一种基于SSR分子标记构建百香果指纹图谱的方法及应用

一种基于ssr分子标记构建百香果指纹图谱的方法及应用
技术领域
1.本发明属于指纹图谱构建领域，具体涉及一种基于ssr分子标记构建百香果指纹图谱的方法及应用。


背景技术：

2.西番莲，俗称“百香果”，随着百香果产业的不断发展，涌现越来越多的新品种/系，这些新品种/系一部分源于原有品种的驯化改良及选育，一部分源于省外引进，还有一部分仅是原有品种的改名换姓。为规范百香果种苗繁育市场，保障百香果产业的健康发展，急需明确百香果各栽培区现有新品种/系的来源。
3.分子标记是指以个体间的核苷酸序列变异为基础进行遗传标记，而其中ssr分子标记（simple sequence repeats），又称为微卫星dna，是一类由几个核苷酸（一般为1-6个）为重复单位组成数个核苷酸的串联重复序列。ssr分子标记技术具有重复性好、稳定性强、所需dna量少等优点，适用于基因型鉴定、遗传多样性分析、亲缘关系确定、品种保护与分子标记辅助育种等研究。
4.目前，百香果中也有利用ssr分子标记技术开展研究，但是大都侧重于对某类百香果资源材料的亲缘关系确定或基因型鉴定等进行研究，但运用ssr分子标记对百香果品种鉴定及指纹图谱构建的研究还鲜有报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于ssr分子标记构建百香果指纹图谱的方法及应用。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种百香果ssr分子标记组合，包括下述15个百香果基因组ssr分子标记：pfssr20和pfssr29；扩增所述百香果ssr分子标记组合的ssr引物组的核苷酸序列序列如下：pfssr20：上游tccaaacaattcaccattgc，下游agtttgactggggagcttca；pfssr29：上游ctgcagtttcttgaggaggg，下游gctgagaagaagggtcaacg。
7.一种试剂盒，包含上述的百香果ssr分子标记组合或ssr引物组。
8.上述的百香果ssr分子标记组合或试剂盒在百香果种质资源鉴定中的应用。
9.上述的百香果ssr分子标记组合或试剂盒在构建百香果指纹图谱中的应用。
10.一种百香果指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取供试百香果样品的基因组dna；(2)以所述供试百香果样品的基因组dna为模板，利用权利要求1中所述的ssr引物组进行pcr扩增；(3)对扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测，根据电泳检测结果构建dna指纹图谱；其中，步骤(1)所述供试百香果品种为
‘
福建1号’、
‘
福建2号’、
‘
福建3号’、
‘
武紫’、
‘
武蜜’、
‘
武砧012’、
‘
民主紫’、
‘
赤港紫’、
‘
台砧’、
‘
三联黄’、
‘
芭乐味’、
‘
金蜜味’、
‘
三联芭
乐味’、
‘
黄金’、
‘
巨无霸’、
‘
荔枝味’和满天星’；其中，步骤(1)所述提取供试百香果样品的基因组dna，方法为取百香果嫩叶，加入液氮研磨成粉末，采用ctab法提取基因组dna，检测总dna的质量，然后将总dna稀释成 100ng/μl，储存于-20℃备用；其中，步骤(2)所述pcr扩增的反应体系总体积为20μl：100ng/μl的基因组dna模板1.5μl，5u/μ的taq酶0.3μl，10μmol/l的上下游引物各1μl，2.5 mmol/l的dntp 4μl，10
×
buffer 2.5μl，加ddh2o补至20μl；其中，步骤(2)所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸7 min。
11.根据上述百香果指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱在百香果种质资源鉴定中的应用。
12.本发明的显著优点在于：(1)本发明通过百香果转录组数据开发出的ssr分子标记具有较高的多态性潜能，在种质鉴定方面有着较高的实用性；并且利用15个ssr分子标记17个福建百香果品种进行了品种鉴别及遗传多样性分析，获得了17个品种的dna指纹图谱，为百香果种质资源的鉴定与分类、种质创新及新品种选育提供理论与技术支撑。
