一种发酵粘液乳杆菌VB216及其应用的制作方法

一种发酵粘液乳杆菌vb216及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其是涉及一株胃肠耐受性良好且具有多种致病菌抑制活性及精氨酸降解活性的新型发酵粘液乳杆菌vb216及其应用。


背景技术：

2.人们对于益生菌的认知有了显著的提高。人体内益生菌超过400种，其中只有约20种可在人体肠道和生殖系统内长期定植，乳酸菌和双歧杆菌是其中最主要的两大类。益生菌在进入肠道后，会与肠道中原有菌群发生栖生、共生、偏生、竞争和吞噬等复杂关系，最终起到促进机体健康的作用。如果由于各种因素的影响，使得肠道内有益菌减少而致病菌大量繁殖，则肠道内原有菌群的动态平衡被打破，从而引发各种身体不适或疾病。对于这些人群，口服益生菌是最直接有效的可改善肠道菌群失衡的方法。
3.发酵粘液乳杆菌隶属于乳酸菌属，为革兰氏阳性兼性厌氧菌，是宿主口腔、肠道、乳汁和阴道的正常菌群。据报道，发酵粘液乳杆菌不仅能提高肠道局部免疫功能，还具有促进机体对营养物质的吸收，调节胆固醇和乳糖代谢，降血压、抗氧化等重要的生理功能，已于2011年列入我国《可用于食品的菌种名单》。因此，发酵粘液乳杆菌也常被用作治疗炎症性肠病、抗生素相关性腹泻、过敏性皮炎、女性阴道炎等多种疾病的候选菌株。而在食品领域，它大多被用于各种发酵食品中，也包括多种白酒发酵，不仅可使食物具有独特的风味，同时也能具备菌株的部分益生功能。
4.精氨酸是一种条件必须氨基酸，可自身体内合成，也可通过饮食摄取。它是鸟氨酸循环的一个重要组成部分，在生命代谢过程中具有极其重要的生理功能、代谢和营养作用，如促进肌肉蛋白质合成、伤口复原、增强机体免疫力等。但过量摄入也会引发多种不良反应，比如呼吸急促、瘙痒、湿疹、腹部痉挛、过敏反应等，尤其是对于一些存在基础疾病的人（肝肾疾病、哮喘患者、糖尿病患者等），副作用会更加严重。
5.研究表明，多种恶性肿瘤存在精氨酸营养缺陷型，如恶性黑色素瘤、肝细胞癌、胰腺癌、乳腺癌等，这意味着肿瘤细胞的生存需要完全依赖外源性精氨酸来维持必需的生物过程。而精氨酸剥夺疗法是一种极具发展前景的抗肿瘤治疗新手段，主要通过限制肿瘤细胞从血液中摄取足够的精氨酸而达到抑制肿瘤细胞的生长的目的，其中精氨酸脱亚胺酶（adi）、精氨酸琥珀酸合成酶1（ass1）等均是该剥夺疗法的研究热点。这类药物已在欧美被批准作为治疗黑色素瘤、脑胶质瘤和肝细胞癌中的应用。
6.此外，作为一种罕见病，高精氨酸血症是由于精氨酸酶1缺陷引起尿素循环代谢障碍疾病，发病年龄相对较晚（儿童早期），并随着时间的推移而恶化。典型的临床表现是认知和运动能力的退化，进行性痉挛性瘫痪，癫痫，身材矮小，发育迟缓，早期死亡，目前尚无高效的治疗方法，主要是通过饮食中限制蛋白质的摄入以降低精氨酸的摄取为主要的治疗手段，此外，增加废物氨的旁路代谢，促进氮的排泄也是治疗该病的措施之一。尽管上述措施都可控制体内血精氨酸水平，减缓和阻止病情的恶化，但均不能根治疾病，且治疗效果也差强人意。对于年龄尚小的患儿来说，通过限制饮食来控制疾病并不是长久之计。因此，开发
一种既可以有效降低患者体内精氨酸水平，又无需刻意控制蛋白摄入的治疗方法显得尤为重要和迫切，而补充具有相应特殊功能的益生菌，尤其在后疫情时代，或许会成为一种有效的替代方式和常态。
7.目前益生菌中具有精氨酸降解能力的菌株还比较少，而已公开的菌株中精氨酸消耗能力普遍较弱。据报道，l.pontis jsb7菌株精氨酸的消耗量可达0.96
±
0.03 mmol/l，而l.fermentum jsa30菌株精氨酸的消耗量达0.86
±
0.09mmol/l（专利号：cn 106479923 a）。因此，开发具有更强降解精氨酸能力的益生菌是本发明的主要解决的技术问题。


技术实现要素：

8.本发明的第一个目的是提供了一种发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum），所述发酵粘液乳杆菌在保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为cgmcc no.26578，保藏日期为2023年2月20日，命名为vb216。其具有多种致病菌抑制活性以及优异的降解精氨酸活性。
9.在本文中，“发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216”和“发酵粘液乳杆菌vb216”同义。
10.本发明的第二个目的是提供一种发酵液，其包含前述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216。
11.本发明的第三个目的是提供一种发酵上清液，其包含：
12.前述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216；和/或
