一种一氧化氮可注射水凝胶及其制备方法与应用

1.本发明涉及医用制品技术领域，具体涉及一种一氧化氮可注射水凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.在日常生活中，我们周围存在着大量的不同种类的病菌，极易被感染。目前抗细菌感染的主要方式是通过抗生素治疗，但是抗生素的过多使用很容易导致细菌耐药性的产生，因而开发出新的抗菌材料变得尤为重要。近年来研究发现，一氧化氮(no)可破坏细菌的细胞膜以及基因信息并阻止细菌获得能量，具有高效抑菌且不易产生耐药性等特性，在抗菌领域的应用受到广泛关注，基于no的医用制品领域也快速发展起来。
3.水凝胶是一种三维交联网络结构，具有优异的生物相容性和溶胀性能，已广泛应用于生物工程和生物医学等各个领域。与普通水凝胶相比，可注射水凝胶因其保湿性、可塑性而引起了越来越多的关注。目前，可注射水凝胶已用于组织工程，药物释放，伤口愈合和隐形眼镜各个领域的生物医学材料。可注射水凝胶在控制药物释放方面的主要优点是它们能够适应局部微环境，可以通过注射凝胶化并整合到局部组织中以达到目标部位。通过可注射水凝胶实现no的持续释放，以便在靶部位进行可能的肿瘤协同治疗，不会对其他组织造成损害。但目前已公开的可用于一氧化氮释放的可注射水凝胶存在着no负载能力低、释放速率低及释放时间短等问题。因此，开发一种no负载能力强、释放速率高、释放持续时间长，抗菌性能强，并能够实现no缓慢可控释放的可注射水凝胶具有重要的意义及应用前景。


技术实现要素：

4.为解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种一氧化氮可注射水凝胶，能够实现一氧化氮的高负载量，并可自动缓慢释放一氧化氮。
5.本发明的第二个目的在于提供上述可注射水凝胶的制备方法。
6.本发明的第三个目的在于提供上述可注射水凝胶的应用，本发明所提供的一氧化氮可注射水凝胶在生物医学工程应用广泛，有良好的研究和开发利用前景，并且可应用于医疗植入。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.一种一氧化氮可注射水凝胶，所述一氧化氮可注射水凝胶的组成包括海藻酸钠体系、d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠；所述海藻酸钠体系、d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠的质量体积比为10ml:0.36g:0.142g；所述一氧化氮可注射水凝胶具有一氧化氮负载能力强、一氧化氮释放速率高、一氧化氮释放持续时间长及可降解等优点，在医用制品技术方面显示出重要的应用价值。
9.进一步地，所述海藻酸钠体系由海藻酸钠、去离子水、一氧化氮供体及碳酸钙组成。
10.进一步地，所述海藻酸钠、去离子水、一氧化氮供体及碳酸钙的质量体积比为
0.4g:10ml:0.01-0.03g:0.36g。
11.进一步地，所述一氧化氮供体为snap或gsno。
12.一种一氧化氮可注射水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
13.(1)将海藻酸钠溶解在去离子水中制备海藻酸钠溶液，磁力搅拌30分钟直至海藻酸钠完全溶解后，在磁力搅拌下，将一氧化氮供体分散到海藻酸钠溶液中形成悬浮液；
14.(2)在磁力搅拌下，将碳酸钙分散到步骤(1)生成的悬浮液中，生成海藻酸钠体系；
15.(3)先后在步骤(2)生成的海藻酸钠体系中加入d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、磷酸二氢钠，反应10分钟，得到所述一氧化氮可注射水凝胶；所述海藻酸钠体系、d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠的质量体积比为10ml:0.36g:0.142g；
16.所述制备方法利用d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯，通过海藻酸钠与钙离子交联诱导可注射水凝胶的原位合成，然后将一氧化氮供体成功掺入水凝胶中，得到具有一氧化氮可控释放能力的可注射水凝胶。利用本发明提供的方法所制备的一氧化氮可注射水凝胶一氧化氮负载能力强、抗菌性能强，能够实现一氧化氮缓慢可控的释放。
17.进一步地，上述步骤(2)中，所述海藻酸钠体系中海藻酸钠、去离子水、一氧化氮供体及碳酸钙的质量体积比为0.4g:10ml:0.01-0.03g:0.36g。
