GapN蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用

gapn蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用
技术领域
1.本发明属于分子疫苗学技术领域，具体涉及gapn蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用。
技术背景
2.无乳链球菌(streptococcus agalactiae)是一种危害严重的、宿主广泛的人畜共患的革兰氏阳性菌。作为胞内寄生菌，其可突破血脑屏障，引起婴儿的败血症和脑膜炎等。此外其宿主广泛，除了感染人、牛、羊等哺乳动物，也可以感染罗非鱼等鱼类，导致严重的无乳链球菌病，引起脑膜炎等。时至今日，世界上每年因无乳链球菌感染而导致的经济损失达数百亿美元。而近年来，我国罗非鱼养殖中面临的主要病害为无乳链球菌病，其可危害亲鱼、幼鱼、成鱼等各阶段罗非鱼，造成大量鱼体死亡，致使国内水产业承受巨额经济损失，严重制约养殖业的发展。传统的罗非鱼养殖中，存在养殖密度过大、水质较差等问题，生产中常大量使用抗菌药物如磺胺类药物来防治无乳链球菌病，不仅污染水体环境，促使耐药细菌的出现，此外药物的残留与积累更危害着公共的饮食健康。在全国限制抗生素滥用的背景下，使用疫苗来防控无乳链球菌成为大势所趋。
3.目前，在罗非鱼无乳链球菌疫苗方向，开展了包括灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白亚单位疫苗等研究。然而已有的亚单位疫苗研究存在保护效果欠佳、不稳定等问题。本发明构建的无乳链球菌gapn重组蛋白亚单位疫苗能够提供最高可达93.3％的相对免疫保护率，其相对免疫率显著高于其他已有的罗非鱼无乳链球菌重组蛋白亚单位疫苗。申请号：201610314912.5，重组groel蛋白亚单位疫苗，其免疫保护效力为68.61
±
7.39％；申请号：201710070035.6，重组cbp蛋白亚单位疫苗，其对罗非鱼抗无乳链球菌的免疫保护率达到56.35％
±
8.09％；申请号：20150059140.0，重组gpi蛋白亚单位疫苗，其重组蛋白具有50.98％的免疫保护效力；申请号：201510059133.0，重组bp-2b蛋白亚单位疫苗，其重组蛋白具有41.93％的免疫保护效力。
4.综上，本发明构建的无乳链球菌gapn重组蛋白亚单位疫苗因其高保护率、成本较低、效果稳定，适合推广成为罗非鱼无乳链球菌的新型重组亚单位疫苗。


技术实现要素：

5.gapn蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用，所述的gapn蛋白的氨基酸序列为seq id no.2所示。其对应的核苷酸序列为seq id no.1所示，将该蛋白无菌处理后与佐剂按比例混合，腹腔注射罗非鱼后，发现其可有效提高无乳链球菌攻毒后罗非鱼的存活率。
6.为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
7.一种罗非鱼无乳链球菌抗原蛋白gapn，其氨基酸序列为seq id no.2所示。可利用常规方案，例如合成，原核表达等方式获得该蛋白。
8.gapn蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用，包括利用该蛋白无菌处
理后与佐剂按比例混合，制备为罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗。
9.以上所述的疫苗，是1mg/ml的gapn蛋白，与弗氏完全/不完全佐剂以1:1的体积比混合后乳化获得。与现有疫苗相比，本发明具有以下优点：
10.传统的灭活无乳链球菌疫苗具有一定的的保护效果，但保护率较低，且随着无乳链球菌的不断变异，不明确其对异源菌株的保护效果。减毒活疫苗为传代致弱的菌株，其毒力减弱的机制不清楚，存在毒力返强的可能性，对罗非鱼仍存在威胁。其他已有的亚单位疫苗，如groel、sip等重组蛋白亚单位疫苗的最高相对保护率分别为68.61％和63％，而本发明提供的亚单位疫苗具有93.3％的最高相对保护率。相比已有的其他罗非鱼无乳链球菌疫苗，它保护率更高，同时也具有高生物安全性。
附图说明
11.图1为实施例1中制备的gapn蛋白诱导表达示意图；
