用于检测结合亲和力的衍射传感器

1.本发明涉及一种用于检测结合亲和力的衍射传感器。


背景技术：

2.在结合亲和力的检测或监测中(例如，当要检测样品中包含的靶分子的存在时)，交互传感器通常被用于多种类型和应用。例如，为了检测具有共同特性或结合位点的靶分子或一组靶分子与亲和元素结合的亲和力，将大量特定种类的亲和元素固定在交互传感器的外表面上。亲和元素表示任何种类的元素或元素部分，其导致特定靶分子或靶分子组在交互传感器上的附着或预先确定的最短停留时间(该最短停留时间必须至少足够长以允许可靠地检测靶分子或靶分子组)。靶分子与这种特定种类的亲和元素的结合(或非结合)被检测并且被用于提供关于靶分子或靶分子组的结合亲和力的信息，这些靶分子或靶分子组相对于这种特定种类的亲和力元素具有共同特性或结合位点。
3.交互传感器的重要应用涉及样品中靶分子的结合亲和力的检测或监测，这些样品包含大量且种类繁多的背景分子，这些背景分子可能会干扰靶分子的结合亲和力。在现有技术的交互传感器中，执行传感器表面的洗涤以最小化背景分子在对靶分子的结合亲和力的检测或监测中的干扰。
4.一种用于检测结合亲和力的交互传感器利用附着到靶分子的荧光标记。荧光标记能够在激发时发射荧光。所发射的荧光具有指示在传感器上存在荧光标记的特征发射光谱。荧光标记的存在继而指示所标记的靶分子已经结合到传感器上的亲和元素。
5.在下文中描述了一种用于检测所标记的靶分子的传感器：“zeptosens的蛋白质微阵列：用于低丰度蛋白质分析的新型高性能微阵列平台”，proteomics 2002,2,s.383-393,wiley-vch verlag gmbh,69451weinheim,germany。那里描述的传感器包括布置在基板上的平面波导。平面波导具有在其上具有多个结合位点(亲和元素)的外表面。此外，平面波导具有多个光栅线，用于以使得耦合到平面波导中的相干光沿着波导传播的方式将相干光的光束耦合到平面波导中。相干光在全反射下通过平面波导传播，其中相干光的渐逝场沿着平面波导的外表面传播。渐逝场穿透到平面波导的外表面处的较低折射率介质中的深度在通过平面波导传播的相干光的波长的一部分的数量级。渐逝场激发与布置在平面波导的表面上的结合位点(亲和元素)结合的所标记的靶分子的荧光标记。由于渐逝场穿透平面波导的外表面处光学较薄介质的深度非常小，因此只有与平面波导的外表面上的结合位点(亲和元素)结合的标记靶分子被激发。然后借助ccd相机检测由标记发射的荧光。
6.虽然原则上可能使用荧光标记来检测结合亲和力，但是该技术的缺点在于所检测到的信号是由荧光标记产生的，而不是由结合配偶体本身产生的。另外，标记靶分子需要附加的准备步骤。此外，所标记的靶分子相对昂贵。另一个缺点是由靶分子处的荧光标记的空间位阻引起的结果失真，这可能会干扰靶分子与结合位点(亲和元素)的结合。另外的缺点是由于标记的光漂白或淬灭效应导致的结果失真。
7.另一类型的交互传感器是折射传感器，即基于由与交互传感器上的亲和元素结合
的靶分子引起的折射率(ri)变化生成信号的传感器。折射传感器的品质因数(fom
ri
)是每折射率单位(riu)100-1000的量级，即100-1000/riu。品质因数(fom
ri
)根据以下等式将测量精度(由归一化传感器输出信号的标准偏差σ
rel
表示，例如强度测量)与传感器的折射率分辨率(由折射率分辨率的标准偏差σ
ri
表示)联系起来：
8.σ
ri
＝σ
rel
/fom
ri
9.换句话说，折射传感器的品质因数(fom
ri
)越低，为达到相同的折光率分辨率σ
ri
，归一化传感器输出信号所需的测量精度σ
rel
就越高。用现有技术中的折射交互传感器可实现10-7
riu的数量级的折射率分辨率σ
ri
。
10.因此，在fom
ri
在100-1000/riu范围内的情况下，所需的测量精度σ
rel
在10-5
的量级。如果有的话，只有非常昂贵的科学测量设备才能达到此类测量精度。
11.此外，在已经将靶分子施加到传感器的表面以结合到亲和元素后并且在检测之前，必须对传感器的表面进行大量洗涤，以便洗掉来自传感器的表面的背景分子，这些背景分子尚未结合到传感器的亲和元素。广泛洗涤过程的一个后果是根本无法检测到与传感器的亲和元素仅微弱结合的靶分子，因为即使它们与亲和元素的结合微弱，它们也会在洗涤过程中被洗掉。


技术实现要素：

12.本发明的一个目的是提出一种传感器，该传感器不表现出与折射交互传感器相关联的上述缺点，并且特别地目的是提出一种具有明显更高的品质因数(fom)的交互传感器，使得使用简单且廉价的测量设备可以可靠地检测极少量的靶分子成为可能。此外，传感器应该能够检测样品中的靶分子，这些样品中包含大量且种类繁多的背景分子。此外，传感器应该能够检测仅与传感器的亲和元素微弱结合的靶分子。
13.根据本发明，该目的通过一种全新类型的传感器来实现的，在下文中称为
‘
衍射传感器’。衍射传感器由独立权利要求的特征指定。根据本发明的衍射传感器的有利方面是从属权利要求的主题。
14.根据本发明的衍射传感器包括：
[0015]-基板；
[0016]-布置在该基板上的两个叉指型亲和光栅，第一亲和光栅和第二亲和光栅。
[0017]
第一亲和光栅包括第一晶胞并且第二亲和光栅包括第二晶胞。
[0018]
第一亲和光栅的第一晶胞包括能够与第一类型的靶分子结合的第一类型的亲和元素，并且第二亲和光栅的第二晶胞包括能够与第二类型的靶分子结合的第二类型的亲和元素。
[0019]
第一亲和光栅的第一晶胞被配置和被布置成使得在预先确定的光束生成位置处生成并且由结合到第一类型的亲和元素的第一类型的靶分子衍射的预先确定的波长的相干光在预先确定的检测位置处以第一相位相长地干涉。
[0020]
将第二亲和光栅的第二晶胞被配置和被布置成使得在预先确定的光束生成位置处生成并且由结合到第二类型的亲和元素的第二类型的靶分子衍射的预先确定的波长的相干光在预先确定的检测位置处以与第一相位相反的第二相位相长地干涉。
[0021]
第一亲和光栅和第二亲和光栅相对于该第一亲和光栅和该第二亲和光栅的散射
质量是平衡的，以在预先确定的检测位置处生成偏置信号，该偏置信号对应于第一亲和光栅和第二亲和光栅的散射质量的差(δm)，该散射质量的差在0.001pg/mm2到30000pg/mm2的范围内。