13.前述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216的代谢产物。
14.需要说明的是，“发酵上清液”是指发酵液经离心后的上层清液，其可能包含发酵粘液乳杆菌vb216、或发酵粘液乳杆菌vb216的代谢产物，或者同时包含发酵粘液乳杆菌vb216及其代谢产物。
15.本发明的第四个目的是提供一种微生物菌剂，所述的微生物菌剂含有前述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216。
16.作为一种具体的实施方式，所述发酵粘液乳杆菌vb216是以活细胞、干菌体、固定化的细胞或者以其他任何形式存在的。
17.在本文中，“活细胞”是指是发酵粘液乳杆菌vb216具有新陈代谢、繁殖或复制能力；“固定化的细胞”是指发酵粘液乳杆菌vb216固定在载体上，可在一定的空间范围进行生命活动(生长、发育、繁殖、遗传和新陈代谢等)。
18.作为一种具体的实施方式，所述干菌体是所述发酵粘液乳杆菌vb216经冷冻干燥处理获得的。
19.作为一种具体的实施方式，所述微生物菌剂选自微生物液体菌剂或微生物固体菌剂。
20.作为一种具体的实施方式，所述微生物菌剂中还含有食品、药品、保健食品和饲料中的至少之一可接受的菌株。
21.在本文中，“食品中可接受的”是指可被人类食用的物质或组合物，其可根据不同国家的食品要求进行调整。
22.在本文中，“保健食品中可接受的”是指可被人类食用的物质或组合物，其可根据
不同国家的保健食品要求进行调整。
23.在本文中，“饲料中可接受的”是指可被动物食用的物质或组合物，其可根据不同国家的饲料要求进行调整。
24.在本文中，“药品中可接受的”（或称药学上可接受的）是指物质或组合物必须与包含制剂的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物化学上和/或毒理学上相容。优选地，本发明所述的“药学上可接受的”是指联邦监管机构或国家政府批准的或美国药典或其他一般认可药典上列举的在动物中、特别是人体中使用的。
25.作为一种具体的实施方式，所述微生物菌剂还含有食品、药品、保健食品或饲料中可接受的载体或辅料。
26.在本文中，术语“药学上可接受的载体”包括任何溶剂，药物稳定剂，或其组合物，这些载体都是所属技术领域技术人员已知的。除了任意常规载体与活性成分不相容的情况外，涵盖其在治疗或药物组合物中的用途。
27.在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本公开的发酵粘液乳杆菌vb216不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本公开所考虑的范围。
28.本发明的第五个目的是提供前述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216、前述的发酵液、前述的发酵上清液或前述的微生物菌剂在制备预防和/或缓解和/或治疗精氨酸代谢相关的疾病的产品中的应用。
29.作为一种具体的实施方式，所述疾病包括但不限于高精氨酸血症、恶性肿瘤治疗、过敏反应、湿疹、瘙痒和腹部痉挛。
30.作为一种具体的实施方式，所述恶性肿瘤包括但不限于恶性黑色素瘤、肝细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤、结直肠癌。
31.作为一种具体的实施方式，所述产品为食品、保健食品、饲料或药品。
32.作为一种具体的实施方式，所述产品可应用于人类或动物。
33.作为一种具体的实施方式，所述产品包括所属领域中的常规添加成分。
34.作为一种具体的实施方式，所述产品为食品，所述食品可采用不同的剂型，如粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂等形式；在药物组合组中，可适当添加一些辅料，包括填充剂、稀释剂、赋型剂、吸收促进剂等。优选地，所述食品可以是发酵食品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、含乳饮料、固体饮料、乳酪、乳粉等普通食品或保健食品。
35.作为一种具体的实施方式，所述产品为药品，所述药品的具体生产方法和配方可参考现有技术中含益生菌的药物进行。
36.作为一种具体的实施方式，所述产品为饲料，所述饲料的具体生产方法和配方可参考现有技术中含益生菌的饲料进行，本发明的发酵粘液乳杆菌或其菌制剂作为益生菌补充剂添加。
37.进一步，所述发酵粘液乳杆菌具有如下特性：
38.（1）本发明的发酵粘液乳杆菌对胃肠道的耐受能力强，在ph3.0的人工胃液中处理2h后存活率可达84.31%，而处理4h后存活率仍有76.47%；在ph6.8的人工小肠液中处理2h后存活率为91.4%，而处理4h后存活率仍高达90.48%。
