解脂耶氏酵母基因工程菌及其在β-胡萝卜素生产中的应用

解脂耶氏酵母基因工程菌及其在
β-胡萝卜素生产中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程菌领域，涉及一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其在β-胡萝卜素生产中的应用。


背景技术：

2.β-胡萝卜素是一种含有8个异戊二烯单元的四萜类化合物，是一种橘黄色的脂溶性化合物，属于胡萝卜素或类胡萝卜素家族的一员，广泛存在于众多天然植物中，如红薯、胡萝卜、木瓜、芒果等。β-胡萝卜素不仅能作为人体合成维生素a的前体，而且对提高免疫力、延缓衰老及抑制癌细胞的增殖等方面都有重要作用。藻类是目前生产β-胡萝卜素的重要来源之一，如佛氏绿胶藻chlorogloca frisschi、泥生颤藻oscillatoria limosa和杜氏藻dunaliella，其中，杜氏盐藻dunaliella salina是工业上生产β-胡萝卜素的主要藻类物种。此外，三孢布拉氏霉菌也被用于发酵生产β-胡萝卜素，但无论是藻类还是三孢布拉氏霉菌，均存在生产周期长，生产条件苛刻以及得率低等问题。近年来，大肠杆菌和解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)相继被改造用于异源生产β-胡萝卜素。其中解脂耶氏酵母由于胞内可以储存大量油脂，被认为是可以大量积累β-胡萝卜素的理想宿主。但目前研究用于生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母出发菌株均为yarrowia lipolytica po1系列，而该系列菌株积累胞内油脂的能力并不突出。因此，筛选和诱变获得能够积累较高胞内油脂的解脂耶氏酵母，并以其为出发菌株代谢改造异源生产β-胡萝卜素，有望进一步提高解脂耶氏酵母的生产性能。


技术实现要素：

3.本发明提供一株能够积累较高胞内油脂且高效生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌。
4.发明人以甘油为唯一碳源，通过菌体富集、初筛和复筛，从土壤中筛选出一株具有最高胞内油脂合成能力的解脂耶氏酵母菌株，并以该菌株为出发菌株，经6轮紫外诱变，获得一株胞内油脂合成能力显著增强的突变株sbt，然后将卷枝毛霉来源的八氢番茄红素合成酶carb、八氢番茄红素脱氢酶/番茄红素环化酶carrp和解脂耶氏酵母内源的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶ggpps表达盒以多拷贝形式定点整合到突变株sbt的rdna位点，获得一株高拷贝且能生产β-胡萝卜素的基因工程菌sbt04-015，最后对基因工程菌sbt04-015中的磷酸酶yl_pp基因进行定点敲除，获得能够积累较高胞内油脂且高效生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016。
5.本发明所述的解脂耶氏酵母（yarrowia lipolytica）sbt04-016，已于2023年7月5日在中国典型培养物保藏中心(cctcc)保藏，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为cctcc no：m 20231183。
6.本发明提供上述解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016的培养方法，具体步骤如下：
7.将解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016接种至发酵培养基中，所述的发酵培养基
的碳源为甘油或葡萄糖。
8.优选地，所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/l、酵母提取物20g/l、胰蛋白胨10g/l、ph 5-6，或为：甘油100g/l、酵母提取物20g/l、胰蛋白胨10g/l、ph 5-6。
9.进一步地，本发明提供上述解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016在发酵生产β-胡萝卜素中的应用。
10.具体地，应用方法为：将解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016接种至发酵培养基中，发酵结束后，离心获取菌体，破碎细胞后利用丙酮萃取β-胡萝卜素。