[0022]
亲和光栅是包括亲和元素即能够结合特异性靶分子或特定类型的靶分子的元素的光栅。靶分子的
‘
类型’是指相同
‘
类型’的所有靶分子都具有共同特性或部分(例如结合位点)，其允许这些靶分子与相同亲和元素结合。
[0023]
亲和元素被布置在相应亲和光栅的晶胞中，即第一晶胞包括能够与第一类型的靶分子结合的第一类型的亲和元素，并且第二晶胞包括能够与第二类型的靶分子结合的第二类型的亲和元素。第一类型的亲和元素和第二类型的亲和元素可相同或可不同。在许多应用中，第一类型的亲和元素和第二类型的亲和元素是不同的，并且因此，可结合到第一类型的亲和元素的第一类型的靶分子以及可结合到第二类型的亲和元素的第二类型的靶分子也是不同的。
[0024]
第一亲和光栅的第一晶胞被配置和被布置成使得在预先确定的光束生成位置处生成并且由结合到第一类型的亲和元素的第一类型的靶分子衍射的预先确定的波长的相干光在预先确定的检测位置处以第一相位相长地干涉。术语
‘
预先确定的波长’表示相干光的波长，该波长必须事先已知并且通常是单一波长(意味着相干光是单色的)。术语
‘
预先确定的光束生成位置’表示生成相干光的光束的位置，并且也必须事先已知。当然，在传感器可调谐的(例如在关于光源的确切位置、关于相干光的光束的撞击方向、关于相干光的预先确定的波长或者关于检测器的确切位置在非常小的范围内)的情况下，允许预先确定的光束生成位置改变到一定程度，使得其在传感器的调谐范围内。类似地，术语
‘
预先确定的检测位置’表示由结合到第一类型的亲和元素的第一类型的靶分子衍射的相干光被检测的位置，并且也必须事先已知。同样，在传感器可调谐的情况下，预先确定的检测位置可改变到一定程度，使得其在传感器的调谐范围内。只有在相干光具有预先确定的波长的情况下，该预先确定的波长的相干光的光束才会在预先确定的光束生成位置处生成，并且由结合到第一类型的亲和元素的第一类型的靶分子衍射的相干光在预先确定的检测位置处被检测，所衍射的光在检测位置处以第一相位相长地干涉。
[0025]
第二亲和光栅的第二晶胞被配置和被布置成使得在预先确定的光束生成位置处生成并且由结合到第二类型的亲和元素的第二类型的靶分子衍射的预先确定的波长的相干光在预先确定的检测位置处以与第二位相长地干涉。然而，第二亲和光栅被配置为使得该第二相位与第一相位相反。
[0026]
由于这些相反相位，两个叉指型亲和光栅表示光学比较器，该光学比较器测量两个叉指型光栅(即第一亲和光栅和第二亲和光栅)的衍射效率差。衍射效率差与每单位面积γb散射质量的差的平方(例如pg/mm2，皮克每平方毫米)成正比。
[0027]
散射质量是满足光栅的衍射条件的质量密度分布的空间傅里叶分量的质量密度。不满足衍射条件的质量密度的所有傅里叶分量都不能够被传感器检测到。这允许检测或监测样品中靶分子的结合亲和力，这些样品包含大量且种类繁多的背景分子，这些背景分子可能会以免洗和实时格式干扰靶分子的结合亲和力，即其允许免洗和实时免疫测定。这是因为背景分子的非特异性结合在傅立叶空间的大光谱范围内被稀释，并且因此无法被传感器检测到。
[0028]
根据以下等式，此类衍射传感器的品质因数(fom
diff
)与每单位面积γb的散射质量的差成反比：
[0029]
fom
diff
＝2/γb[0030]
从这个等式可看出，(在执行测量时)每单位面积γb的散射质量的差越小(并且因此衍射效率也越小)，衍射传感器的品质因数(fom
diff
)越高，并且测量设备所需的精度越低。
[0031]
通常，这表明第一亲和光栅和第二亲和光栅的衍射效率差(即每单位面积的散射质量的差)在测量时被选择得尽可能小，理想情况下为零，如us 2015/0276612所建议的。另一方面，即使是布置在预先确定的检测位置的最佳平衡的衍射传感器(即相对于两个叉指型亲和光栅的散射质量完美平衡的衍射传感器)也会生成小的背景信号(斑点)，该背景信号对应于第一亲和光栅与第二亲和光栅之间的一定的散射质量(衍射效率)差。因此，这里的问题是可由衍射传感器可靠检测到的靶分子的最小质量应该尽可能小，同时应该避免由此类最小可检测质量的靶分子生成的信号被解释为斑点(避免假阴性)。另一方面，必须避免斑点被无意地解释为由最小可检测质量的靶分子引起的信号(避免假阳性)。
[0032]
如前所述，衍射传感器的品质因数(fom
diff
)与单位面积的散射质量的差成反比(而折射传感器的品质因数(fom
ri
)与其无关)。或者更直白地说，衍射传感器的品质因数(fom
diff
)与由布置在检测位置的检测器生成的偏置信号成反比，因此选择过高的偏置信号会导致衍射传感器的品质因数(fom
diff
)需要比折射传感器所需的测量精度更高的测量精度。
[0033]
因此，根据本发明的衍射传感器的叉指型第一和第二亲和光栅相对于第一和第二亲和光栅的散射质量的差是平衡的，使得它们在预先确定的检测位置处生成偏置信号，该偏置信号对应于第一和第二亲和光栅的散射质量的差，该散射质量的差在0.001pg/mm2到30000pg/mm2的范围内，这取决于衍射传感器的特定实施例和应用(如下文将更详细地解释的)。
[0034]
仅举一个简单的示例来展示根据本发明的衍射传感器相对于现有技术的折射传感器的优点：
[0035]
已知折射传感器的品质因数fom
ri
可能大约为fom
ri
＝100/riu(riu＝折射率单位)。
[0036]
衍射传感器的品质因数fom
diff
——在使用de feijter公式转换为逆riu之后——可能大约为fom
diff
＝5
·
105/riu。
[0037]
由于测量精度σ
rel
和品质因数(fom)根据σ
ri
＝σ
rel
/fom联系起来(参见上文)，假设要实现σ
ri
＝10-7
的折射率分辨率，折射传感器的所需的测量精度必须为σ
rel
＝σ
ri
·
fom
ri
＝0.00001，即10-5
(或0.001％)。如果有的话，只有极其昂贵的科学测量设备才能达到此类测量精度。用根据本发明的衍射传感器，所需的测量精度为σ
rel
＝σ
ri
·
fom
diff
＝0.05，即，5
·
10-2
(或5％)，这可使用简单且廉价的测量设备轻松实现。这使得衍射传感器极为有利。
[0038]