39.（2）本发明的发酵粘液乳杆菌对克林霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、阿奇霉素、阿莫西林、头孢类、利福平等多种抗生素敏感，且不含外源抗生素耐药基因，食用安全。
40.（3）本发明的发酵粘液乳杆菌溶血反应、明胶液化、吲哚反应均为阴性，且代谢不产生氨和生物胺，说明该菌代谢毒性检测均安全。
41.（4）本发明的发酵粘液乳杆菌具有多种致病菌的抑制活性，能抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、粪肠球菌、单增李斯特氏菌等的生长，可保护胃肠道、女性阴道、乳腺组织或其他器官免受病原菌的侵扰，因此，可单独或与其他益生菌组合，应用于多种疾病的辅助治疗，比如妇科疾病、胃肠道疾病、乳腺炎等。
42.（5）本发明的发酵粘液乳杆菌还具有优异的精氨酸降解能力，在含有0.5%或1%精氨酸的mrs培养体系中均可在24h内快速降解80%以上的精氨酸，同时二代测序结果也佐证了该菌株在基因arca和arcc的转录水平表达上分别有4倍和5.5倍上调，而这两个基因都是参与鸟氨酸循环的关键酶基因。
附图说明
43.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
44.图1 vb216的单菌落形态；
45.图2 vb216的革兰氏染色镜检图；
46.图3 vb216的菌株溶血反应；
47.图4 vb216在1%精氨酸培养体系中的代谢曲线；
48.图5 vb216在0.5%精氨酸培养体系中的代谢曲线；
49.图6 vb216培养工艺流程图。
具体实施方式
50.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
51.需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
52.在本文中，术语“含有”、“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
53.在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
54.在本文中，“预防”和“防止”可互换使用。这些术语指获得有益的或期望的结果的方法，包括但不限于预防性益处。为了获得“预防性益处”，可将发酵粘液乳杆菌或含有其的产品给予有罹患特定疾病风险的受试者，或给予报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使可能该疾病的诊断尚未作出。
55.在本文中，术语“治疗”和“缓解”均是指用于获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
56.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
57.实施例1：发酵粘液乳杆菌vb216的分离与鉴定
58.本发明的发酵粘液乳杆菌vb216是从婴儿肠道中分离得到的。该菌株已于2023年2月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，分类命名：发酵粘液乳杆菌(limosilactobacillusfermentum)；保藏编号为cgmcc no.26578。
59.1.1发酵粘液乳杆菌vb216的分离纯化
60.样本采集自不同月龄的健康婴儿粪便，经10倍梯度稀释法涂布于乳酸杆菌选择性培养基平板上，置于37℃厌氧培养2-3天。挑取平板上不同形态的疑似乳杆菌单菌落在新鲜的mrs平板上进行划线分离，37℃厌氧培养2-3天后，再次挑取平板上不同形态的单菌落进一步划线纯化，如此重复2-3次，直至得到纯的形态单一的菌落为止，镜检无杂菌后依1.2进行菌株鉴定。
61.1.2发酵粘液乳杆菌vb216的鉴定
62.将分离得到的单菌落接种到新鲜mrs培养基中，37℃培养16-24h，再转移适量菌液至另一新鲜mrs培养基中，继续培养16-24h，如此连续传代3次以上，然后将培养所得的发酵液进行离心，收集菌体，按照通用的细菌基因鉴定方法进行dna提取及pcr序列扩增并送外测序。在genbank中使用blast程序对所测得的16s rdna序列进行同源性比对，结果显示，同源性最高的种属为发酵乳杆菌，高达99.8%以上。后经全基因组测序，确认该菌株是一株新的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillusfermentum），并将其命名为vb216。
63.发酵粘液乳杆菌vb216的16s rdna测序结果如seq id no:1所示。
