一种皮肤微生态复合生物制剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及皮肤科学技术领域，具体涉及一种皮肤微生态复合生物制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，对人体的主要作用是保护、感觉、调节温度、分泌、排泄和吸收等，因此皮肤的健康是绝对不容忽视的。皮肤是人体第一道防线，由于它们并非无所不能，平日也是最易遭受攻击，最易自然磨损的，因此它同其他身体任何一个器官一样都需要被精心地养护。
3.目前市场上皮肤养护仍旧大量使用传统护肤产品，这些产品需要经过原料配备、原料称取、搅拌乳化装置、出料后开放式灌装、包装产品等一系列流程。在此过程中，产品在一定程度上会受到细菌污染。为了保证产品的稳定性还会添加大量的稳定剂、防腐剂，极大的增加了皮肤致敏风险；同时会影响皮肤微生态使金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌等有害菌大量繁殖从而导致面部水油失衡、痤疮反复生长、肤色发黄暗淡等皮肤问题出现。随着人们对自身健康和美的追求，市场需要安全、高效、天然的皮肤养护和抗菌方法。因此，开发新型安全无毒的皮肤养护技术是大势所趋。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术中存在的皮肤养护产品效果较差的问题，提供一种皮肤微生态复合生物制剂及其制备方法和应用。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种皮肤微生态复合生物制剂，包括红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌；以活菌数计，所述红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的复配比例为1:1:2:1:2:3。
6.本发明同时提供了上述皮肤微生态复合生物制剂的制备方法，包括以下步骤：
7.s1、分离筛选6株菌种：红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌；
8.s2、菌株的活化：将s1中筛选的菌种分别接种于固体lb斜面培养基上，并于30℃-37℃恒温培养箱中培养24h-30h；
9.s3、制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液培养基中，在30℃-37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液；
10.s4、扩大培养：以1％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液；
11.s5、发酵罐培养：以1％(v/v)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，通气培养24-34h；
12.s6、收集发酵产物并复配：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，分别收集6株菌种的
发酵液并复配，制得皮肤微生态复合生物制剂，所述皮肤微生态复合生物制剂为菌粉制剂或液体菌剂。
13.优选地，所述s6中，菌粉制剂的制备方法为：将6株菌种的发酵液离心，取菌泥，低温悬浮烘干或冷冻干燥，分别得到红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的菌粉；并按照1:1:2:1:2:3复配，以活菌数来计，即得到菌粉制剂。
14.优选地，所述s6中，液体菌剂的制备方法为：将红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的发酵液分别用无菌水配制成浓度为1
×
109cfu/ml后，按照1:1:2:1:2:3复配，以活菌数来计，再加入辅料，混合即得到液体菌剂。
15.优选地，所述辅料为聚葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖、乳果糖；用量分别为液体菌剂总量的0.36％，0.24％，0.48％，0.36％。
16.优选地，所述液体菌剂的活菌数≥10亿cfu/ml。
17.本发明还提供了上述皮肤微生态复合生物制剂在制备皮肤抗菌抗氧化产品中的应用。