在根据本发明的衍射传感器的一些实施例中，与第一和第二亲和光栅的散射质量的差对应的偏置信号在0.1pg/mm2到1000pg/mm2的范围内，更具体地在0.1pg/mm2到100pg/mm2的范围内，并且甚至更具体地在1pg/mm2到10pg/mm2的范围内。这些范围表示针对根据本发明的衍射传感器的实际实施例的有利子范围。
[0039]
在根据本发明的衍射传感器的一些实施例中，(叉指型亲和光栅的)第一类型的亲和元素在第一晶胞中的浓度或空间布置和第二类型的亲和元素在第二晶胞中的浓度或空间布置是不同的。
‘
不同浓度’表示相同体积的第一和第二晶胞中的亲和元素的数量不同，而
‘
不同空间布置’旨在涵盖以下情况：第一和第二晶胞中的亲和元素的数量可能是相同的，但是第一和第二晶胞中的亲和元素的空间分布是明显不同的。
[0040]
亲和元素的浓度或空间布置中的这种差异通常与第一晶胞中的第一类型的亲和元素和第二晶胞中的第二类型的亲和元素是否相同还是不同无关。然而，在衍射传感器的一个实施例中，第一晶胞中的第一类型的亲和元素和第二晶胞中的第二类型的亲和元素是相同的。在靶分子结合到这种(相同)类型的亲和元素的情况下，由于第一和第二晶胞中的亲和元素的浓度不同或空间布置不同，不同量(质量)的靶分子被结合到第一晶胞和第二晶胞。
[0041]
例如，第一和第二晶胞中的亲和元素的空间分布可使得第一晶胞中的两个或更多个亲和元素结合到相同的靶分子，而在第二晶胞中，每个亲和元素结合到一个靶分子。作为其结果，与第一晶胞的亲和元素结合的靶分子的总质量小于与第二晶胞的亲和元素结合的靶分子的总质量。另外，当两个亲和元素结合到靶分子时，亲和力高于两个单独亲和元素的相加亲和力，即存在协同结合或亲和力效应。由于与第一晶胞和第二晶胞两者的亲和元素结合的靶分子将相干光衍射到检测位置，然而，在具有相反相位的情况下，在检测位置生成差分信号，该差分信号可被检测和被用于确定靶分子的存在。
[0042]
在根据本发明的衍射传感器的一些实施例中，第一类型的亲和元素对于第二类型的靶分子是非结合的(惰性的)或者第二类型的亲和元素对于第一类型的靶分子是非结合的(惰性的)，或者两者都是(即第一类型的亲和元素对于第二类型的靶分子是非结合的，并且第二类型的亲和元素对于第一类型的靶分子是非结合的)。另外，第一类型的亲和元素和第二类型的亲和元素优选地允许与背景分子(即除靶分子以外的分子)具有相似的、优选地最小的结合能力。
[0043]
实际上，靶分子——虽然优先与一种类型的亲和元素结合——通常也结合到其他类型的亲和元素(但亲和力小得多)。当声明第一类型的亲和元素针对第二类型的靶分子是非结合的时，此类场景被包括在内，反之亦然(因为在这方面不存在完美的亲和元素)。
[0044]
在根据本发明的衍射传感器的一些实施例中，两个叉指型亲和光栅中的至少一个(也就是说两个叉指型光栅中的仅一个或两个叉指型光栅中的两者)进一步包括能够结合散射元素的结合位点。能够结合散射元素的此类结合位点可被布置在基板中或其上，但特别地它们可被布置在晶胞中。能够结合散射元素的此类结合位点基本上不增加偏置信号，然而，它们允许添加散射元素，其可结合到能够结合散射元素的这些结合位点。添加散射元素可在测定之前或期间进行。
[0045]
在根据本发明的衍射传感器的一些进一步的实施例中，两个叉指型亲和光栅中的至少一个(也就是说两个叉指型光栅中的仅一个或两个叉指型光栅中的两者)进一步包括散射元素。与能够结合散射元素的结合位点一样，散射元素通常可被布置在基板中或其上，但特别地它们可被布置在晶胞中。在一些实施例中(包括能够结合散射元素的结合位点的那些实施例)，散射元素被结合到能够结合散射元素的结合位点。在其他实施例中(不包括能够结合散射元素的结合位点)，散射元素可被布置在基板中或其上或者在晶胞中。术语
‘
散射元素’应理解为表示改变亲和光栅的晶胞的散射功率或散射强度的元素(靶分子除外)。
[0046]
在根据本发明的衍射传感器的一些实施例中，散射元素是可调谐的或可裂解的，以允许调整散射功率/强度或移除散射元素。
‘
可调谐’意味着可改变散射元素的散射功率/强度。例如，在散射元素由电光材料制成的情况下，可通过施加外部电场来改变散射元素的散射功率/强度。
‘
可裂解’意味着散射元素可以是可移除的。散射功率/强度的此类变化(或者甚至散射元素的裂解/移除)可有助于调整偏置信号。
[0047]
在根据本发明的衍射传感器的一些实施例中，两个叉指型亲和光栅被布置在基板的表面上。通常，在此类实施例中，预先确定的光束生成位置和预先确定的检测位置可被布置在基板的相同侧(例如，预先确定的光束生成和预先确定的检测位置两者都被布置在基板上方或下方)或被布置在基板的不同侧(例如，一个位于基板上方，而另一个位于基板下方)。根据另一方面，此类衍射传感器可进一步包括光学耦合器，该光学耦合器被配置和被布置成将来自预先确定的光束生成位置的相干光引导到布置在基板的表面上的两个叉指型亲和光栅。并且根据又一方面，此类衍射传感器可进一步包括光学解耦器，该光学解耦器被配置和被布置成将由两个叉指型亲和光栅衍射的相干光引导到预先确定的检测位置。
[0048]
在其他实施例中，根据本发明的衍射传感器可进一步包括布置在基板的表面上的谐振波导结构。谐振结构被配置为允许将在预先确定的光束生成位置处生成的预先确定的波长的相干光耦合到谐振波导结构中，以生成沿着谐振波导结构的与谐振波导结构的面向基板的表面相对的最外表面传播的渐逝场。两个叉指型亲和光栅被布置在谐振波导结构的最外表面。
[0049]
在一个实施例中，此类谐振波导结构包括多层谐振结构，该多层谐振结构包括具有不同折射率的材料的电介质层的堆叠，一个层交替地布置在另一个之上(即，较高折射率的层、较低折射率的层、较高折射率的层、较低折射率的层等)，其允许在与面向基板的表面相对的最外表面生成布洛赫表面波。例如，在此类电介质层的垂直堆叠布置中，预先确定的波长的相干光可被耦合到最下层中，其然后将被耦合到布置在最下层正上方的相邻层中，依此类推，直到到达最上层。耦合到所述最上层的相干光在该最上层内传播，其中渐逝场沿着该最上层的最上表面传播。然后将两个叉指型亲和光栅布置在该最上表面上。
[0050]