11.本发明还提供一种提高解脂耶氏酵母类胡萝卜素产量的方法，为定点敲除产类胡萝卜素的解脂耶氏酵母中的yl_pp基因，所述的yl_pp基因的核苷酸序列如seq no.37所示。
12.本发明所述的类胡萝卜素为常见的类胡萝卜素，例如β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、叶黄素、虾青素、西红花苷、角黄素、海胆酮等。
13.本发明通过自然筛选获得具有胞内油脂合成能力的解脂耶氏酵母野生菌，再利用紫外诱变和基因工程技术，进一步提高野生菌的β-胡萝卜素的产量。本发明的解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016无论在固体或液体培养基中均为酵母态，未发现菌丝态形成。在氮限条件下，无论是以甘油还是葡萄糖为碳源，除了能在胞内生产积累油脂外，还能高效合成β-胡萝卜素，菌体细胞呈现橙红色。经基因工程改造后，解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016的β-胡萝卜素产量得到进一步提高，在摇瓶发酵水平，β-胡萝卜素产量可达450mg/l，相较于基因工程菌sbt04-015有了显著提升，提升幅度高达50％，在微生物发酵生产β-胡萝卜素领域具有较高的应用前景。
附图说明
14.图1为解脂耶氏酵母菌株sbt和出发菌株在yng50培养基中胞内油脂占干重的比例。
15.图2为包含潮霉素抗性、卷枝毛霉来源的carb、carrp和解脂耶氏酵母内源的ggpps基因表达盒的rdna整合质粒示意图。
16.图3为解脂耶氏酵母sbt04-015和sbt04-016生产β-胡萝卜素的产量。
17.图4为解脂耶氏酵母sbt04-016连续传代10次生产β-胡萝卜素的产量。
具体实施方式
18.下面通过具体实施例进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
19.下述实施例中使用到的质粒是puc19，pina1312和#84615(addgene)。卷枝毛霉来源的carb和carrp基因委托上海擎科生物科技有限公司合成。
20.实施例1：解脂耶氏酵母sbt的获取
21.1.野生解脂耶氏酵母的获取和鉴定
22.发明人于2019年9月30日至10月7日在上海市郊区榨油坊采集土壤样本共计35份，用5ml的灭菌pbs缓冲液重悬样本，12000转/分钟离心15分钟后取2-3ml上清，将500μl上清涂布于分离培养基上，超净台吹干后倒置培养在30℃培养箱直至长出菌落。分离培养基的
组成为(g/l)：甘油100，酵母提取物20，胰蛋白胨10，琼脂20，ph 5-6。
23.用灭菌牙签挑取单菌落直接涂抹于maldi靶板上，自然吹干后在单菌落涂层上加入1μl 70％甲酸溶液，自然吹干后再加入1μl基质溶液，干燥后即可放入maldi biotyper质谱仪中进行测定。以检测器检测到的离子质荷比为横坐标，离子峰为纵坐标生成每个单菌落样本对应的蛋白质组指纹图谱，与数据库中解脂耶氏酵母po1f菌株的图谱进行比对，从中挑选比对结果score value在2以上的菌落。
24.将符合要求的菌落在ypd平板继续划线以获得较纯的单克隆，挑取单克隆到yng50培养基中，30℃、220转/分钟振荡培养72小时，yng50培养基组成为(g/l)：甘油50，酵母提取物0.5，硫酸铵0.5，七水合硫酸镁1.5。离心收集和清洗菌体，重悬菌体于7ml的40％(v/v)盐酸溶液中，置于沸水浴中加热和冰上冷却，随后加入30ml三氯甲烷/甲醇(3:2)溶液，并将上述体系置于37℃摇床振荡培养1小时，离心收集最下层，并在80℃下旋蒸和105℃下烘干1小时获得胞内总油脂，利用gc-ms(aligent6890-5975,aligent technologies,santa clara,ca)和hp-5ms色谱柱测定油脂的含量，得到产油脂最高的单克隆并将其接种到3ml ypd液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养48小时，吸取1-2ml培养液提取基因组。ypd培养基组成为(g/l)：葡萄糖20，酵母提取物20，胰蛋白胨10。以上述基因组为模板用解脂耶氏酵母特征引物26s rdna_f(seq no.1)和26s rdna_r(seq no.2)进行高保真pcr扩增，具有正确大小的目的条带进一步委托上海擎科生物技术有限公司测序验证。将上述dna序列在ncbi blast数据库进行比较，发现与已知的解脂耶氏酵母的26s rdna部分序列具有100％同源性，说明分离得到的野生酵母为解脂耶氏酵母。
25.2.野生解脂耶氏酵母的诱变
26.以上述分离得到的野生酵母为出发菌株，对其进行紫外诱变，以进一步提高合成油脂的能力，获得解脂耶氏酵母突变株sbt：