18.进一步地，所述一氧化氮供体为snap或gsno。
19.上述一氧化氮可注射水凝胶的应用，所述应用为用于一氧化氮释放型3d打印人工骨复合支架的制备。
20.进一步地，所述一氧化氮释放型3d打印人工骨复合支架的制备采用以下步骤：
21.(1)利用3d生物打印机打印聚乳酸、碳酸钙、羟基磷灰石混合三维生物打印材料，进行优化，直接精准打印出具有不同孔隙含量的3d打印多孔目的立方体材料支架，同时进行水热反应固化支架；
22.(2)将所述可注射水凝胶嵌入步骤(1)制备的不同孔隙的3d打印人工骨复合支架，成功获得不同一氧化氮浓度的一氧化氮释放型3d打印人工骨复合支架。
23.进一步地，步骤(1)中，所述3d打印多孔目的立方体材料支架的孔隙含量为300-1000um。
24.有益效果：
25.本发明提供的一氧化氮可注射水凝胶加入了d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯和海藻酸钠，能够实现一氧化氮的高负载量，并可自动缓慢释放一氧化氮，解决了现有载体材料一氧化氮负载量低、突释现象严重等问题，可实现一氧化氮在人体内的长效缓释。本发明提供的一氧化氮可注射水凝胶的制备方法条件温和，具有工艺生产流程简单、操作方便及不使用有毒有害溶剂等优点。本发明所提供的一氧化氮可注射水凝胶在生物医学工程应用广泛，有良好的研究和开发利用前景，并且可应用于医疗植入。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1是纯snap、alg-gdl、实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的ftir光谱对比图。
28.图2中，a是不含snap的alg-gdl的sem图，b是实施例1制备的alg-gdl-10的sem图，c是实施例2制备的alg-gdl-20的sem图，d是实施例3制备的alg-gdl-30的sem图，e是实施例3制备的alg-gdl-30的硫元素分布图，f是实施例3制备的alg-gdl-30的氮元素分布图。
29.图3中，a是实施例1制备的alg-gdl-10的no释放数据统计图，b是实施例2制备的alg-gdl-20的no释放数据统计图，c是实施例3制备的alg-gdl-30的no释放数据统计图。
30.图4中，a是不含snap的alg-gdl、实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30对革兰氏阳性菌的抗菌结果图，b是不含snap的alg-gdl、实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30对革兰氏阴性菌的抗菌结果图。
31.图5是不含snap的alg-gdl、实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的溶胀性能对比图。
32.图6是不含snap的alg-gdl、实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的降解性能对比图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1
35.一种一氧化氮可注射水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
36.(1)将0.4g sa溶解在10ml去离子水中制备sa溶液，磁力搅拌30分钟直至sa完全溶解后，在磁力搅拌下，将10.0mg snap分散到10ml sa溶液中形成悬浮液；
37.(2)在磁力搅拌下，将0.36g caco3分散到10ml步骤(1)生成的悬浮液中，生成新的悬浮液；
38.(3)先后在步骤(2)生成的悬浮液中加入0.36g d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、0.142g nah2po4，反应10分钟，得到可注射的海藻酸盐水凝胶alg-gdl-10。
39.实施例2
40.一种一氧化氮可注射水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
41.(1)将0.4g sa溶解在10ml去离子水中制备sa溶液，磁力搅拌30分钟直至sa完全溶解后，在磁力搅拌下，将20.0mg snap分散到10ml sa溶液中形成悬浮液；
42.(2)在磁力搅拌下，将0.36g caco3分散到10ml步骤(1)生成的悬浮液中，生成新的悬浮液；