在根据本发明的衍射传感器的其他实施例中，布置在基板的表面上的谐振波导结构可以是(单)平面波导，并且两个叉指型亲和光栅被布置在平面波导的与平面波导的面向基板的表面相对的表面上。同样在这里，耦合到平面波导中的相干光沿着平面波导传播，其中其渐逝场沿着平面波导的表面传播，该表面与平面波导的面向基板的表面相对。在平面波导的与面向基板的表面相对的该表面上，布置有两个叉指型亲和光栅。
[0051]
在根据本发明的衍射传感器的一些进一步的实施例中，平面波导被构造成引导预先确定的波长的相干光，该相干光在光束生成位置处生成并且在沿着平面波导的与面向基板的表面相对的表面的一个或多个预先确定的方向上耦合到平面波导中。此类结构化的波导允许在几乎任何所需方向上引导相干光，因此这种配置可能有利于形成所谓的光子集成电路(pic)。
[0052]
在根据本发明的衍射传感器的又一进一步的实施例中，传感器可进一步包括光学耦合器(例如耦合光栅)，该光学耦合器被布置在平面波导上并且被配置为将在光束生成位
置处生成的相干光的光束耦合到平面波导中以撞击在两个叉指型亲和光栅上。并且在根据本发明的衍射传感器的更进一步的实施例中，传感器可进一步包括光学解耦器(例如解耦光栅)，该光学解耦器被布置在平面波导上并且被配置为从平面波导解耦由两个叉指型亲和光栅衍射的相干光并将其引导到预先确定的检测位置。
[0053]
在根据本发明的衍射传感器的一些进一步的实施例中，传感器可进一步包括检测器，该检测器用于检测由两个叉指型亲和光栅衍射的相干光，其中该检测器被集成在平面波导中或基板中。在此类实施例中，检测器已经被布置在预先确定的检测位置处，使得传感器必须仅相对于光束生成位置正确定位，不再需要检测器相对于两个叉指型亲和光栅的任何定位。并且在根据本发明的衍射传感器的又一些进一步的实施例中，传感器可进一步包括用于生成预先确定的波长的相干光的光束的光源，其中该光源被集成在平面波导中或基板中。在此类实施例中，光源已经被布置在光束生成位置处，使得不再需要光源相对于两个叉指型亲和光栅的任何定位。在传感器包括集成在平面波导中或基板中的光源和检测器两者的情况下，不再需要光源相对于两个叉指型光栅的定位或检测器相对于该两个叉指型光栅的定位。相反，这些部件已经被集成到传感器中并且被布置在适当的位置处。
[0054]
在根据本发明的衍射传感器的其他实施例中，布置在基板的表面的谐振波导结构包括金属层，并且两个叉指型亲和光栅被布置在该金属层的与该金属层的面向基板的表面相对的表面上。例如，布置在基板的表面上的谐振波导结构可以是单金属层，这允许在金属层的与金属层的面向基板的表面相对的表面处生成传播表面等离子体。这里，耦合到金属层中的相干光沿着金属层传播(即，其耦合到传播表面等离子体中)，其中其渐逝场沿着金属层的与金属层的面向基板的表面相对的表面传播。在金属层的与金属层的面向基板的表面相对的该表面上，布置有两个叉指型亲和光栅。
[0055]
在根据本发明的衍射传感器的又一些进一步的实施例中，包含在第一光栅的第一晶胞中的第一类型的亲和元素和包含在第二光栅的第二晶胞中的第二类型的亲和元素是使用生物正交偶合化学获得的。使用生物正交耦合化学来获得第一类型的亲和元素(包含在第一光栅的晶胞中)和第二类型的亲和元素(包含在第二光栅的晶胞中)允许一种类型的亲和元素——第一类型或第二类型——与作为靶分子的生物分子结合，而相应的其他类型的亲和元素——第二类型或第一类型——不能与作为靶分子的生物分子结合。
附图说明
[0056]
进一步的有利方面和实施例在示意图的帮助下从本发明的方面和实施例的以下描述中变得显而易见，其中：
[0057]
图1示出了根据本发明的衍射传感器的实施例，其中两个叉指型亲和光栅被布置在基板的表面上；
[0058]
图2示出了根据本发明的衍射传感器的实施例，其中平面波导被布置在基板的表面上，并且其中两个叉指型亲和光栅被布置在平面波导的表面上，该表面与平面波导的面向基板的该表面相对；
[0059]
图3示出了根据本发明的衍射传感器的实施例，其中平面波导被布置在基板上并且其中光学耦合器或光学解耦器或两者被布置在平面波导上；
[0060]
图4示出了根据本发明的衍射传感器的两个叉指型亲和光栅的第一和第二晶胞的
一维、二维和三维实施例；
[0061]
图5示出了两个叉指型亲和光栅的第一和第二晶胞的实施例，其中具有相同或不同的亲和元素，并且具有或不具有散射元素；
[0062]
图6示出了两个叉指型亲和光栅的第一和第二晶胞的实施例，其中具有针对散射元素的结合位点(并且具有或不具有与这些结合位点结合的此类散射元素)；
[0063]
图7示出了第一和第二晶胞的进一步的实施例，其中具有组合的亲和元素/散射元素以及具有分离的亲和元素和散射元素；
[0064]
图8示出了在测定期间的不同时间的第一和第二晶胞以及随时间的相应散射质量的差的进一步的实施例；
[0065]
图9示出了在测定期间的不同时间的第一和第二晶胞连同在测定期间的强度随时间的相应变化的进一步的实施例；
[0066]
图10示出了在测定期间的不同时间用于检测一组靶标中的特定靶标的第一和第二晶胞连同随时间的相应散射质量的差的进一步实施例，该特定靶标可与该第一和第二晶胞中的一者的亲和元素结合；
[0067]
图11示出了在测定期间的不同时间用于检测与亲和元素结合的特定量的靶标的第一和第二晶胞连同随时间的相应强度以及连同随时间的相应质量差的进一步实施例；
[0068]
图12示出了根据本发明的包括多个衍射传感器的阵列，并且
[0069]
图13示出了表示两个叉指型亲和光栅的散射质量的差的信号，以展示使用生物正交耦合化学将亲和元素固定在第一和第二晶胞中期间的反应动力学。
具体实施方式
[0070]
在图1中，示出了根据本发明的衍射传感器1的实施例。在图1所示的实施例中，两个叉指型亲和光栅2(由参考符号2统一指代，但包括第一亲和光栅20和第二亲和光栅21，见图4)被布置在基板3的表面上。在图1的左手侧示出了一个实施例，其中能够生成预先确定的波长的相干光的光束的光源4(单色光源)被布置在衍射传感器1下方的预先确定的光束生成位置40处，其中光束成形孔口41被布置在从光源4朝向衍射传感器1的相干光的光束的光学路径中。光学耦合器10被布置在基板3的下表面上，用于将相干光的光束耦合到基板3中并且引导相干光的光束撞击在叉指型亲和光栅2上。探测器5被布置在基板3上方的预先确定的检测位置50处，其中光束成形孔口51被布置在由两个叉指型亲和光栅2衍射的光束的光学路径中。不用说，由于相干光的光学路径是可逆的，光源4和检测器5的位置可互换，这由相干光的光束的相应部分中的两个箭头展示。还值得注意的是，预先确定的光束生成位置40(即布置光源4的位置)和预先确定的检测位置50(即布置检测器5的位置)以及由光源4生成的相干光的光束的波长必须是已知的(参见上面关于传感器的可能调谐范围的说明)，因为两个叉指型亲和光栅2被配置为使得仅对于预先确定的光束生成位置40、预先确定的检测位置50和光源4的预先确定的波长的这种特定组合，衍射传感器1可以下将进一步解释的方式操作。