27.将处于指数生长期的细胞制备成菌悬液，取1ml菌悬液和1颗搅拌子放到培养皿中，置于磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，在距离18w紫外灯25cm处紫外照射150s。将平板取出，快速用锡箔纸包裹并放置于黑暗处4小时。500rpm、5min离心收集菌体，用无菌磷酸缓冲溶液洗涤1-2次，重悬于等体积的无菌磷酸缓冲溶液中，稀释后涂布于筛选平板，30℃培养，挑取长得最大的单克隆到yng50培养基中，30℃，220rpm振荡培养72小时，收集菌体提取油脂，从中筛选获得油脂含量最高的解脂耶氏酵母突变株sbt。筛选平板组成(g/l)：甘油150，酵母提取物20，胰蛋白胨10，琼脂20，ph 5-6。
28.图1为解脂耶氏酵母突变株sbt和出发菌株在yng50培养基中胞内油脂占干重的比例，出发菌株产生的胞内油脂占干重的20％，而突变株sbt胞内油脂占干重的40％，说明通过紫外诱变获得的突变株的油脂产量得到了明显提升。
29.实施例2：解脂耶氏酵母sbt04菌株的构建和筛选
30.1.生产β-胡萝卜素的基因工程解脂耶氏酵母菌株的构建
31.(1)含有潮霉素抗性基因表达盒的重组质粒pina1312_hygr的构建：以pub4-cre质粒为模板，利用引物hyg-f1(seq no.3)和hyg-r1(seq no.4)扩增并纯化潮霉素抗性基因片段；另外，对pina1312质粒进行bamhi和kpni双酶切并纯化回收对应的线性质粒；最后，将上述线性化质粒和潮霉素抗性基因片段进行无缝克隆连接，转化到克隆宿主大肠杆菌jm109中，吸取100-300μl活化后菌液涂布于含有卡那霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养，经菌
落和测序验证后获得正确转化子和含有潮霉素抗性基因表达盒的重组质粒pina1312_hygr。
32.(2)含有卷枝毛霉来源的八氢番茄红素脱氢酶/番茄红素环化酶carrp基因表达盒的重组质粒phr_a08_carrp的构建：根据解脂耶氏酵母密码子的偏好性对卷枝毛霉来源的八氢番茄红素脱氢酶/番茄红素环化酶carrp基因的密码子进行优化，得到优化版的carrp基因序列(seq no.5)，委托上海擎科生物技术有限公司合成，并用引物carrp-f1(seq no.6)和carrp-r1(seq no.7)扩增carrp基因；另外，将addgene#84615phr_a08_hrgfp质粒进行富集，用ptei和nhei双酶切获得线性化质粒；利用无缝克隆技术将纯化后的线性化质粒和carrp基因进行连接并转化到大肠杆菌克隆宿主jm109中，吸取100-300μl活化后的菌液涂布到含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃过夜培养，经菌落pcr和测序验证后得到正确转化子和含有卷枝毛霉来源的八氢番茄红素脱氢酶/番茄红素环化酶carrp基因表达盒的重组质粒phr_a08_carrp。
33.(3)含有解脂耶氏酵母内源的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶ggpps基因表达盒的重组质粒puc19_p
fba
_ggpps_t
pex10
的构建：以解脂耶氏酵母po1f的基因组为模板，首先用引物p
fba-f(seq no.8)和p
fba-r(seq no.9)扩增果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因启动子序列；再用引物ggpps-f(seq no.10)和ggpps-r(seq no.11)扩增牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因序列；然后用引物pex10-f(seq no.12)和pex10-r(seqno.13)扩增过氧化物酶体基质蛋白基因的终止子序列。另外，以puc19质粒为模板，用引物puc19-f(seq no.14)和puc19-r(seq no.15)扩增线性化载体片段。最后，将上述启动子、基因、终止子和线性化质粒片段进行无缝克隆连接并转化到大肠杆菌克隆宿主jm109中，吸取600μl活化后的菌液涂布到含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃过夜培养，经菌落pcr和测序验证后得到正确转化子和含有解脂耶氏酵母内源的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶ggpps基因表达盒的重组质粒puc19_p