18.本发明所具有的有益效果：本发明将红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌联合使用，可有效抑制皮肤病原菌的生长，具有广谱抑菌性且效果稳定、安全高效等优点；另外，能够影响并调节皮肤的代谢过程，提高皮肤的抗氧化能力，从而改善皮肤皱纹；并减少化学抑菌剂的使用，从整体上改善皮肤生理状况，在皮肤养护方面具有良好的应用价值。
附图说明
19.图1为红曲霉菌的菌落形态图；
20.图2为纳豆芽孢杆菌的菌落形态图；
21.图3为纳豆芽孢杆菌的生理生化试验结果；
22.图4为双歧杆菌的菌落形态图；
23.图5为双歧杆菌涂片镜检图；
24.图6为双歧杆菌的生理生化鉴定结果；
25.图7为扣囊复膜酵母菌的系统发育树；
26.图8为扣囊复膜酵母菌的菌落形态图；
27.图9为罗伊氏乳杆菌的系统发育树；
28.图10为罗伊氏乳杆菌的菌落形态图；
29.图11为罗伊氏乳杆菌的镜检图；
30.图12为罗伊氏乳杆菌的生理生化鉴定结果；
31.图13为酵母菌的菌落形态图；
32.图14为酵母菌26srdna基因扩增产物的电泳图；
33.图15为实施例4中3位志愿者皮肤皱纹灰度的分布图；
34.图16为实施例4中3位志愿者使用复合制剂前后，左侧外眼角处皱纹参数；
35.图17为实施例5中抑菌率实验结果。
具体实施方式
36.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
37.实施例1
38.红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的分离、鉴定。
39.1.红曲霉菌：以红曲米、红腐乳为材料，通过分离、纯化、筛选红曲霉菌株，其形态特征为在pda培养基上生长，菌落开始白色，后变成绛红色，菌落丛小而密；分生孢子球形，子囊孢子卵圆形。在pda琼脂培养基上生长的菌落呈小型丝状，淡粉色，生长旺盛，培养基背面紫红色(附图1所示)。显微镜镜检观察菌丝，菌丝有横隔，多核，分支甚繁，分生孢子排列呈链状，分生孢子顶端。同时结合its基因序列鉴定为红色红曲霉。
40.2.纳豆芽孢杆菌：以纳豆或大豆为材料，通过分离、纯化、筛选出菌株，对筛选得到的菌株进行糖发酵、过氧化氢酶生理生化试验进行鉴定。
41.菌落形态：对筛选得到的菌株进行生理生化试验，株菌在肉汤平板培养基上，菌落为灰白色，近圆形，表面干燥，不透明，有褶皱，无光泽，边缘不光滑成裂叶状，中央颜色深于边缘部分；在斜面上菌落成树状生长(如图2所示)。
42.生理生化特征：对筛选出的菌株进行了部分生理生化特征试验、糖发酵试验，试验结果如图3所示。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)对枯草芽孢杆菌的描述，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，与参比菌株的生化特征基本一致。
43.3.双歧杆菌：
44.双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(图4所示)。
45.涂片镜检：挑取双歧杆菌平板或mrs平板上生长的双歧杆菌单个菌落进行染色。双歧杆菌为革兰氏染色阳性，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分叉等多形态，不抗酸，无芽孢，无动力(图5所示)。
46.生理生化鉴定：结果如图6所示，过氧化氢酶试验为阴性。
47.4.扣囊复膜酵母菌:采用平板分离筛选酱香堆积酒醅中的扣囊复膜酵母菌yw12(jx316752)，并通过18srdna同源性分析，构建系统发育树(图7所示)。
48.形态特征：细胞圆形、椭圆形或柱形。无性繁殖为多边出芽。某些种可形成假菌丝，但决无真菌丝。菌落乳白色、有光泽、较平坦、边缘整齐(图8所示)。
49.5.罗伊氏乳杆菌：
50.形态特征：分离筛选出的菌株a4在mrs平板上的菌落形态为乳白色、圆形，边缘整齐，表面无褶皱，湿润有光泽，容易挑起(图10所示)。经革兰氏染色呈阳性，接触酶反应阴性，杆菌，成对或成链状排列，不产芽孢(图11所示)。
51.生理生化鉴定：结果如图12所示，结合形态特征和分子鉴定结果，确定菌株a4为罗伊氏乳杆菌。