[0071]
图1右手侧所示的衍射传感器1的实施例与图1左手侧所示的实施例非常相似。此处的差异是光源4和检测器5两者都被布置在基板3的下方，并且光学耦合器10同时既作为耦合器(针对来自光源4的相干光的光束)又作为解耦器(针对来自两个叉指型亲和光栅2的
衍射光的光束)。
[0072]
乍一看，图1所示的衍射传感器1的实施例似乎是众所周知的，然而，两个叉指型亲和光栅2(将进行更详细地解释的)使本发明的衍射传感器1变得比现有技术传感器更特别和优越。
[0073]
在图2中示出了根据本发明的衍射传感器1的实施例，其中平面波导6被布置在基板3的表面上，并且其中两个叉指型亲和光栅2被布置在平面波导6的表面上，该表面与平面波导6的面向基板3的该表面相对。另外，在图2左手侧所示的实施例中，光源4、孔口41、检测器5和孔口51被集成在衍射传感器1中，因为它们要么被布置在平面波导6中，要么被布置在基板3中。因此，图1左手侧所示的实施例表示完整的光子集成电路。在图2右手侧所示的实施例中，光源4和孔口41没有被集成在衍射传感器1中，而是在衍射传感器1的外部，而检测器5和孔口51被集到在该传感器中。另选地，在图2右手侧所示的实施例中，光源4和孔口41可被集成到传感器1中，而检测器5和孔口51可被布置在传感器1的外部。
[0074]
在图3中示出了根据本发明的衍射传感器1的实施例，其中平面波导6再次被布置在基板3上。左手侧所示的衍射传感器1的实施例与图2右手侧所示的实施例非常相似，然而，另外，光学耦合器10被布置在平面波导6的表面上，并且因此形成衍射传感器1的组成部分。光学耦合器10以使得来自光源的相干光在平面波导6中传播以撞击在两个叉指型亲和光栅2上的方式将该相干光耦合到平面波导6中。由这两个叉指型亲和光栅2衍射的相干光撞击(通过孔口51)到检测器5上，该检测器被集成在传感器1中并且被布置在平面波导6中或基板3中。同样，应当指出，还可想到，不是光源4在外部并且检测器5被集成在传感器1中，而是光源4可形成传感器1的组成部分，同时检测器5可被布置在传感器1的外部。
[0075]
图3右手侧所示的衍射传感器1的实施例与左手侧所示的实施例的不同之处在于光源4(和相关联的孔口41)以及检测器5(和相关联的孔口51)两者在衍射传感器1的外部(即它们都没有被集成在传感器1中)。然而，光学耦合器10以及光学解耦器11被布置在平面波导6上，用于将来自光源4的相干光(通过孔口41)耦合到平面波导6中并且引导其撞击在两个叉指型亲和光栅2上，并且用于将由两个叉指型亲和光栅2衍射的光从平面波导6中解耦并且引导其(通过孔口51)撞击在检测器5上。因此，在图3右手侧所示的衍射传感器1的实施例中，光学耦合器10和光学解耦器11被集成在衍射传感器1中。
[0076]
在图1至图3的帮助下，已经描述了可如何从更一般的构造观点来看衍射传感器1的实施例。在下文中，解释了两个叉指型亲和光栅2可如何体现以及如何工作。
[0077]
通常，两个叉指型光栅2可体现为一维叉指型亲和光栅、二维叉指型亲和光栅或三维叉指型光栅。从图4中可看出，两个叉指型亲和光栅2(图1至图3中统称)，无论是一维、二维还是三维，通常都包括第一亲和光栅20和第二亲和光栅21。第一亲和光栅20包括第一晶胞200，并且第二亲和光栅21包括第二晶胞210。第一晶胞200和第二晶胞210中的每一者都包括亲和元素(将在下面更详细地讨论)。第一晶胞200包括第一类型的亲和元素，并且第二晶胞210包括第二类型的亲和元素。虽然通常第一类型的亲和元素和第二类型的亲和元素可以是相同的，但是优选地第一类型的亲和元素和第二类型的亲和元素是不同的。通常，第一晶胞200和第二晶胞210(至少在相干光的传播方向上)的尺寸小于相干光的预先确定的波长。相干光的传播方向由图4中的箭头p指示。
[0078]
在图4所示的最上面的实施例中，第一晶胞200(由点虚线界定)和第二晶胞210(由
短横线虚线界定)是包括第一晶胞200的一维第一亲和光栅20的那些晶胞以及包括第二晶胞210的第二一维亲和光栅21的那些晶胞，其中传播方向由箭头p指示。此类一维亲和光栅20、21可体现为相干光传播通过的交替布置的第一晶胞200和第二晶胞210的丝状结构。由于这种丝状结构，一维亲和光栅不需要按图4中所示的直线配置进行几何布置，而是可按各种其他几何布置进行布置，使得传播通过这些晶胞的相干光可被引导到任何期望的方向，例如在光子集成电路中就是这种情况。
[0079]
由与亲和元素结合的靶分子或由包含在第一晶胞200和第二晶胞210中的散射元素衍射的预先确定的波长的相干光被衍射到相同的预先确定的检测位置50，其中布置了检测器5(参见图1至图3)，不论第一亲和光栅20(包括晶胞200)与第二亲和光栅21(包括晶胞210)被体现为一维、二维或三维亲和光栅。
[0080]
在图4左手侧所示的下部实施例中，第一晶胞200是二维第一亲和光栅20的晶胞，并且第二晶胞210是二维第二亲和光栅21的晶胞。相干光的传播方向再次由箭头p展示。
[0081]
最后，在图4右手侧所示的下部实施例中，第一晶胞200是三维第一亲和光栅20的晶胞，晶胞210是三维第二亲和光栅21的晶胞。在该实施例中，当光源4被布置在预先确定的光束生成位置40并且检测器5被布置在预先确定的检测位置50处时，第一亲和光栅20(包括第一晶胞200)和第二亲和光栅21(包括第二晶胞210)中的每一者必须满足布拉格条件。
[0082]