13.(2)本发明通过利用百香果转录组数据开发ssr分子标记，并利用ssr标记对17个百香果品种的遗传多样性分析及dna指纹图谱的构建，该方法快速、准确、精密度、重现性和稳定性良好，并且可以同时鉴定多个品种，方便快捷，所建立的指纹图谱能够有效地表征百香果的品种。
附图说明
14.图1是本发明中引物pfssr5、pfssr6和pfssr9在17个百香果材料中的多态性。
15.图2是本发明中引物pfssr10、pfssr11和pfssr12在17个百香果材料中的多态性。
16.图3是本发明中引物pfssr14、pfssr17和pfssr21在17个百香果材料中的多态性。
17.图4是本发明中引物pfssr26、pfssr30、pfssr32和pfssr43在17个百香果材料中的多态性。
18.图5是本发明中引物pfssr20和pfssr29在17个百香果材料中的多态性。
19.图6是本发明中17个百香果品种的dna指纹图谱。
20.图7是本发明中17个百香果品种的upgma聚类图。
具体实施方式
21.为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
22.实施例1本实施例以17份百香果品种作为样本材料，利用筛选出的ssr引物构建百香果品种的指纹数据，以达到建立指纹图谱及品种鉴定的目的。
23.17份供试百香果品种信息如表1所示，17份百香果来自于福建不同产区，由福建省农业科学院果树研究所百香果种质资源圃所收集保存，且于2021年5月，采集新梢顶端嫩
叶，立即投于液氮中带回实验室。
24.表1 供试品种材料的基本信息百香果品种dna指纹图谱的构建，按如下步骤进行：s1：百香果品种总dna提取每个品种取3个单株的嫩叶各1 g，将各品种百香果的嫰叶放于1.5ml离心管中，加入液氮研磨成粉末，采用ctab法提取基因组dna，其质量和浓度检测采用1.2%琼脂糖电泳和微量紫外分光光度计，然后将总dna稀释成 100ng/μl，保存于-20℃冰箱中待用。
25.s2：ssr引物筛选a.对百香果转录组数据进行组装：采集
‘
黄金’和
‘
台农’2 个百香果品种3个单株嫩叶各3 g，液氮速冻，-80℃保存，后委托北京百迈客生物科技有限公司进行测序；每个单株构建 1 个文库，采用 illumina hiseqtm 2500 pe125 系统进行rna-seq转录组测序，利用trinity组装序列，经过滤，共获unigene 80005条，序列总长81129192 bp；b.根据转录组组装后的数据设计引物：利用misa软件对1kb以上的24319条unigene进行搜索ssr位点；一至六核苷酸重复单元的最少重复次数分别为10、6、5、5、5 和 5 次；以ssr重复单元前后的序列为模板，采用primer 3.0设计引物，每条ssr产生3条引物；所述引物序列长度18 ~ 27 bp，gc含量40% ~ 60%，退火温度57 ~ 63℃，上、下游引物的退火温度值相差≤2℃，扩增产物预期长度100 ~ 280 bp，且无二级结构和二聚体；c.对设计引物扩增且筛选优良的ssr引物：将多对一至六核苷酸的不同重复单元的引物对各百香果品种dna进行ssr-pcr 扩增，在产生的多对有效扩增引物中，选择15对特异性及重复性好的ssr引物，如表2所示；d.ssr引物对序列的筛选步骤；pcr反应试验中，采用pcr反应体系为：总体积20μl，包括100ng/μl的dna模板1.5μl，5u/μ的taq酶0.3μl，10μmol/l的上下游引物各1μl，2.5 mmol/l 的dntp 4μl，10
×
buffer（含mg
2+
）2.5μl，加ddh2o补至20μl；pcr扩增程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸7 min；e.电泳检测：使用labchip gx touch 24核酸分析仪（perkinelmer）进行微流控毛细管电泳检测分析，试验参照试剂盒（dual protocol dna high sens reagent kit）说明
书进行，目的在于鉴定pcr是否扩增出预期产物。
26.表215对百香果ssr引物信息
ꢀ