52.分子鉴定结果：对菌株a4的16srdna序列碱基序列在genbank数据库中和已经发表的16srdna基因序列进行同源性比对，比对后选出同源性最高的序列用mega软件构建系统发育树，从而分析菌株之间的同源性。同源性分析结果表明，菌株a4与mn03804821(lactobacillus reuteridsm20016")的同源性大于97.5％，基于16srdna序列构建系统发
育树，在系统发育树上a4与罗伊氏乳杆菌在一条分支线上，结合生理生化鉴定判定为罗伊氏乳菌。基于16srdna基因序列构建系统发育树(如图9所示)
53.6.酵母菌：分离得到jz10菌株，其菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，乳白色(图13所示)；提取jz10菌株菌株dna为模板，以酵母菌26srdna基因通用引物扩增，获得500-600bp左右的目的条带(图14所示)，与预期大小相符；测序结果经blast比对jz10菌株与pichiakudriavzeviistrain cbs菌株的相似性达99％，为毕赤酵母菌。
54.实施例2皮肤微生态复合生物制剂(菌粉制剂)的制备
55.1.将实施例1中分离筛选出的6株菌种分别接种于固体lb斜面培养基上，并于30℃-37℃恒温培养箱中培养24h-30h；
56.2.制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液培养基中，在30℃-37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液；
57.3.扩大培养：以1％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液；
58.4.发酵罐培养：以1％(v/v)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，通气培养24-34h；
59.5.收集发酵产物并复配：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，分别收集6株菌种的发酵液，离心，取菌泥，低温悬浮烘干或冷冻干燥，分别得到红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的菌粉；并按照1:1:2:1:2:3复配，以活菌数来计，即得到菌粉制剂。
60.本实施例步骤2和3中的种子液培养基为：葡萄糖0.2％、蛋白胨1.0％、氯化钠0.5％、酵母膏0.5％、其余为水，ph7.0。
61.步骤4中，红曲霉菌的液体发酵培养基为:胨：5.0g，磷酸二氢钾：1.0g，氯霉素：0.1g，葡萄糖：10.0g，无水硫酸镁：0.5g，ph5.6
±
0.2(25℃)。
62.纳豆芽孢杆菌的液体发酵培养基为:葡萄糖2g/l、豆饼粉20g/l、氯化猛0.1g/l、磷酸氢二钾2g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸镁1g/l，发酵温度33℃,ph值8.0。
63.双歧杆菌的液体发酵培养基为：大豆蛋白胨5.0g，胰蛋白胨5.0g，酵母粉10.0g，葡萄糖10.0g，盐溶液40.0ml，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g(培养基煮沸后加入)，0.1％刃天青1.0ml，琼脂15.0g，蒸馏水1.0l，ph7.0。
64.扣囊复膜酵母菌的液体发酵培养基为:葡萄糖：10g/l，酵母提取物：5g/l，氨基酸混合物：2g/l，mgso4
·
7h2o：0.5g/l，k2hpo4：0.5g/l，kh2po4：0.5g/l，辅酶：0.01g/l。
65.罗伊氏乳杆菌的液体发酵培养基为:麦芽糖30g,大豆胨80g,麦芽浸粉65g,酵母5～15g,硫酸锰0.58g,硫酸镁0.28g,吐温80lg,半胱氨酸盐酸盐0.5g,磷酸氢二钾2g,柠酸氢二胺2g和乙酸钠10g。
66.酵母菌的液体发酵培养基为：酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，氯化钾1g/l，磷酸二氢钾1g/l，氯化镁0.5g/l，硫酸镁0.5g/l，氯化钠5g/l，水1000ml。
67.实施例3皮肤微生态复合生物制剂(液体菌剂)的制备
68.本实施例的制备方法与实施例2相同，区别在于：步骤5中，将红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的发酵液分别用无菌水配制成浓度为1
×