无论是一维、二维还是三维，由结合到由第一晶胞200包括的第一类型的亲和元素的靶分子(或由布置在第一晶胞200中的任何散射元素)衍射的相干光被衍射到预先确定的检测位置50，其中检测器5被布置成在该预先确定的检测位置50处以第一相位相长地干涉。由结合到由第二晶胞210包括的第二类型的亲和元素的靶分子(或由布置在第二晶胞210中的任何散射元素)衍射的相干光也被衍射到预先确定的检测位置50，其中检测器5被布置成在该预先确定的检测位置50处以第二相位相长地干涉。然而，该第二相位与第一相位相反，使得具有第一相位的衍射光和具有第二相位的衍射光在布置有检测器5的预先确定的检测位置50处干涉。或者换句话说，两个叉指型光栅20和21形成了光学比较器。
[0083]
现在参考图5，讨论了如何体现两个叉指型亲和光栅，即第一亲和光栅20和第二亲和光栅21的第一晶胞200和第二晶胞210的实施例。为了简化起见，图5和后续附图中仅示出第一亲和光栅20的一个第一晶胞200和第二亲和光栅21的一个相邻布置的第二晶胞210。同样，第一亲和光栅20的第一晶胞200由点虚线界定，而第二亲和光栅21的第二晶胞210由短横线虚线界定。
[0084]
从图5所示的最上面的实施例中可看出，第一类型的亲和元素201(由在
‘
y’的两个上臂相交的位置处部分地填充的y形指示)被布置在第一晶胞200中，并且不同的第二类型的亲和元素211(由y形指示，未填充)被布置在第二晶胞210中。第一类型的靶分子可只结合到第一类型的亲和元素201，而第二类型的靶分子(不同于第一类型的靶分子)可只结合第二类型的亲和元素211。可将待分析的样品施加到第一晶胞200和第二晶胞210，以便检测样品中是否包含第一类型的靶分子或第二类型的靶分子。在样品中包含第一类型的靶分子(并且因此与第一类型的亲和元素201结合，从而改变第一晶胞200的散射质量)的情况下，在具有第一相位的检测位置处生成信号。在待分析的样品中包含第二类型的靶分子(并且因此与第二类型的亲和元素211结合，从而改变第二晶胞210的散射质量)的情况下，在具有第二相位(与第一相位相反)的检测位置处生成信号。下面结合具体实施例对如何检测样品
中是否包含第一类型的靶分子或第二类型的靶分子的方式进行进一步描述。
[0085]
在图5顶部的第二实施例中，然而，相同类型的亲和元素201被布置在具有不同的浓度的第一晶胞200和第二晶胞210中(这由布置在第一晶胞200中的第一类型的两个亲和元素201指示，而仅一个单个第一类型的亲和元素201被布置在第二晶胞210中)。结果，如果第一类型的靶分子被包含在待分析的样品中，则第一类型靶分子中的两个靶分子结合到包含在第一晶胞200中的两个第一类型的亲和元素201，而第一类型的靶分子(相同类型)中的仅一个靶分子结合到包含在第二晶胞210中的第一类型的(单个)亲和元素201。因此，第一晶胞200的散射质量中的变化大于第二晶胞210的散射质量的变化，因此在检测位置处生成对应的差分信号。虽然图中未显示，但是用相同类型的亲和元素(例如第一类型的亲和元素201)在第一晶胞200和第二晶胞210中的不同空间布置可实现相同的结果。也就是说，虽然相同量的第一类型的亲和元素201可包含在第一晶胞和第二晶胞中，但是第一晶胞200和第二晶胞中的第一类型的亲和元素201的空间布置可显著改变：在第一晶胞200中，多个亲和元素201被布置成使得它们可仅结合到一个第一类型的靶分子，而在第二晶胞中，每个亲和元素201结合到一个第一类型的靶分子，使得最后不同总数的第一类型的靶分子被结合到包含在第一晶胞200和第二晶胞210中的亲和元素201。
[0086]
在图5顶部的第三实施例中，展示了第一类型的亲和元素201可存在于第一晶胞200中，而第二类型的亲和元素211可存在于第二晶胞210中。另外，不同浓度的亲和元素和/或不同空间布置的亲和元素可存在于第一晶胞200和第二晶胞210中。
[0087]
在从图5底部的第三实施例中，展示了可在晶胞中的一个晶胞中提供散射元素(除了靶分子以外)。在该实施例中，第二类型的散射元素212(由填充的方块表示)被布置在第二晶胞210中。在图5所示的第二个最下面的实施例中，第一类型的散射元素202被布置在第一晶胞200中(由填充的圆表示)，而第二类型的散射元素212被布置在第二晶胞210中。在图5所示的最下面的实施例中，展示了只有一种类型的散射元素，这里是第一类型的散射元素202，可布置在第一晶胞200以及第二晶胞210中，然而，浓度不同。
[0088]
在图5所示的实施例中，第一类型的散射元素202和第二类型的散射元素212被布置在晶胞中且不可移除(例如，它们可固定在晶胞中)。晶胞中的散射元素的布置可以是在检测位置处提供特定水平的偏置信号的一种方式(其对应于散射质量的差，见上文)。
[0089]
现在参考图6，在图6所示的最上面的实施例中，能够结合第一类型的散射元素202的结合位点(由半圆形的杯状元素表示)可布置在第一晶胞200和第二晶胞210中的一者中。在所示的实施例中，第一类型的结合位点203被布置在第一晶胞200中。此类结合位点203实际上不改变检测器处的偏置信号，但是允许第一类型的散射元素202被添加到第一晶胞200并被结合到第一类型的结合位点203(如中所示如图6所示的第二个最下面的实施例)，并且还允许散射元素202通过从结合位点203裂解而从第一晶胞201移除，如果这变得合乎需要的话。在图6顶部的第二实施例中，能够结合第一类型的散射元素202的第一类结合位点203布置在第一晶胞200中，并且第二类结合位点213(表示为由具有开口顶部的方形形状的杯状元素)能够结合第二类型的散射元素212布置在第二晶胞210中。这允许将第一类型的散射元素202和第二类型的散射元素212添加到第一晶胞200和第二晶胞210，使得它们结合到对应的第一类结合位点203和第二类结合位点213(如图6最下面的实施例所示)。此外，这允许稍后通过从结合位点裂解来从晶胞中移除散射元素(例如在测定期间)。
[0090]
现在参考图7，示出了一个实施例，其中组合的亲和元素/散射元素215(由具有附着的y形亲和元素的填充的五边形表示)被布置在第二晶胞210中，而在第一晶胞200中，布置有分离的亲和元素201和散射元素202。分离的散射元素202被布置在第一晶胞200中以补偿布置在第二晶胞210中的组合的亲和元素/散射元素214的散射质量，以便将由传感器生成的偏置保持在期望的范围内。
[0091]