fba
_ggpps_t
pex10
。
34.(4)含有卷枝毛霉来源的八氢番茄红素合成酶carb基因表达盒的重组质粒puc19_p
tef
_carb_t
mig
构建：根据解脂耶氏酵母密码子的偏好性对卷枝毛霉来源的八氢番茄红素合成酶carb基因的密码子进行优化，得到优化版的carb基因序列(seq no.16)，委托上海擎科生物技术有限公司合成，并用引物carb-f(seq no.17)和carb-r(seqno.18)扩增并纯化carb基因；以解脂耶氏酵母po1f基因组为模板，用引物p
tef-f(seqno.19)和p
tef-r(seq no.20)扩增并纯化翻译延长因子-1α的启动子序列；其次利用t
mig-f(seq no.21)和t
mig-r(seq no.22)扩增并纯化全局调控子mig1的终止子序列；另外，以puc19质粒为模板，用引物puc19-f(seq no.14)和puc19-r(seq no.15)扩增线性化载体片段。最后，将上述启动子、基因、终止子和线性化质粒片段进行无缝克隆连接并转化到大肠杆菌克隆宿主jm109中，吸取600μl活化后的菌液涂布到含有氨苄青霉素的lb平板上，37℃过夜培养，经菌落pcr和测序验证后得到正确转化子和含有卷枝毛霉来源的八氢番茄红素合成酶carb基因表达盒的重组质粒puc19_p
tef
_carb_t
mig
。
35.(5)仅含有carrp基因表达盒的rdna整合质粒puc19_rdna_p
ut8
_carrp_t
cyc1
的构建：以puc19为模板，用引物puc19-f(seq no.14)和puc19-r(seq no.15)扩增并纯化线性化载体片段；另外，以解脂耶氏酵母po1f基因组为模板，用引物3rdna-f(seq no.23)和3rdna-r(seq no.24)扩增并纯化3rdna片段，用引物5rdna-f(seq no.25)和5rdna-r(seq no.26)
扩增并纯化5rdna片段；以phr_a08_carrp质粒为模板，用引物carrp-f2(seq no.27)和carrp-r2(seq no.28)扩增并纯化carrp基因表达盒；最后将上述线性化质粒、3rdna片段、5rdna片段和carrp基因表达盒用无缝克隆技术进行连接并转化到大肠杆菌克隆宿主jm109中，吸取600μl活化后的菌液涂布到含有氨苄青霉素抗性的lb平板上，经菌落pcr和测序验证后得到正确转化子和仅含有carrp基因表达盒的rdna整合质粒puc19_rdna_p
ut8
_carrp_t
cyc1
。
36.(6)包含潮霉素抗性、ggpps和carb基因表达盒的重组质粒puc19_p
hp4d
_hygr_t
xpr2
_p
fba
_ggpps_t
pex10
_p
tef
_carb_t
mig
的构建：以puc19为模板，用引物puc19-f(seq no.14)和puc19-r(seq no.15)扩增并纯化线性化载体片段；以pina1312_hygr为模板，用引物hp4d-f(seq no.29)和xpr2-r(seq no.30)扩增并纯化潮霉素抗性基因表达盒；以puc19_p
fba
_ggpps_t
pex10
为模板，用引物fba-f(seq no.31)和pex10-r(seq no.32)扩增并纯化ggpps基因表达盒；以puc19_p
tef
_carb_t
mig
为模板，用引物tef-f(seq no.33)和mig-r(seq no.34)扩增并纯化carb基因表达盒；将上述线性化质粒、潮霉素、ggpps和carb基因表达盒片段通过无缝克隆连接并转化到大肠杆菌克隆宿主jm109中，吸取600μl活化后菌液涂布到含有氨苄青霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养，经菌落pcr和测序验证获得正确的转化子和包含潮霉素抗性、ggpps和carb基因表达盒的重组质粒puc19_p
hp4d
_hygr_t
xpr2
_p
fba
_ggpps_t
pex10
_p
tef
_carb_t
mig
。
37.(7)含有潮霉素抗性、carb、carrp和ggpps基因表达盒的rdna重组质粒puc19_rdna_p
hp4d
_hygr_t
xpr2
_p
fba
_ggpps_t
pex10
_p
tef
_carb_t
mig
_p
ut8
_carrp_t
cyc
的构建：对puc19_rdna_p
ut8
_carrp_t
cyc1
质粒进行spei和ncoi双酶切获得线性化的质粒片段；以puc19_p
hp4d
_hygr_t
xpr2
