099]
1.10.3、菌群结构在属水平变化
[0100]
在分析了门水平后，对每个物种在各组样品的相对丰度进行属水平的热图分析(图17)。相比于n组，鼠伤寒沙门氏菌感染后的m组小鼠肠道内肠杆菌属(enterobacter)、埃希氏-志贺氏菌属(escherichia-shigella)、副萨特氏菌属(parasutterella)、mucispirillum属、拟普雷沃氏菌属(alloprevotella)、拟杆菌属(bacteroides)和螺杆菌属(helicobacter)等相对丰度增加，而[eubacterium]_siraeum_group属、[eubacterium]_xylanophilum_group属、colidextribacter属、marvinbryantia属、lachnospiraceae_ucg-006属和脱硫弧菌属(desulfovibrio)等相对丰度减少；l.lactis klds 4.0325联合血红素的干预处理能够恢复这些变化。此外，g组与h组相比，产短链脂肪酸的anaerotruncus属、blautia属和muribaculum属等相对丰度增加。
[0101]
1.10.4、物种差异分析
[0102]
本研究利用lefse软件进一步分析了m组与h组小鼠肠道微生物的物种差异(图18)。相比于h组，m组小鼠肠道菌群中变形菌门丰度显著提高，包括肠杆菌属、埃希氏-志贺氏菌属和栖水菌属(enhydrobacter)等(lda》2)，这些都是兼性厌氧菌；而与m组相比，l.lactis klds 4.0325联合血红素的干预后的h组小鼠肠道菌群中厚壁菌门显著提高，包括[eubacterium]_coprostanoligenes_group属、[eubacterium]_xylanophilum_group属和lachnospiraceae_ucg-006属等，这些都是专性厌氧菌。上述结果与肠道菌群在门水平和属水平变化的研究结果一致。
[0103]
1.10.5、生理指标与肠道菌群属水平的相关性分析
[0104]
为了研究l.lactis klds 4.0325联合血红素干预处理后小鼠肠道菌群在预防和
缓解鼠伤寒沙门氏菌感染中的作用，本研究对m组和h组的小鼠肠道菌群与小鼠脏器指数(spleen index和liver index)、结肠细胞因子(tnf-α、ifn-γ、il-1β和il-10)、lps、crp以及信号通路(autophagy和nf-κb)之间的spearman相关性进行分析(图19)。结果显示，脾脏指数(spleen index)与[eubacterium]_coprostanoligenes_group呈显著负相关；肝脏指数(liver index)与[eubacterium]_coprostanoligenes_group和[eubacterium]_siraeum_group呈显著负相关；结肠tnf-α与alloprevotella、enterobacter和faecalibaculum呈显著正相关，与muribaculaceae呈显著负相关；结肠ifn-γ与alloprevotella呈显著正相关，与[eubacterium]_coprostanoligenes_group和muribaculaceae呈显著负相关；结肠il-1β与bacteroides和enterobacter呈显著正相关，与desulfovibrio和muribaculaceae呈显著负相关；结肠il-10与alloprevotella呈显著负相关；血清crp与enterobacter和faecalibaculum呈显著正相关，与[eubacterium]_coprostanoligenes_group和muribaculaceae呈显著负相关；自噬通路(autophagy)与desulfovibrio呈显著正相关；nf-κb信号通路与enterobacter和faecalibaculum呈显著正相关，与clostridia_ucg-014呈显著负相关。上述结果表明肠道菌群与鼠伤寒沙门氏菌感染后对宿主生理指标的影响有一定的相关性。
[0105]
1.10.6、功能丰度差异分析
[0106]
为了研究经鼠伤寒沙门氏菌感染的m组和l.lactis klds 4.0325联合血红素干预处理的h组之间潜在的功能差异，利用picrust根据肠道菌群的构成推测样本中功能基因的构成，从而比较m组和h组之间的功能丰度差异(图20)。结果显示，相比于m组，h组在半乳糖代谢(galactose metaboism)、氨基糖和核苷酸糖代谢(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、糖酵解/糖异生(glycolysis/gluconeogenesis)、初级胆汁酸合成(primary bile acid biosynthesis)、次级胆汁酸合成(secondary bile acid biosynthesis)和淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)等相关通路丰度增加；而在脂多糖生物合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis proteins)、霍乱弧菌感染(vibrio cholerae infection)、细胞运动和分泌(cell motility and secretion_unclassified)、脂多糖生物合成(lipopolysaccharide biosynthesis)、细菌分泌系统(bacterial secretion system)、鞭毛组装(flagellar assembly)、霍乱弧菌致病周期(vibrio cholerae pathogenic cycle)、细菌运动蛋白(bacterial motility proteins)和志贺菌病(shigellosis)等相关通路丰度减少。
[0107]
1.11、有氧呼吸乳酸乳球菌对小鼠肠道内容物中短链脂肪酸的影响
[0108]