12.其中泳道：m为蛋白marker，1为重组gapn蛋白诱导表达前的全菌蛋白，2为重组gapn蛋白在16℃诱导表达12h后的全菌蛋白，3为高压破碎后离心上清液蛋白，4为高压破碎后包涵体蛋白。
13.图2为实施例1中制备的gapn蛋白经超滤离心后的蛋白检测示意图；
14.其中泳道：m为蛋白marker，1为重组gapn蛋白。
15.图3重组gapn蛋白免疫攻毒罗非鱼的流程示意图。
16.图4免疫罗非鱼攻毒后存活率。
17.图5免疫罗非鱼攻毒后各组织的组织载菌量。
18.图6免疫罗非鱼攻毒后各组织的组织病理学变化。
具体实施方式
19.本发明所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。
20.实施例1：
21.罗非鱼源无乳链球菌抗原蛋白gapn(本发明或称gapn蛋白)的制备：
22.本发明实施例以原核表达为例，对该蛋白的表达进行说明：
23.大肠杆菌(escherichia coli)bl21/pet-32a-gapn的构建，表达并纯化目的蛋白
24.1)构建表达载体
25.将gapn基因(seq id no.1所示序列)按常规方法插入pet-32a(+)的bamhi和kpni酶切位点之间，构建重组载体pet-32a-gapn。转化至大肠杆菌dh5a感受态菌株中，挑取阳性克隆扩大培养后提取质粒，后送测序，验证序列，比对正确后即为重组pet-32a-gapn质粒。将重组质粒pet-32a-gapn转化至感受态细胞bl21(de3)中，采用菌落pcr的方法，挑选阳性克隆并送武汉擎科生物公司测序，比对正确，即为gapn蛋白的表达菌株。
26.2)表达、纯化目的蛋白
27.将大肠杆菌bl21/pet-32a-gapn接种于10ml lb液体培养基中(含50μg/ml amp)，于37℃摇床培养，振荡培养过夜。将培养好的菌液中按1:1000比例转接于1000ml含amp的lb培养基中，37℃振荡培养4h，当菌液od
600
达到0.6时加入iptg至其终浓度为1mmol/l，并使用
16℃振荡培养12h后收集菌体。
28.将诱导后的重组大肠杆菌5000r/min离心20min，用pbs(ph7.4)重悬洗涤3次，弃上清，得菌体，用100ml native lysis buffer(50mm nah2po4,300mm nacl,10mm imidazole,10mmβ-me,ph 8.0)重悬菌体沉淀，使用压力破碎仪，在1000bar高压下破碎20min至菌液清亮，完成破碎后，4℃，12000r/min离心50min，分离上清和沉淀。
29.将诱导表达的重组蛋白gapn进行(包括seq id no.2所示序列)进行sds-page分析(如图1所示)，条带大小为70kda。将其纯化后，使用超滤管将重组gapn蛋白进行浓缩，通过nanodrop-8000分光光度计在280nm吸光度测定蛋白浓度(浓度为1mg/ml)，得到单一条带、条带大小正确的重组蛋白(如图2所示)
30.实施例2：
31.一种罗非鱼源无乳链球菌抗原蛋白gapn在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗的应用：
32.1)实验方案(免疫流程图如图3所示)
33.实验动物：罗非鱼(10
±
1g)购买于广东珠海粤强丰水产养殖场。
34.攻毒菌株：罗非鱼源无乳链球菌hn016菌株(以下简称hn016)，已在文章中公开。
35.实验分组：罗非鱼分为3组：免疫组(gapn)、pbs组(阴性对照)、空白对照组，每组60尾，罗非鱼的规格为(10
±
1g)。正式实验前暂养7天，水温30
±
2℃，养殖用水为曝气自来水，微流水系统中，水流速控制在每天更换全缸水三分之一。暂养期间投喂配合饲料，每天投喂两次，每次按照鱼体重1.5％比例投喂。饲养1周确认鱼体健康后进行后续实验，每次实验前24h禁食。所有组均以相同的条件进行饲养(li m,li l,huang t,liu y,lei a,ma c,chen f,chen m.effects of attenuated s.agalactiae strain ym001 on intestinal microbiota of tilapia are recoverable.front microbiol.2019jan 9；9:3251.doi:10.3389/fmicb.2018.03251.pmid:30687255；pmcid:pmc6333689.)。