64.ccaacggcggggtgcctatacatgcagtcgaacgcgttggcccaattgattgatggtgcttgcacctgattgattttggtcgccaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtaggtaacctgcccagaagcgggggacaacatttggaaacagatgctaataccgcataacagcgttgttcgcatgaacaacgcttaaaagatggcttctcgctatcacttctggatggacctgcggtgcattagcttgttggtggggtaacggcctaccaaggcgatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacaatgggactgagacacggcccatactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgcaagcctgatggagcaacaccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacacgtatgagagtaactgttcatacgttgacggtatttaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagagagtgcaggcggttttctaagtctgatgtgaaagccttcggcttaaccggagaagtgcatcggaaactggataacttgagtgcagaagagggtagtggaac
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65.实施例2：发酵粘液乳杆菌vb216的菌株特性
66.2.1发酵粘液乳杆菌vb216的分类学特征
67.发酵粘液乳杆菌vb216为兼性厌氧乳酸菌，最适生长温度为35-37℃，其菌落形态如图1所示，菌落颜色为乳白色，大多正圆形，表面湿润光滑，扁平，微微凸起，边缘规则，直径一般在2-5mm范围。氧化酶和接触酶均阴性，革兰氏染色为阳性，镜检下呈杆状，无芽孢，见图2所示。
68.理化试验结果如下表1所示：
69.表1粘液乳杆菌vb216理化实验结果
[0070][0071]
2.2发酵粘液乳杆菌vb216的胃肠液耐受性
[0072]
2.2.1人工胃液耐受性试验
[0073]
方法：将发酵粘液乳杆菌vb216菌株接种于新鲜mrs培养基中，于37℃培养16-20h，离心，收集菌体。再将待测菌株接种到人工胃液（ph3.0）中培养，于37℃下分别处理0h、2h和4h后进行平板活菌计数，最终以存活率（即处理后的活菌量/初始活菌量
×
100％）来评价该菌株的耐酸性。实验结果见下表2：
[0074]
表2粘液乳杆菌vb216耐酸性结果
[0075][0076]
vb216菌株在人工胃液中处理2h后存活率可达84.31%，而处理4h后存活率仍有76.47%，说明本发明的发酵粘液乳杆菌vb216具有较强的耐胃酸能力。
[0077]
2.2.2人工肠液耐受性试验
[0078]
方法：将发酵粘液乳杆菌vb216菌株接种于新鲜mrs培养基中，于37℃培养16-20h，离心，收集菌体。再将待测菌株接种到人工小肠液（ph6.8）中培养，于37℃下分别处理0h、2h和4h后进行平板活菌计数，最终以存活率（即处理后的活菌量/初始活菌量
×
100％）来评价该菌株的肠液耐受性。实验结果见下表3：
[0079]
表3 粘液乳杆菌vb216肠液耐受性结果
[0080][0081]
vb216菌株在人工小肠液中处理2h后存活率为91.4%，而处理4h后存活率仍高达90.48%，说明本发明的发酵粘液乳杆菌vb216具有优异的耐肠液能力。
[0082]
实施例3：发酵粘液乳杆菌vb216的安全性
[0083]
3.1抗生素敏感性检测
[0084]
本实施例检测了发酵粘液乳杆菌vb216对庆大霉素、克林霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、阿奇霉素、阿莫西林、头孢类抗生素等十余种抗生素的抗性。测定采用微量肉汤稀释法进行，遵照国际标准化组织指导方针，即iso 10932:2010（e）“milk and milk products:determination of the minimal inhibitory concentration (mic) of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria (lab)”中的检测方法，以标准株干酪乳杆菌atcc334作为对照，采用数据模式计算每种抗生素的mic值。实验结果见下表4：
[0085]
表4 粘液乳杆菌vb216抗生素的mic值
[0086][0087]
由上表可知，发酵粘液乳杆菌vb216对所检测的克林霉素、氨苄青霉素、四环素、氯霉素、阿奇霉素、阿莫西林、头孢类、利福平等多种抗生素敏感，且不含外源抗生素耐药基因，因此食用安全。