109cfu/ml后，按照1:1:2:1:2:3复配，以活菌数来计算。再加入0.36％聚葡萄糖、
0.24％低聚半乳糖、0.48％低聚果糖、0.36％乳果糖，混合即得到液体菌剂。本实施例中液体菌剂的活菌数≥10亿cfu/ml。
69.实施例4皮肤微生态复合生物制剂的抗氧化能力试验
70.1.对超氧阴离子自由基清除作用的测定
71.试验方法：模拟机体中黄瞟吟与黄瞟吟氧化酶反应系统，产生超氧阴离子自由基，加入电子传递物质及griess氏显色剂，使反应体系呈现紫红色，可用分光光度计测其吸光值，当被检测样本中含有超氧阴离子自由基抑制剂时，则比色时测定管的吸光度低于对照管的吸光度，而如果被测样本中含有产生超氧阴离子自由基物质时，则比色时测定管的吸光度高于对照管的吸光度，通过以维生素c做标准，可计算出被检物品对超氧阴离子自由基的影响能力。
72.实验步骤：按抗超氧阴离子自由基试剂盒说明，依次加入同一浓度单一菌株(单一红曲霉菌菌株、单一纳豆芽孢杆菌菌株、单一扣囊复膜酵母菌、单一罗伊氏乳杆菌、单一酵母菌、单一双歧杆菌菌株)、实施例2制备的复合菌粉制剂样品及试剂盒中所含试剂，用漩涡混合器充分混匀，置37℃恒温水浴40min后，加入显色剂混匀，10min后于550nm处测定其吸光度。
[0073][0074][0075]
实验结果如表1所示。
[0076]
表1同一浓度(5μg/ml)中复合制剂、单一菌株对超氧阴离子自由基的清除率
[0077][0078][0079]
2.对皮肤皱纹的改善
[0080]
1)本实施例选择了3位年龄在20岁～22岁的青年女性作为志愿者，编号为1、2、3(所有志愿者在10年期间均未接受过外科整形、美容激光、注射肉毒素等影响皱纹的治疗且均签署了知情同意书)，每天早晚清水洗脸后使用实施例3制备的液体菌剂喷洒3或4次至左侧外眼角，持续4周。
[0081]
2)实验开始前采集3位志愿者左侧外眼角处的皮肤样本；使用液体菌剂喷洒4周后，再采集同位置皮肤样本。
[0082]
每次图像拍摄前，每个志愿者用清水洁面，然后静坐半小时再进行面部图像拍摄，要求表情自然。以5cm
×
2cm固定大小的区域将眼角皱纹裁剪并保存，同一个志愿者选取的皱纹位置相同。将每位志愿者的图片按照固定大小裁剪，然后分三组导入到ssa软件中进行皱纹分析，得到每张图片的灰度值分布图以及皱纹参数，保存分析结果，并且记录各皱纹参数。
[0083]
图像拍摄利用仪器富士ds 505单反相机固定焦距镜头，配合恒定的光源。图像分析系统:眼角皱纹图像裁剪使用photoshop软件；眼角皱纹分析采用s s a软件分析，软件由瑞士d ataderm公司开发研制。软件提供定量的面部皮肤数据，包括皮肤颜色、斑点、平滑度和皱纹等参数。软件对皱纹进行分析后可以得到皱纹的总量、表面积、深度以及可判别程度值4个参数，其中可判别程度是指判断皱纹严重程度的难易指数。
[0084]
3)实验结果如附图15和16所示。图15为皮肤皱纹灰度的分布图，其中，每幅图中的上侧图为志愿者左侧外眼角皮肤照片，下侧图为该照片对应的皮肤皱纹灰度的分布图；从图上可以明显看出，3位志愿者的皮肤皱纹灰度的分布图明显变淡变少(注：灰度越深皱纹越深；有图区域越多皱纹越多)。图16为3位志愿者使用复合制剂前后，左侧外眼角处皱纹参数。图15和16的数据说明3位志愿者外眼角的皮肤皱纹都得到了较大的改善。
[0085]
实施例5皮肤微生态复合生物制剂的抗菌能力试验
[0086]
试验方法：
[0087]
通过测定本复合制剂和单一菌株对产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌等两种细菌的抑菌率来评估其抑菌效果。
[0088]
实验步骤：
[0089]
1)参照药典方法，分别取0.1ml产气荚膜梭菌cvcc2027、金黄色葡萄球菌cmcc26003细菌菌液，加入含10ml lb液体培养基的灭菌试管中，再将实施例3制备的复合制剂和单一菌株待测样品溶液按照1％的浓度分别加入前述试管中。同时设立空白对照(试管内只加lb液体培养基和细菌菌液)。
[0090]
2)37℃培养，4小时后测定各试管菌液在波长为600纳米时的吸光度(od)，测定前用lb培养基调零，记录测定数据、计算各产品在同一浓度下的抑菌率。
[0091]
3)抑菌率：(a
空
—a
样
)/a
空
×
100％
[0092]
4)注：a空：空白对照组24hod值；a样：样品组24hod值。
[0093]
抑菌率实验结果如附图17所示。
[0094]