_p
fba
_ggpps_t
pex10
_p
tef
_carb_t
mig
为模板，用引物rdna-f(seq no.35)和rdna-r(seq no.36)扩增并纯化包含潮霉素抗性、ggpps和carb基因表达盒的片段；最后将上述线性化质粒和片段通过无缝克隆连接并转化到大肠杆菌克隆宿主jm109中，吸取600μl活化后菌液涂布到含有氨苄青霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养，经菌落pcr和测序验证获得正确的转化子和含有潮霉素抗性、carb、carrp和ggpps基因表达盒的rdna重组质粒puc19_rdna_p
hp4d
_hygr_t
xpr2
_p
fba
_ggpps_t
pex10
_p
tef
_carb_t
mig
_p
ut8
_carrp_t
cyc
，其结构示意图如图2所示。
38.对上述rdna整合质粒进行afei和xmaji双酶切获得含有rdna同源臂、潮霉素抗性、carb、carrp和ggpps基因表达盒的片段，利用醋酸锂转化法将该片段转化到解脂耶氏酵母sbt中，活化后菌液涂布到含有500mg/l潮霉素的ypd平板上，30℃培养2-3天，挑取单菌落进行菌落pcr验证获得多株成功转化的基因工程解脂耶氏酵母菌株。
39.2.高拷贝基因工程解脂耶氏酵母sbt04-015菌株的筛选
40.将正确的酵母转化子分别影印涂布到含有1、2、3、4、5、6、7、8和9g/l潮霉素的ypd平板上，30℃培养3-7天，观察不同浓度下转化子的生长情况，挑选能在高浓度潮霉素抗性下生长性能好的转化子，获得一株能在9g/l潮霉素上长势较好的高拷贝基因工程解脂耶氏酵母菌株sbt04-015。
41.实施例3：提升β-胡萝卜素生产能力的基因工程解脂耶氏酵母sbt04-016菌株的构建
42.本发明对解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica sbt04-015菌株中的yl_pp基因
(seqno.37)进行了定点敲除，具体操作如下：
43.(1)含有诺尔丝菌素筛选标记表达盒的重组质粒pina1312_nat的构建：根据解脂耶氏酵母密码子的偏好性对诺尔丝菌素抗性基因进行密码子优化(seq no.38)，委托上海擎科生物技术有限公司进行基因合成，利用引物nat_f1(seq no.39)和nat_r1(seqno.40)扩增优化后的诺尔丝菌素抗性基因片段；另外，对pina1312质粒进行bamhi和kpni双酶切获得线性化质粒；将上述线性化质粒和诺尔斯菌素抗性基因片段进行无缝克隆连接，转化到克隆宿主大肠杆菌jm109中，吸取100-300μl活化后菌液涂布到含有卡那霉素抗性的lb平板上，通过菌落pcr和测序验证获得正确转化子和重组质粒pina1312_nat，以该重组质粒为模板，用引物nat_f2(seq no.41)和nat_r2(seq no.42)扩增得到含有启动子hp4d和终止子xpr2的诺尔斯菌素抗性基因表达盒。
44.(2)敲除质粒puc19_up_p
hp4d
_nat_txpr2_down的构建：以解脂耶氏酵母sbt04-15菌株的基因组为模板，利用引物up_f(seq no.43)和引物up_r(seq no.44)，引物down_f(seq no.45)和引物down_r(seq no.46)扩增yl_pp基因的上下游序列，获得用于敲除yl_pp基因的同源臂；另外以puc19为模板，用引物puc19-f(seq no.14)和puc19-r(seq no.15)扩增并纯化线性化载体片段；最后将上下游同源臂、诺尔斯菌株抗性基因表达盒和线性化载体片段进行无缝克隆连接，转化到克隆宿主大肠杆菌jm109中，吸取600μl活化后菌液涂布到含有氨苄青霉素抗性的lb平板上，经菌落pcr和测序验证后获得正确的转化子和敲除质粒puc19_up_p
hp4d
_nat_txpr2_
down
。
45.(3)敲除菌株的转化和验证：以敲除质粒为模板，利用引物up_f(seq no.43)和引物down_r(seq no.46)扩增用于敲除yl_pp的线性化片段；然后用醋酸锂转化法，转化0.5-1.5ng的线性化片段到解脂耶氏酵母sbt04-015中，活化后的菌液全部涂布到含有200mg/l的ypd平板上，30℃培养直至长出转化子，经菌落和基因组pcr验证正确后得到解脂耶氏酵母基因工程菌株sbt04-016。
46.实施例4：在摇瓶中发酵生产、提取及检测β-胡萝卜素的方法
47.将解脂耶氏酵母sbt04-015和sbt04-016单菌落接种到含有2ml新鲜ypd培养基的10ml离心管中，30℃、220转/分钟培养24小时。用分光光度计测定种子液od