[0088]
3.2代谢毒性检测
[0089]
溶血反应：将新鲜培养好的发酵粘液乳杆菌vb216划线涂布于溶血试验平皿中，37℃厌氧培养约2-3天，观察菌落周围是否出现透明或半透明的溶血环。结果如图3显示，菌落周围并未出现溶血环，为阴性，说明发酵粘液乳杆菌vb216不溶血。
[0090]
明胶液化：为了确认蛋白质的分解能力以评价细菌侵入细胞的能力，特意考察了明胶液化试验。将新鲜培养的发酵粘液乳杆菌vb216接种到明胶生化管中，37℃厌氧培养约2-3天，然后取出静置于2-8℃的冰箱10-30min后观察明胶的状态。结果显示，冷藏30min后明胶呈固态，并且连续观察一周后仍为固态，说明发酵粘液乳杆菌vb216明胶液化反应为阴性。
[0091]
吲哚反应：将新鲜培养的发酵粘液乳杆菌vb216接种到蛋白胨水培养基中，37℃厌氧培养约1-2天后再滴加2-4滴kovacs靛基质试剂，观察是否出现红色环。结果显示，菌液并未出现红色环，说明发酵粘液乳杆菌vb216代谢不产生吲哚。
[0092]
尿素酶：将新鲜培养的发酵粘液乳杆菌vb216接种到尿素酶试验生化管中，37℃厌氧培养约1-2天后观察显色反应。结果显示，培养基呈黄色，为阴性，说明发酵粘液乳杆菌vb216代谢不产氨。
[0093]
苯丙氨酸脱氨反应：将新鲜培养的发酵粘液乳杆菌vb216接种到苯丙氨酸培养基中，37℃厌氧培养约1-2天后再滴加2-3滴苯丙氨酸指示剂，并于5min内观察显色反应。结果显示，菌液呈黄色，为阴性，说明发酵粘液乳杆菌vb216代谢不产生物胺。
[0094]
实施例4：发酵粘液乳杆菌vb216的病原菌抑制能力检测
[0095]
方法：将发酵粘液乳杆菌vb216菌株接种于新鲜mrs培养基中，于37℃培养16-20h，离心收集菌渣，并用无菌水制成菌悬液。将活化后的大肠埃希氏菌cmcc44102、金黄色葡萄球菌cmcc26003、乙型副伤寒沙门氏菌cmcc50094、痢疾志贺氏菌cmcc51252、粪肠球菌atcc29212、单增李斯特氏菌atcc19114、白色念珠菌cmcc（f）98001等依照国标法接种于新鲜mrs平板上，静置晾干几分钟，再在培养基中打孔并编号。往孔中加入约50ul左右的新鲜待测菌液，对照组加入等量的无菌水，在37℃下有氧培养2-3天后观察孔周围是否出现抑菌
圈及测量抑菌圈大小。实验结果见下表5：
[0096][0097]
以上结果表明，本发明的发酵粘液乳杆菌vb216对除白色念珠菌外的其余6种致病菌均呈现出一定的抑制能力，其中尤其对大肠埃希氏菌cmcc44102、金黄色葡萄球菌cmcc26003和乙型副伤寒沙门氏菌cmcc50094这三种致病菌的抑制效果更强。
[0098]
实施例5：乳杆菌体外精氨酸降解能力检测
[0099]
为了比较不同乳杆菌对精氨酸的降解能力差异，我们分别从宁波明舟生物、上海复祥生物、青岛海博生物、杭州天动立化学品有限公司等途径购买了七种不同种属的乳杆菌，如鼠李糖乳杆菌atcc7469（菌1#）、植物乳杆菌atcc14917（菌2#）、干酪乳杆菌atcc334（菌3#）、罗伊氏乳杆菌dsm17938（菌4#）、嗜酸乳杆菌dsm3353（菌5#）、发酵乳杆菌cect5716（菌6#）、发酵乳杆菌（菌7#，市售汤臣倍健）等。实验方法如下：首先，将上述7种乳杆菌和本发明的发酵粘液乳杆菌vb216（菌8#）冻干管菌液接种于新鲜mrs液体培养基，于37℃培养16-20h，离心收集菌渣，再用适量无菌水制成菌悬液（10
8-109cfu/ml），待用。配制适量的mrs培养基，分别加入适量精氨酸，使得精氨酸的终浓度分别是1%和0.5%，调整ph6.5-7.0，于121℃灭菌15分钟。然后，将上述两种培养基各自分装25ml/瓶，分别接种30ul上述八种乳杆菌的菌悬液，每组各接2瓶，置于37℃，摇床低速厌氧培养2天，定时取样，用hplc测定发酵液中残留的精氨酸含量。实验结果见图4和图5。
[0100]
由结果可知，除了发酵粘液乳杆菌vb216外，其余7种乳杆菌对精氨酸几乎无降解能力。而本发明的发酵粘液乳杆菌vb216无论是处于0.5%精氨酸还是1%精氨酸环境，均可在24h内快速降解80%以上精氨酸，此后维持稳定水平，说明该菌株对精氨酸具有优异的降解能力。
[0101]
此外，还对以上3株发酵乳杆菌（菌6#、菌7#和菌8#）进行二代测序，比较三者在基因转录水平的表达差异，最终发现，与其他两株发酵乳杆菌相比，本发明的发酵粘液乳杆菌vb216分别在基因arca、arcc的表达上有4倍和5.5倍上调，其中arca编码精氨酸脱亚胺酶，arcc编码氨甲激酶，两者均是参与鸟氨酸循环的关键酶。这也充分说明了vb216具有优异精氨酸降解能力的原因所在。
[0102]
实施例6：发酵粘液乳杆菌vb216菌粉的制备及其应用
[0103]