s3：百香果dna特征指纹图谱的构建根据pcr扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，构建dna分子指纹图谱。
27.利用上述筛选的15对特异性及重复性好的ssr引物，分别对各百香果品种dna进行pcr扩增，由扩增产物电泳图可知（图1至图5），单独一对引物无法将17个百香果品种完全鉴别开，根据条带特异性只能将其分为10-16组。其中分子标记pfssr26和pfssr30的ssr引物鉴别能力最强，均可单独鉴定出15个百香果品种；pfssr5的ssr引物鉴别能力最弱，仅能单独鉴定出6个品种。
28.如图5所示，按“简洁、高效，尽量用最少的引物区分最多的品种”遗传图谱编写的核心原则，我们选出鉴别能力强、条带清晰的 pfssr20的ssr引物和pfssr29的ssr引物用于
构建百香果指纹图谱，可完成对17个品种的鉴定。
29.如图6所示，通过分析可知：pfssr20的ssr引物能鉴别出
‘
福建3号’、
‘
武紫’、
‘
武蜜’、
‘
武砧012’、
‘
民主紫’、
‘
赤港紫’、
‘
台砧’、
‘
三联黄’、
‘
三联芭乐味’、
‘
黄金’、
‘
巨无霸’、
‘
荔枝味’和
‘
满天星’等13个品种，为13个组；
‘
福建1号’和
‘
福建2号’扩增条带相同为一组；同理，
‘
芭乐味’和
‘
金蜜味’为一组，共可分为15组。而pfssr29的ssr引物能单独鉴别出
‘
福建1号’等12个品种，且其在155 bp处可将
‘
芭乐味’和
‘
金蜜味’区分开，在210bp处可将
‘
福建1号’和
‘
福建2号’区分开，与pfssr20的ssr引物相辅相成，构建出简洁并具有较强鉴定能力的17份百香果品种dna指纹图谱，因此过百香果转录组数据开发出的ssr 标记可为百香果的品种鉴定提高理论和技术支撑。
30.实施例2对百香果ssr引物多态性分析及验证。
31.选择上述15对特异性及重复性好的引物，分别对17个品种的百香果dna进行pcr扩增；如上述表2中所示，通过发现15对引物均存在多态性差异，一共产生了235条多态性条带，每对引物产生的多态性条带数在9-26条之间。15对ssr引物的pic平均值为0.95，其中9对引物的pic值达到了0.95以上，且pfssr30的ssr引物的pic值达到了0.97，这说明这些ssr引物包含了较高水平的多态信息；如图6所示，通过运用excel 2010软件将筛选出的所有多态性引物的品种分组情况进行统计对比，发现pfssr20的ssr引物和pfssr29的ssr引物不仅条带清晰且能区分所有百香果品种，因此pfssr20的ssr引物和pfssr29的ssr引物是构建17份百香果品种的dna指纹图谱的最佳引物组合。
32.实施例3百香果品种的聚类分析。
33.利用pfssr20的ssr引物和pfssr29的ssr引物构建17份百香果品种的dna指纹图谱，共识样品基因组dna提取、pcr扩增、微流控毛细管电泳检测分析步骤同实施例1。采用人工读带方法， 统计ssr扩增图谱中同一位置上电泳条带的有无，有条带的赋值为1，无条带的赋值为0，构建二元矩阵表。分子标记数据分析及作图使用 ntsys-pcv2.10软件。先利用qualitative data计算17份百香果种质间遗传相似系数，然后根据相似系数用 sahn clustering 和非加权配对算术平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，upgma）进行聚类分析并制作出聚类树状图。
34.如图7所示，在遗传距离0.765处，可将17份材料区分为7个类群；其中第1个类群包括以
‘
福建1号’为代表的紫果百香果；第2个大类含7个品种，以
‘
福建3号’为代表的黄果百香果聚在一起；剩余5个类群，除
‘
福建2号’和
‘
民主紫’2个紫果聚在一起外，
‘
武紫’、
‘
三联芭乐味’、
‘
荔枝味’以及
‘
武砧012’均自成一类；在类群2中，
‘
福建3号’和
‘
武蜜’2个品种的遗传相似性系数最大，为0.84，说明2个品种基因型相近，可能为同一品种的不同突变株；总体上果皮颜色相近的品种聚在一起，反映了品种间果皮颜色的差异；大多数供试百香果品种亲缘关系较远， 遗传相似性系数在0.68以上， 这可能与百香果异花授粉及长期开放授粉导致不同基因型间基因能频繁交流有关， 由此造成了种质间的差异；同时，来自同一地区的百香果样品在分类上存在差异，说明样品来源地与种质间遗传差异的关系不太明显，百香果品种间存在较为丰富的遗传变异，因此本发明提供的ssr分子标记在遗传