36.疫苗制备：用于首次免疫的重组蛋白亚单位疫苗的制备方法如下：将重组gapn蛋白在超滤管离心下，浓缩至浓度为1mg/ml，再用弗氏完全佐剂以1:1的体积比混合，然后用超声破碎机(150w，工作10s，间隔5s)搅拌4次，以获得稳定的乳化液，然后用注射器反复抽吸混匀，直至乳化液滴于水面而不扩散。
37.用于二次加强免疫的重组gapn蛋白亚单位疫苗的制备方法如下：将制备得到的重组gapn蛋白(1mg/ml)，与弗氏不完全佐剂以1:1的体积比混合，然后用超声破碎机(150w，工作10s，间隔5s)搅拌4次，以获得稳定的乳化液，然后用注射器反复抽吸混匀，直至乳化液滴于水面而不扩散。
38.免疫方式：腹腔注射，免疫剂量为200μl/尾，即免疫剂量为100μg/尾，首次免疫两周后，进行二次加强免疫，免疫剂量与第一次相同。
39.攻毒方式：在首次免疫28天后，将实验组与对照组的鱼再分成2个不同的攻毒浓度组，高浓度组：107cfu/尾，15尾/组(高浓度(107cfu/尾)的7d死亡率为90％，14d死亡率是100％，为致死剂量攻毒。)；低浓度组：106cfu/尾，21尾/组，其中，低浓度组的21尾鱼中15尾用于免疫攻毒实验的相对免疫保护率计算，剩余6尾用于免疫实验的采样。分组后，分别用浓度为107cfu/尾、106cfu/尾的无乳链球菌hn016对不同攻毒浓度组的罗非鱼进行腹腔注射攻毒感染实验，200μl/尾。对于所有攻毒后的罗非鱼连续观察监测14天，所有组均以相同的
条件进行饲养。期间，及时将病死鱼捞出。攻毒根据以下公式计算相对保护率(rps)：相对免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)
×
100％。根据以下公式计算相对保护率(rps)：相对免疫保护率＝(1-免疫组死亡率/对照组死亡率)
×
100％。
40.2)亚单位疫苗对罗非鱼的生物安全性评价
41.首次免疫后及二次免疫后各连续14天监测是否出现死亡，观察免疫后罗非鱼的采食及活力。免疫后的罗非鱼没有明显应激症状，免疫后无罗非鱼死亡，罗非鱼摄食量未见减少。
42.3)免疫罗非鱼攻毒后抗体水平检测
43.首次免疫14天后，在免疫组和pbs对照组中各自随机选取3尾鱼进行尾静脉全血采集，4℃过夜静置，4000r/min离心10min，以制备首次免疫后的血清和阴性对照的血清。
44.二次免疫14天后，在免疫组和pbs对照组中各自随机选取3尾鱼进行尾静脉全血采集，4℃过夜静置，4000r/min离心10min，以制备二次加强免疫后的血清和阴性对照的血清。
45.无乳链球菌攻毒感染14天后，在低浓度攻毒组中用于免疫实验采样的鱼中，各随机选取3尾鱼进行尾静脉全血采集，4℃过夜静置，4000r/min离心10min，以制备免疫攻毒后的血清、未经免疫的攻毒血清和阴性对照的血清。
46.用上述制备得到的血清进行elisa血清抗体效价检测，使用重组gapn蛋白作为抗原，用抗原包被液将抗原蛋白稀释至终含量为500ng/100μl(孔)，elisa流程如下：
47.1、96孔板中，每孔加入150μl 2.5％戊二醛，37℃孵育60min，蒸馏水洗板5次，每次5min；
48.2、使用抗原包被液(pbs,ph9.6)将重组gapn蛋白进行稀释，每孔l00μl，置4℃冰箱过夜；
49.3、洗板：弃掉孔中液体，每孔加入250μl洗涤液(pbs+tween20)，洗板5次后拍干；
50.4、封闭：每孔5％(w/v)250μl bsa，37℃孵育60min；
51.5、洗板：弃掉孔中液体，每孔加入250μl洗涤液,轻微震荡洗板5次，最后一次孵育5min，洗板后拍干；
52.6、加待测血清：以12列6行来定义检测板，将用pbs稀释的罗非鱼的血清在检测板上每个稀释度加至一列6孔，各12个稀释梯度(1:32-1:65536)，每孔l00μl，37℃孵育3h；
53.7、洗板：弃掉孔中液体，每孔加入250μl洗涤液洗板5次，最后一次孵育5min，洗板后拍干；
54.8、一抗反应：每孔加入100μl鼠抗罗非鱼igm(2μg/ml)，37℃孵育60min；
55.9、洗板：弃掉孔中液体，每孔加入250μl洗涤液洗板5次，最后一次孵育5min，洗板后拍干；
56.10、二抗反应：每孔加入100μl二抗-羊抗鼠igg，28℃孵育60min；