43.(3)先后在步骤(2)生成的悬浮液中加入0.36g d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、0.142g nah2po4，反应10分钟，得到可注射的海藻酸盐水凝胶alg-gdl-20。
44.实施例3
45.一种一氧化氮可注射水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
46.(1)将0.4g sa溶解在10ml去离子水中制备sa溶液，磁力搅拌30分钟直至sa完全溶
解后，在磁力搅拌下，将30.0mg snap分散到10ml sa溶液中形成悬浮液；
47.(2)在磁力搅拌下，将0.36g caco3分散到10ml步骤(1)生成的悬浮液中，生成新的悬浮液；
48.(3)先后在步骤(2)生成的悬浮液中加入0.36g d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、0.142g nah2po4，反应10分钟，得到可注射的海藻酸盐水凝胶alg-gdl-30。
49.实施例4
50.对纯snap、不含snap的d-(+)-葡萄糖酸δ-内酯可注射海藻酸盐水凝胶alg-gdl以及上述实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30进行ftir光谱测试，通过ft-ir光谱对四组水凝胶中的有机官能团进行了表征，结果如图1所示，alg-gdl在3425cm-1
和1612cm-1
处表现出特征峰，可分别分配给-oh和-coo-的拉伸振动峰。1032cm-1
处的特征峰为c-o-c的拉伸振动峰。1415cm-1
处的特征峰可归结于海藻酸钠与钙离子的羧基形成的离子键。纯snap的红外光谱在1327cm-1
和1248cm-1
处出现两个特征峰，可归因于酰胺带的特征峰。
51.实施例5
52.通过扫描电子显微镜观察水凝胶的相应形貌。图2a显示，alg-gdl表面非常粗糙，有许多突起，这可能是由于水凝胶的离子交联产生的结构。图2b-d显示，alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30也表现出具有许多突起的粗糙表面，说明alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30均和alg-gdl之间在形态上不存在显著差异。如图2b-d所示，alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30局部表现出非常紧密的形态，这可能是由于在合成水凝胶时使用了小分子量的海藻酸钠，在初始交联阶段存在过量的钙离子会迅速导致紧密的交联现象。结果表明，snap的存在不会影响水凝胶的形态，这可能是由于snap是通过加载方式掺入到水凝胶中。
53.实施例6
54.检测实施例3制备的alg-gdl-30样品的冻干水凝胶的硫元素和氮元素的分布情况，结果如图2e-f所示，与alg-gdl相比，在alg-gdl-30中检测到了硫元素和氮元素，并且这两种元素在水凝胶中的分布是均匀的。结果表明，snap能够成功加载到水凝胶中并均匀分布。
55.实施例7
56.检测上述实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30释放一氧化氮的能力，结果如图3所示。由图3a可知，alg-gdl-10的总一氧化氮释放时间达到34小时，较高的释放速率出现在开始时的前2h，这可能是由于注射的水凝胶被pbs浸泡溶解后表面snap快速分解所致，并且在前20小时内，浓度保持在0.01ppb/mg以上以缓慢释放，此后，一氧化氮浓度以低于0.001ppb/mg的浓度缓慢释放14小时。由图3b可知，alg-gdl-20的总释放时间达到47小时，一氧化氮浓度在前12小时内保持在0.02ppb/mg以上的缓慢释放，释放速率在12小时后缓慢降低，与alg-gdl-10相比，alg-gdl-20一氧化氮释放的浓度显著升高。由图3c可知，alg-gdl-30的总一氧化氮释放时间为36h，呈缓慢下降趋势，在最初的20h，一氧化氮释放浓度高于0.02ppb/mg，且浓度下降较慢，在21h出现更明显的高点，这可能是由于补充pbs溶液引起的snap短暂而快速的分解。与alg-gdl-10和alg-gdl-20相比，alg-gdl-30一氧化氮释放曲线的总体趋势与前两者相似。通过对曲线进行积分发现，随着snap浓度的增强，