多样性分析及种质鉴定方面有着较高的实用性。
35.综上所述，本发明利用百香果转录组数据构建的ssr分子标记具有较高的多态性潜能，类型丰富，可为百香果遗传多样性分析和dna指纹图谱构建提供丰富可靠的标记选择，为百香果育种材料的选择及品种的快速鉴定提供理论基础及技术支撑。
36.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.百香果ssr分子标记组合，其特征在于，包括下述2个百香果基因组ssr分子标记：pfssr20和pfssr29；扩增所述百香果ssr分子标记组合的ssr引物组的核苷酸序列序列如下：pfssr20：上游tccaaacaattcaccattgc，下游agtttgactggggagcttca；pfssr29：上游ctgcagtttcttgaggaggg，下游gctgagaagaagggtcaacg。2.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求1中所述的百香果ssr分子标记组合或ssr引物组。3.如权利要求1所述的百香果ssr分子标记组合或如权利要求2所述的试剂盒在百香果种质资源鉴定中的应用。4.如权利要求1所述的百香果ssr分子标记组合或如权利要求2所述的试剂盒在构建百香果指纹图谱中的应用。5.一种百香果指纹图谱的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取供试百香果样品的基因组dna；(2)以所述供试百香果样品的基因组dna为模板，利用权利要求1中所述的ssr引物组进行pcr扩增；(3)对扩增产物进行毛细管凝胶电泳检测，根据电泳检测结果构建dna指纹图谱。6.根据权利要求5所述的百香果指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(1)所述供试百香果品种为
‘
福建1号’、
‘
福建2号’、
‘
福建3号’、
‘
武紫’、
‘
武蜜’、
‘
武砧012’、
‘
民主紫’、
‘
赤港紫’、
‘
台砧’、
‘
三联黄’、
‘
芭乐味’、
‘
金蜜味’、
‘
三联芭乐味’、
‘
黄金’、
‘
巨无霸’、
‘
荔枝味’和
‘
满天星’。7.根据权利要求5所述的百香果指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(1)所述提取供试百香果样品的基因组dna，方法为取百香果嫩叶，加入液氮研磨成粉末，采用ctab法提取基因组dna，检测总dna的质量，然后将总dna稀释成 100ng/μl，储存于-20℃备用。8.根据权利要求5所述的百香果指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(2)所述pcr扩增的反应体系总体积为20μl：100ng/μl的基因组dna模板1.5μl，5u/μ的taq酶0.3μl，10μmol/l的上下游引物各1μl，2.5 mmol/l的dntp 4μl，10
×
buffer 2.5μl，加ddh2o补至20μl。9.根据权利要求5所述的百香果指纹图谱的构建方法，其特征在于：步骤(2)所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸7 min。10.根据权利要求5所述百香果指纹图谱的构建方法得到的指纹图谱在百香果种质资源鉴定中的应用。

技术总结
本发明属于指纹图谱构建领域，具体一种基于SSR分子标记构建百香果指纹图谱的方法及应用。所述方法具体为提取百香果DNA，利用百香果DNA和SSR引物进行PCR扩增反应，电泳检测后根据电泳结果构建百香果指纹图谱。本发明通过百香果转录组数据开发出的SSR标记具有较高的多态性潜能，在种质鉴定方面有着较高的实用性。本发明利用15个SSR分子标记17个福建百香果品种进行了品种鉴别及遗传多样性分析，获得了17个品种的DNA指纹图谱，为百香果种质资源的鉴定与分类、种质创新及新品种选育提供理论与技术支撑。术支撑。


技术研发人员：魏秀清 许家辉 李亮 许玲
受保护的技术使用者：福建省农业科学院果树研究所
技术研发日：2022.11.28
技术公布日：2023/8/31