57.11、洗板：弃掉孔中液体，每孔加入250μl洗涤液洗板5次，最后一次孵育5min，洗板后拍干；
58.12、显色：每孔加入显色液100μl，反应30min；
59.13、终止：每孔加入终止溶液(10％浓h2so4)50μl停止反应；
60.14、终止反应10min后，使用酶标仪，于450nm波长读取od值，计算p/n值。
61.p/n＝(待测血清的od
450-空白对照的od
450
)/(阴性血清的od450-空白对照的
od
450
)。当p/n》2.1时，抗血清的稀释倍数即为其抗体滴度。
62.结果如下表所示，经重组gapn蛋白免疫后，罗非鱼产生高水平的血清抗体，同时在攻毒后未有显著性变化。
63.结果表明，重组gapn蛋白的免疫原性强，可诱导罗非鱼产生高滴度的抗体。
[0064][0065]
4)免疫罗非鱼攻毒后保护力测定
[0066]
免疫组、pbs对照组以及空白对照组均以相同的条件进行饲养，统计攻毒14天内罗非鱼存活以及死亡的情况，并对其计算相对免疫保护率。结果如下表及图4中a-b所示，在高浓度和低浓度两个剂量下，罗非鱼死亡集中在攻毒后前5天，然后平稳。gapn免疫后的罗非鱼在攻毒14天内均具有较高的存活率，在高低浓度攻毒后分别达到了93.30％和72.70％的相对免疫保护率，证明gapn重组蛋白亚单位疫苗可以较好的保护罗非鱼。
[0067][0068]
5)免疫罗非鱼攻毒后组织载菌量测定
[0069]
攻毒3天后，对低浓度攻毒组中用来实验采样的鱼进行样品采集，用于组织载菌量测定。在免疫组和pbs对照组以及空白对照组均随机选取3尾鱼进行组织采样，在取样前使用ms-222麻醉剂对罗非鱼进行麻醉处理，采集每尾鱼的全血、脾脏、肝脏、头肾、体肾和脑组织。
[0070]
将采集得到的所有组织进行称重，并加入500μl无菌pbs进行研磨，对样品进行十倍倍比稀释，依次稀释10-1
、10-2
、10-3
、10-4
，选取每个样品10-3
、10-4
两个浓度，吸取200μl在bhi固体培养基上均匀涂布，每个浓度涂布两个重复。将平板倒置放于28℃培养箱连续培养24h，后进行菌落计数。
[0071]
结果如图5中a-f所示，相对于pbs对照组，免疫组中罗非鱼的脾脏、肝脏、头肾、体肾和脑组织的组织载菌量均有显著性降低。表明疫苗较好的保护免疫组中的罗非鱼，降低组织载菌量，降低攻毒引起的组织损伤。
[0072]
6)免疫罗非鱼攻毒后组织病理变化检测
[0073]
在攻毒14天后，在低浓度攻毒免疫组、pbs阴性对照组、完全空白对照组中，使用上述elisa实验采血后的鱼，进行组织脏器的采集，采集每尾鱼的脾脏、肝脏、头肾、体肾、脑和肠组织。浸泡于4％多聚甲醛固定液中，并进行包埋、切片、染色、制片等病理切片制作。随后，对组织病理切片进行显微镜观察以及组织病理变化分析。
[0074]
结果如图6所示，相对于pbs对照组，免疫组中罗非鱼的脾脏、肝脏、头肾、体肾、脑和后肠在攻毒之后仍保持完整的基本结构，病理损伤较小，与疫苗的高疫苗保护率相符。

技术特征：
1.gapn蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用，所述的gapn蛋白为seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的疫苗，是1 mg/ml 的gapn蛋白，与弗氏完全/不完全佐剂以1:1的体积比混合后乳化获得。

技术总结
本发明公开了GapN蛋白在制备罗非鱼无乳链球菌亚单位疫苗中的应用，所述的GapN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明以罗非鱼无乳链球菌为研究对象，从罗非鱼源无乳链球菌基因组中克隆到gapN基因，与pET-32a(+)载体连接构建表达载体，在E.coli BL21(DE3)中进行原核表达和纯化，利用本发明提供的重组GapN蛋白，无菌处理后与佐剂按比例混合得到重组GapN蛋白亚单位疫苗，腹腔注射罗非鱼，发现其可有效提高攻毒后罗非鱼的存活率，提供最高可达93.3%的相对免疫保护率，安全性试验证实免疫罗非鱼后无不良反应，可有效的防治罗非鱼的无乳链球菌感染。乳链球菌感染。


技术研发人员：张永安 周洋 王洋 鲁焘祯
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.11.11
技术公布日：2023/8/31