一氧化氮释放总量和浓度增加。由以上结果可知，三种水凝胶alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的一氧化氮释放时间均大于24小时，并且释放的一氧化氮的量和瞬时释放速率与snap浓度呈正相关。
57.实施例8
58.检测alg-gdl、上述实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性。将alg-gdl、alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30干燥样品的抗菌活性测试24小时，使用十倍稀释法进行稀释和涂布，并通过计数菌落数来评估抗菌性能。图4a所示为alg-gdl、alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30对革兰氏阳性菌的抗菌结果，与alg-gdl相比，alg-gdl-10的细菌数量减少了1.1个数量级，alg-gdl-20和alg-gdl-30的细菌数量分别减少了1.2个和1.3个数量级，alg-gdl-30获得了最佳抗菌率为95％。图4b所示为alg-gdl、alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30对革兰氏阴性菌的抗菌结果，与alg-gdl相比，alg-gdl-10中的细菌数量减少了1.0个数量级，alg-gdl-20和alg-gdl-30中的细菌数量分别减少了1.2和1.3个数量级，alg-gdl-30的抗菌活性最高，抗菌率达到了95％。由结果可知，alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30对两种细菌均具有良好的抗菌活性，并且由alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的抗菌能力可知，本发明所提供的一氧化氮可注射水凝胶的抗菌能力会随着snap浓度的增加而逐渐增强。
59.实施例9
60.采用重量法检测alg-gdl、上述实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的溶胀性能。结果如图5所示，alg-gdl、alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30在三天内逐渐达到膨胀平衡。alg-gdl溶胀率为41.3％，alg-gdl的质量在前12小时内迅速增加，并在接下来的两天内保持相对稳定的增长速率，第三天后，alg-gdl质量缓慢增加并趋于达到平衡。alg-gdl-10溶胀率为36.5％，与alg-gdl相比，前6h和第二天的质量增加速率较小，但溶胀曲线的趋势相似。alg-gdl-20的溶胀率达到34.9％，并在第一天观察到最高的质量增长速率，与alg-gdl相比，一天后的增长速率较小。alg-gdl-30的溶胀率为34.0％，与alg-gdl、alg-gdl-10及alg-gdl-20相比，alg-gdl-30始终具有最低的质量增长速率，并且在达到平衡后获得最低的溶胀速率。由结果可知，本发明所提供的一氧化氮可注射水凝胶的溶胀速率会随着snap浓度的增加而略有降低，其中alg-gdl的溶胀率最高，为41.3％，这可能是由于snap的疏水性以及海藻酸钠的吸水性导致负载snap的水凝胶的溶胀性能降低，并且由于alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30中snap的浓度非常低，水凝胶的溶胀性能主要由水凝胶基质决定，因此负载snap对水凝胶溶胀率的影响并不显著。
61.实施例10
62.通过统计alg-gdl、上述实施例1-3制备的alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30在生理条件下两周内的质量变化评估降解性能。结果如图6所示，两周后alg-gdl的剩余质量为108.5％，并从第四天开始以平缓的速度降解。alg-gdl-10的剩余质量为91.1％，总体降解趋势相似，与水凝胶alg-gdl相比，降解速度更快。水凝胶alg-gdl-20和alg-gdl-30的剩余质量分别为63.4％和52.2％，与水凝胶alg-gdl相比，从第4天开始降解速率较快，降解速率呈现先快后慢的趋势。从第四天到第五天，alg-gdl-30水凝胶的质量急剧下降。从第五天到第十天，alg-gdl-20水凝胶的质量急剧下降。我们推测，snap降解释放的一氧化氮可能导致水凝胶内出现孔隙，进而导致pbs进入水凝胶并加速降解。此外，随着降解过程的发生，