按照图6所示的培养工艺流程图，将本发明的发酵粘液乳杆菌vb216甘油管菌液在mrs固体培养基中活化2-3天后，挑选典型的单菌落接种到装有mrs液体培养基的摇瓶中，作为一级种子液，在37℃条件下进行厌氧培养16-24h。然后再移种到二级种子罐（mrs培养基）中，移种量为1
‰‑5‰
，厌氧培养1天后转移至发酵罐中进行发酵，于4-10℃、10000rpm下离心5-10min，收集菌体。所收集的菌体经过冷冻干燥得到vb216的活性冻干菌粉，经过严格的质量及活性检测后可置于-20℃一下保存。本实施例所制得的vb216冻干菌粉可用于食品、
保健食品、饲料或药品。所述食品可以是发酵食品(例如发酵乳、风味发酵乳、发酵乳饮料等)、含乳饮料、固体饮料、乳酪、乳粉等普通食品或保健食品。发酵粘液乳杆菌可以以活菌或灭活方式存在于所述食品、保健食品、饲料或药品中。本发明所述的菌制剂或组合物可应用于人类或动物。所述组合物包括所属领域中的常规添加成分，比如，在食品中所述组合物可采用不同的剂型，如粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮剂等形式；在药物组合组中，可适当添加一些辅料，包括填充剂、稀释剂、赋型剂、吸收促进剂等。所述组合物具有抑制多种致病菌的活性和降解精氨酸的能力。

技术特征：
1.一种发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216，其特征在于，所述发酵粘液乳杆菌在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为cgmcc no.26578，保藏日期为2023年2月20日。2.一种发酵液，其特征在于，所述发酵液包含权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216。3.一种发酵上清液，其特征在于，所述发酵上清液包含：权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216；和/或权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216的代谢产物。4.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂含有权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216。5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述发酵粘液乳杆菌vb216是以活细胞、干菌体、固定化的细胞或者以其他任何形式存在的；所述干菌体是所述发酵粘液乳杆菌vb216经冷冻干燥处理获得的；所述微生物菌剂选自微生物液体菌剂或微生物固体菌剂。6.根据权利要求4或5所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中还含有食品、药品、保健食品和饲料中的至少之一可接受的菌株。7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂还含有食品、药品、保健食品或饲料中可接受的载体或辅料。8.权利要求1所述的发酵粘液乳杆菌（limosilactobacillus fermentum）vb216、权利要求2所述的发酵液、权利要求3所述的发酵上清液或权利要求4~7任一项所述的微生物菌剂在制备预防和/或缓解和/或治疗精氨酸代谢相关的疾病的产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疾病选自高精氨酸血症、恶性肿瘤、过敏反应、湿疹、瘙痒和腹部痉挛中的至少之一；所述恶性肿瘤包括恶性黑色素瘤、肝细胞癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、小细胞肺癌、恶性胸膜间皮瘤、结直肠癌。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品为食品、保健食品、饲料或药品。

技术总结
本发明公开了一种发酵粘液乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）VB216，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.26578，保藏日期为2023年2月20日。所述发酵乳杆菌具有多种致病菌抑制活性以及优异的降解精氨酸活性。可在制备预防和/或缓解和/或治疗精氨酸代谢相关的疾病，如高精氨酸血症、恶性肿瘤治疗、过敏反应、湿疹、瘙痒、腹部痉挛等产品如食品、保健食品、药品、饲料中的应用，具有巨大的应用前景。具有巨大的应用前景。具有巨大的应用前景。


技术研发人员：范丹丹 冯国栋 吴骏 徐金勇 胡坚
受保护的技术使用者：杭州微致生物科技有限公司
技术研发日：2023.07.26
技术公布日：2023/8/31