600
，然后吸取一定量的种子液按初始od
600
为0.1转接到含50ml新鲜ypd培养基的250ml离心管中，30℃、220转/分钟培养至72小时，吸取1-2ml菌液离心收集菌体，使用超纯水洗涤菌体沉淀3次，向上述菌体沉淀中加入500μl dmso重悬菌体，用枪头吹打混匀，置于55℃恒温振荡器中振荡30min，继续向上述溶液中加入500μl丙酮，用枪头吹打混匀，置于55℃恒温振荡器中振荡30min，将上述溶液在12000转/分钟下离心5min，将上清吸取到新的1.5ml ep管中，重复以上的步骤多次提取，直至菌体从红色变成白色，将提取液合并，使用0.22μm有机相滤头将该提取液进行过滤除杂质，用于β-胡萝卜素的定量分析。
48.本发明中β-胡萝卜素的测定采用高效液相色谱仪进行。高效液相色谱系统采用的是agilent 1260高效液相色谱系统，该系统配备了自动进样器、二极管阵列检测器、四元泵；色谱柱采用ymc-类胡萝卜素柱(250mm
×
4.6mm,5μm)；洗脱方式采用梯度洗脱，梯度洗脱条件如表所示，流速为1ml/min，检测波长为472nm，柱温为20℃，进样量为10μl。结果如图3所示，经测定解脂耶氏酵母sbt04-015可生产约300mg/l的β-胡萝卜素，解脂耶氏酵母sbt04-016可生产约450mg/l的β-胡萝卜素。
49.表1梯度洗脱条件
[0050][0051]
实施例5：解脂耶氏酵母sbt04-016传代发酵稳定性实验
[0052]
将解脂耶氏酵母sbt04-016在ypd平板上传代共10代，取每一代的单克隆进行发酵培养72小时，对每代菌株的产量进行检测，结果如图4所示，可以看出β-胡萝卜素的产量在传代10代过程中均保持在450mg/l左右，具有较强的遗传稳定性。

技术特征：
1. 解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016，保藏编号为cctcc no：m 20231183。2.权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016的培养方法，其特征在于，具体步骤如下：将解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016接种至发酵培养基中，所述的发酵培养基的碳源为甘油或葡萄糖。3. 根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组成为：葡萄糖20g/l、酵母提取物20 g/l、胰蛋白胨10 g/l、ph 5-6，或为：甘油100 g/l、酵母提取物20 g/l、胰蛋白胨10 g/l、ph 5-6。4.权利要求1所述的解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016在发酵生产β-胡萝卜素中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，具体应用方法为：将解脂耶氏酵母基因工程菌sbt04-016接种至发酵培养基中，发酵结束后，离心获取菌体，破碎细胞后利用丙酮萃取β-胡萝卜素。6. 提高解脂耶氏酵母类胡萝卜素产量的方法，其特征在于，定点敲除产类胡萝卜素的解脂耶氏酵母中的yl_pp基因，所述的yl_pp基因的核苷酸序列如seq no.37所示。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，类胡萝卜素为β-胡萝卜素、番茄红素、玉米黄质、叶黄素、虾青素、西红花苷、角黄素或海胆酮。

技术总结
本发明公开了一种解脂耶氏酵母基因工程菌及其在β-胡萝卜素生产中的应用。本发明从自然界高含油脂的环境中分离筛选获得产胞内油脂的野生型解脂耶氏酵母菌株，再以此为出发菌株，经紫外诱变，获得一株胞内油脂合成能力显著增强的突变株，然后将卷枝毛霉来源的carB、carRP和解脂耶氏酵母内源的GGPPS表达盒以多拷贝形式定点整合到突变株SBT的rDNA位点，获得一株高拷贝且能生产β-胡萝卜素的基因工程菌SBT04-015，最后对基因工程菌SBT04-015中的磷酸酶yl_PP基因进行定点敲除，获得能够积累较高胞内油脂且高效生产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母基因工程菌SBT04-016。016。016。


技术研发人员：花强 刘枫 陈骏
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：2023.07.12
技术公布日：2023/8/31