参考图8顶部所示的实施例，示出了第一晶胞200和第二晶胞210在测定过程中的状态，以及示出在测定过程中散射质量的差δm(纵坐标)随时间t(横坐标)的对应图示。
[0092]
第一晶胞200包含第一类型的亲和元素201以及能够结合到第一类型的散射元素202的第一类型的结合位点203。如前所述，结合位点203实际上不在检测器处生成任何偏置信号。第二晶胞210包含第二类型的亲和元素211。在该测定中，已知第二类型的靶分子214被包含在待分析的样品中并将结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211，并且将结合到亲和元素211的靶分子214的量(散射质量)也是已知的。
[0093]
在时间段t0期间，示出了第一晶胞200和第二晶胞210的初始状态。在示出散射质量的差随时间(δm随t)变化的图示中，这由散射质量的差δm表示，该散射质量的差实际上为零，使得此在检测器5处生成偏置，该偏置对应于非常小的散射质量的差。如上文已经进一步解释的，通常偏置可对应于第一亲和光栅20和第二亲和光栅21的散射质量的差，该散射质量的差在0.001pg/mm2到30000pg/mm2的范围内(包括第一亲和光栅的所有晶胞200和第二亲和光栅21的所有晶胞210)，并且对于许多实际实施例，偏置可对应于散射质量的差，该散射质量的差在0.1pg/mm2到1000pg/mm2范围内，更具体地在0.1pg/mm2到100pg/mm2的范围内，并且甚至更具体地在1pg/mm2到10pg/mm2的范围内。与上述实施例一样，在下文中将仅关注一个第一晶胞200和一个第二晶胞210。
[0094]
在时间段t1期间，将第二类型的靶分子214(由具有向下指向的尖端的填充的三角形表示)施加到传感器1，并且特别地施加到传感器1的两个叉指型亲和光栅2(见图1至图3)，即施加到包括第一晶胞200的第一亲和光栅20和包括第二晶胞210的第二亲和光栅21。由于只有第二类型的亲和元素211(y型，未填充)能够与第二类型的靶分子214结合(在这方面，参考上述关于亲和元素仅结合一种类型的靶分子的能力的说明)，靶分子214仅结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211，但不结合到包含在第一晶胞中200的第一类型的亲和元素201。第二类型的靶分子214与包含在第二晶胞210中的亲和元素211的这种结合导致散射质量的差δm的增加，如图中所示。
[0095]
在时间段t1结束时(或者另选地动态地在测定期间)，添加第一类型的散射元素202(填充的圆圈)，其结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的结合位点203。添加的散射元素202的量(散射质量)是精确已知的。因此，在添加散射元素202之后，散射质量的差δm(并且因此偏置)在时间段t2中再次变小。然后可测量检测器处的表示散射质量的差δm的信号，并且由于散射元素202的添加量(散射质量)是精确已知的，因此可能使用廉价的测量设备确定实际上已经非常准确地结合到第二类型的亲和元素211的第二类型的靶分子214的准确量(散射质量)。对于本领域技术人员显而易见的是，相同的功能也可通过在晶胞200或晶胞210中具有可调谐的散射元素而不是在晶胞200中具有结合位点203来实现。
[0096]
现在参考图8底部所示的实施例，再次示出了在另一测定期间第一晶胞200和第二晶胞210的状态，以及示出在测定过程中散射质量的差δm(纵坐标)随时间t(横坐标)的图
示。
[0097]
晶胞200再次包括第一类型的亲和元素201，然而，在该实施例中，第一晶胞200另外包括已知量(散射质量)的散射元素202，其可固定在第一晶胞200中。第二晶胞210再次包含第二类型的亲和元素211。在该测定中，再次已知第二类型的靶分子214将结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211，并且将结合到这些亲和元素211的靶分子的量(散射质量)也是已知的。
[0098]
在时间t0处，由于第一晶胞200中存在散射元素202，散射质量的差δm较大，因为第二类型的靶分子214尚未被施加到传感器1。一旦第二类型的靶分子214被施加到传感器，它们结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211，使得散射质量的差δm减小直到散射质量的差δm再次小为止。然后可测量检测器处的表示散射质量的差δm的信号，并且由于固定在第一晶胞200中的散射元素202的量(散射质量)是精确已知的，因此可能使用廉价的测量设备确定实际上已经非常准确地结合到第二类型的亲和元素211的第二类型的靶分子214的准确量(散射质量)。
[0099]
从图8所示的实施例中可看出，图8顶部所示的实施例中的散射质量的差δm首先具有正号(因为在通过将散射元素202添加到第一晶胞200来执行散射质量补偿之前，靶分子214结合到第二晶胞210的亲和元素211)。在图8底部所示的实施例中，散射质量的差首先具有负号(由于在由结合到第二晶胞210的亲和元素211的靶分子214执行的散射质量补偿之前，该散射质量在第一晶胞200中更大)。就衍射到布置检测器5的预先确定的检测位置50的相干光而言，这意味着在图8顶部所示的实施例中，由结合到第二晶胞的亲和元素211的靶分子214衍射的相干光在检测位置处相长地干涉并且具有第二相位(在通过将散射元素202添加到第一晶胞200开始散射质量补偿之前)。与之相对，在图8底部所示的实施例中，由第一晶胞200的散射元素202衍射的相干光在检测位置50处相长地干涉，在该检测位置处检测器5被布置成具有与第二相位相反的第一相位(在通过将靶分子214施加到传感器并且允许它们结合到第二晶胞210的亲和元素211开始散射质量补偿之前)。
[0100]