综上所述，本发明制备的皮肤微生态复合生物制剂应用于皮肤的抗菌抗氧化，具有良好的协同增效效果。
[0095]
本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的，在本发明基础上，本领域技术人员根据所公开的技术内容，不需要创造性的劳动就可以对其中一些技术特征做出一些替换和变形，均在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种皮肤微生态复合生物制剂，其特征在于，包括红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌；以活菌数计，所述红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的复配比例为1:1:2:1:2:3。2.如权利要求1所述的一种皮肤微生态复合生物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、分离筛选6株菌种：红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌；s2、菌株的活化：将s1中筛选的菌种分别接种于固体lb斜面培养基上，并于30℃-37℃恒温培养箱中培养24h-30h；s3、制备种子液：将培养好的斜面取一环接种于50ml-100ml的种子液培养基中，在30℃-37℃条件下，180rpm震荡培养18-24h，制得一级种子液；s4、扩大培养：以1％(v/v)的接种量，将一级种子液接于500ml-1000ml种子液培养基中，在37℃条件下，震荡培养12-14h，制得二级种子液；s5、发酵罐培养：以1％(v/v)的接种量，将二级种子液接种于液体发酵培养基中，于30-37℃条件下，通气培养24-34h；s6、收集发酵产物并复配：发酵罐中芽孢率达到90％以上时，分别收集6株菌种的发酵液并复配，制得皮肤微生态复合生物制剂，所述皮肤微生态复合生物制剂为菌粉制剂或液体菌剂。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述s6中，菌粉制剂的制备方法为：将6株菌种的发酵液离心，取菌泥，低温悬浮烘干或冷冻干燥，分别得到红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的菌粉；并按照1:1:2:1:2:3复配，以活菌数来计，即得到菌粉制剂。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述s6中，液体菌剂的制备方法为：将红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的发酵液分别用无菌水配制成浓度为1
×
109cfu/ml后，按照1:1:2:1:2:3复配，以活菌数来计，再加入辅料，混合即得到液体菌剂。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述辅料为聚葡萄糖、低聚半乳糖、低聚果糖、乳果糖；用量分别为液体菌剂总量的0.36％，0.24％，0.48％，0.36％。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述液体菌剂的活菌数≥10亿cfu/ml。7.如权利要求1所述皮肤微生态复合生物制剂在制备皮肤抗菌抗氧化产品中的应用。

技术总结
本发明中公开了一种皮肤微生态复合生物制剂，包括红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌；所述红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌的复配比例以活菌数计为1:1:2:1:2:3。本发明同时公开了上述皮肤微生态复合生物制剂在制备皮肤抗菌抗氧化产品中的应用。本发明将红曲霉菌、纳豆芽孢杆菌、双歧杆菌、扣囊复膜酵母菌、罗伊氏乳杆菌和酵母菌联合使用，可有效抑制皮肤病原菌的生长，具有广谱抑菌性且效果稳定、安全高效等优点；另外，能够影响并调节皮肤的代谢过程，改善皮肤生理状况；并减少化学抑菌剂的使用，在皮肤养护方面具有良好的应用价值。肤养护方面具有良好的应用价值。肤养护方面具有良好的应用价值。


技术研发人员：谢明君 岑咏 杨王凯宇 颜艺 陈丽娟
受保护的技术使用者：乐山师范学院
技术研发日：2023.07.22
技术公布日：2023/8/31