结合力变弱。水凝胶的重量在第四天保持大于100％，这是因为受到溶胀行为的影响。通过对比alg-gdl、alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30的降解性能，本发明认为snap的存在会加速水凝胶的降解。
63.实施例11
64.将实施例1-3所制备的一氧化氮可注射水凝胶alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30用于制备一氧化氮释放型3d打印人工骨复合支架，具体步骤如下：
65.(1)利用3d生物打印机打印聚乳酸、碳酸钙、羟基磷灰石混合三维生物打印材料进行优化，直接精准打印出不同孔隙含量的3d打印多孔目的立方体材料支架(孔隙为300-1000um)，同时进行水热反应固化支架；
66.(2)将实施例1-3制备的一氧化氮可注射水凝胶alg-gdl-10、alg-gdl-20及alg-gdl-30分别嵌入不同孔隙的3d打印人工骨复合支架，成功获得不同一氧化氮浓度的一氧化氮释放型3d打印人工骨复合支架。

技术特征：
1.一种一氧化氮可注射水凝胶，其特征在于，所述一氧化氮可注射水凝胶的组成包括海藻酸钠体系、d-（+）-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠；所述海藻酸钠体系、d-（+）-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠的体积质量比为10ml：0.36g：0.142g。2.根据权利要求1所述的水凝胶，其特征在于，所述海藻酸钠体系由海藻酸钠、去离子水、一氧化氮供体及碳酸钙组成。3.根据权利要求2所述的水凝胶，其特征在于，所述海藻酸钠、去离子水、一氧化氮供体及碳酸钙的质量体积比为0.4g：10ml：（0.01-0.03）g：0.36g。4.根据权利要求3所述的水凝胶，其特征在于，所述一氧化氮供体为snap或gsno。5.一种权利要求1-4任一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法采用以下步骤：将海藻酸钠溶解在去离子水中制备海藻酸钠溶液，磁力搅拌至海藻酸钠完全溶解，在磁力搅拌下，将一氧化氮供体分散到海藻酸钠溶液中形成悬浮液；在磁力搅拌下，将碳酸钙分散到步骤（1）生成的悬浮液中，生成海藻酸钠体系；在步骤（2）生成的海藻酸钠体系中先后加入d-（+）-葡萄糖酸δ-内酯、磷酸二氢钠，反应后得到所述一氧化氮可注射水凝胶。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述的反应时间为8-12分钟。7.一种权利要求1-4任一项所述的可注射水凝胶和/或权利要求5-6任一项所述的方法制备的可注射水凝胶的应用，其特征在于，所述应用为将水凝胶用于制备一氧化氮释放型人工骨支架。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述一氧化氮释放型人工骨支架为3d打印。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述一氧化氮释放型人工骨支架的制备方法为：（1）将聚乳酸、碳酸钙、羟基磷灰石混合，3d打印多孔目立方体材料支架，同时进行水热反应固化支架；（2）将所述可注射水凝胶嵌入步骤（1）制备的多孔目立方体材料支架中，获得一氧化氮释放型3d打印人工骨支架。

技术总结
本发明涉及医用制品技术领域，具体涉及一种一氧化氮可注射水凝胶及其制备方法与应用。所述水凝胶的组成包括海藻酸钠体系、D-（+）-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠，所述海藻酸钠体系、D-（+）-葡萄糖酸δ-内酯及磷酸二氢钠的质量体积比为10mL:0.36g:0.142g；所述海藻酸钠体系由海藻酸钠、去离子水、一氧化氮供体及碳酸钙组成。所述制备方法为将D-（+）-葡萄糖酸δ-内酯、海藻酸钠和碳酸钙进行交联，掺入一氧化氮供体制得。所述应用为用于一氧化氮释放型3D打印人工骨复合支架的制备。本发明公开的水凝胶具有一氧化氮供体分布均匀、一氧化氮负载能力强等优点，制备方法条件温和，成本低，在医用制品技术方面具有重要应用价值。用制品技术方面具有重要应用价值。用制品技术方面具有重要应用价值。


技术研发人员：周阳 刘元元 郑光斌
受保护的技术使用者：海南大学
技术研发日：2023.07.18
技术公布日：2023/8/31