短链脂肪酸(short-chain fatty acid，scfa)是肠道微生物的重要代谢产物，其对人体具有免疫调节作用。因此，本研究利用gc-ms的方法对小鼠肠道内容物中scfa的含量进行检测(图21)。相比于n组，经鼠伤寒沙门氏菌感染的m组小鼠肠道内容物中丙酸和丁酸含量均有所下降，但并未达到显著性差异(p》0.05)，l.lactis klds 4.0325联合血红素干预后乙酸、丙酸和丁酸水平略上调(p》0.05)，lgg处理显著提高了乙酸、丙酸和丁酸的含量(p《0.05)。
[0109]
1.12、小鼠结肠组织的转录组学分析
[0110]
1.12.1、差异表达基因
[0111]
本研究利用结肠转录组数据分析基因分布，结果显示l.lactis klds 4.0325联合
血红素干预处理能够影响基因表达分布。m组相对于n组有1884个差异表达基因，其中上调807个，下调1077个(图22a)；h组相对于m组有1455个差异表达基因，其中上调891个，下调564个(图22b)。
[0112]
1.12.2、差异表达基因go富集分析
[0113]
为进一步探讨这些差异表达基因的影响，本研究进行了差异表达基因的go功能富集分析。go共有三个本体，分别为生物过程、细胞组分和分子功能。
[0114]
m组和n组的差异表达基因主要参与细胞过程(cellular process)、单有机体过程(single-organism process)和生物调节(biological regulation)等生物过程；差异表达基因主要调控的细胞组分为细胞(cell)、细胞部分(cell part)和细胞器(organelle)等；结合(binding)、催化活性(catalytic activity)和分子传导活性(molecular transducer activity)等是富集基因最多的分子功能(图23a)。
[0115]
h组相对m组的差异表达基因主要参与细胞过程、单有机体过程和生物调节等生物过程；差异表达基因主要调控的细胞组分为细胞、细胞部分和膜(membrane)等；结合、催化活性和分子传导活性等是富集基因最多的分子功能(图23b)。
[0116]
1.12.3、差异表达基因kegg富集分析
[0117]
本研究利用kegg分析研究了与各组小鼠结肠组织的代谢通路(图24)。m组和n组的差异基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)等代谢通路(图24a)，h组和m组的差异基因参与了细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子(chemokine signaling pathway)和nf-κb等代谢通路(图24b)。
[0118]
实施例2
[0119]
本实施例与实施例1的区别仅在于：
[0120]
一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌组合物，包括以下组分：活菌数为1.0
×
108cfu/g的乳酸乳球菌亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325和血红素；血红素与klds 4.0325的质量比为1：50。
[0121]
一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌，包括活菌数为1.0
×
108cfu/g的乳酸乳球菌亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325。
[0122]
实施例3
[0123]
本实施例与实施例1的区别仅在于：
[0124]
一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌组合物，包括以下组分：活菌数为1.0
×
10
10
cfu/g的乳酸乳球菌亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325和血红素；血红素与klds 4.0325的质量比为1：150。
[0125]
一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌，包括活菌数为1.0
×
10
10
cfu/g的乳酸乳球菌亚种(lactococcus lactis subsp.lactis)klds 4.0325。
[0126]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌组合物，其特征在于，包括以下组分：活菌数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
cfu/g的乳酸乳球菌亚种（lactococcus lactis subsp. lactis）klds 4.0325和血红素；血红素与klds 4.0325的质量比为1：（50-150）。2.根据权利要求1所述的组合物在制备预防结肠炎药物中的应用。3.根据权利要求1所述的组合物在制备缓解结肠炎药物中的应用。4.根据权利要求1所述的组合物在制备缓解肠道损伤药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，组合物降低宿主沙门氏菌载量。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，组合物改善宿主肠道病理学变化。7.一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌，其特征在于，包括活菌数为1.0
×
10
8-1.0
×
10
10
cfu/g的乳酸乳球菌亚种（lactococcus lactis subsp. lactis）klds 4.0325。8.根据权利要求7所述的乳酸乳球菌在制备预防结肠炎药物中的应用。9.根据权利要求7所述的乳酸乳球菌在制备缓解结肠炎药物中的应用。10.根据权利要求7所述的乳酸乳球菌在制备制备缓解肠道损伤药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种具有缓解沙门氏菌所致小鼠肠道损伤的乳酸乳球菌及其组合物和应用，属于微生物技术领域。组合物包括以下组分：活菌数为1.0


技术研发人员：刘飞 张钰龙 杨涵 程之梁 哈惠 王潆笛 陈菲菲
受保护的技术使用者：东北农业大学
技术研发日：2023.06.30
技术公布日：2023/8/31