参考图9顶部所示的实施例，第一晶胞200和第二晶胞210的状态被示出为在开始测定之前处于初始状态，其中不知道包含在待分析样品中的靶分子是结合到包含在第一晶胞200的第一类型的亲和元素201还是结合到包含在第二晶胞210的第二类型的亲和元素211。在此，通过监测在预先确定的检测位置50处检测到的强度i的变化，可能检测靶分子是结合到第一晶胞200还是结合到第二晶胞210，在该预先确定的检测位置处，检测器5布置在不同的时间点t1和t2。为此，在第一晶胞200中，布置了第一类型的亲和元素201以及多个结合位点203，已知量(散射质量)的散射元素202已结合到这些结合位点，这些结合位点可从结合位点203处裂解。现在将靶分子添加到传感器中，并且应当确定这些靶分子是结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201还是结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211。
[0101]
沿着图9顶部所示实施例的左手侧上的分支，待分析样品中包含的靶分子是第一类型的靶分子204(具有向下指向的截短尖端的三角形)并且结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201。这导致在时间t1在检测器处测量到第一强度i，如左手侧上的分支下方的图示(强度i-纵坐标；时间t-横坐标)所示。检测器处的信号的第一强度i是由第一晶胞200(散射元素202的散射质量加上结合到亲和元素201的第一类型的靶分子204的散
射质量)和第二晶胞210的散射质量的差引起的。
[0102]
接下来，散射元素202从第一晶胞200中裂解并移除。这导致散射质量的差减小，并且因此导致在时间t2处在检测器处测量的强度i降低。从强度i的这种变化(降低)可检测到包含在样品中的靶分子必须是已经结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201的第一类型的靶分子204。
[0103]
沿着图9顶部的实施例的右手侧上的分支，待分析样品中包含的靶分子是第二类型的靶分子214(具有向下指向的尖端的三角形)并且结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211。这导致在时间t1在检测器处测量到第一强度i，如右手侧上的分支下方的图示(强度i-纵坐标；时间t-横坐标)所示。检测器处的信号的第一强度i是由第一晶胞200(散射元素202)和第二晶胞210(结合到亲和元素211的靶分子214的散射质量)的散射质量的差引起的。
[0104]
接下来，散射元素202从第一晶胞200中裂解并移除。这导致第一晶胞200与第二晶胞210之间的散射质量的差增加，并且因此导致在时间t2处在检测器处测量的强度i增加。从强度i的这种变化(增加)可检测到包含在样品中的靶分子必须是已经结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211的第二类型的靶分子214。
[0105]
参考图9底部所示的实施例，第一晶胞200和第二晶胞210示出为在开始测定之前处于初始状态，其中不知道包含在待分析样品中的靶分子是结合到包含在第一晶胞200的第一类型的亲和元素201还是结合到包含在第二晶胞210的第二类型的亲和元素211。通过监测在预先确定的检测位置50处检测到的强度i的变化，可检测靶分子是结合到第一晶胞200还是结合到第二晶胞210，在该预先确定的检测位置处，检测器5布置在不同的时间点t1和t2。然而，与图9顶部所示的实施例相比，第一晶胞200中没有布置散射元素202，第一晶胞200中仅布置能够结合此类散射元素202的结合位点203。现在将样品的靶分子添加到传感器中，并且应当确定这些靶分子是结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201还是结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211。
[0106]
沿着图9底部的实施例的左手侧上的分支，待分析样品中包含的靶分子再次是第一类型的靶分子204(具有向下指向的截短尖端的三角形)并且结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201。这导致在时间t1在检测器处测量到第一强度i，如左手侧上的分支下方的图示(强度i-纵坐标；时间t-横坐标)所示。检测器处的信号的第一强度i是由第一晶胞200(结合到亲和元素201的第一类型的靶分子204的散射质量)和第二晶胞210的散射质量的差引起的。
[0107]
接下来，将散射元素202添加到第一晶胞200。这导致第一晶胞200和第二晶胞210的散射质量的差增加，并且因此导致在时间t2处在检测器处测量的强度i增加。从强度i的这种变化(增加)可检测到包含在样品中的靶分子必须是已经结合到包含在第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201的第一类型的靶分子204。
[0108]
沿着图9底部的实施例的右手侧上的分支，待分析样品中包含的靶分子是第二类型的靶分子214(具有向下指向的尖端的三角形)并且结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211。这导致在时间t1在检测器处测量到第一强度i，如右手侧上的分支下方的图示(强度i-纵坐标；时间t-横坐标)所示。检测器处的信号的第一强度i是由第一晶胞200和第二晶胞210(结合到亲和元素211的靶分子214的散射质量)的散射质量的差引起的。
[0109]
接下来，将散射元素202添加到第一晶胞200。这导致第一晶胞200和第二晶胞210的散射质量的差减小，并且因此导致在时间t2处在检测器处测量的强度i降低。从强度i的这种变化(降低)可检测到包含在样品中的靶分子必须是已经结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211的第二类型的靶分子214。
[0110]
参考图10所示的实施例，示出了一种测定，其中最初第一晶胞200包括第一类型的亲和元素201以及能够结合散射元素202的结合位点203(然而，还没有散射元素202结合到结合位点203)。第二晶胞210最初仅包括第二类型的亲和元素211(还没有结合靶分子，该初始状态在图10中未显示)。在时间段t0，包含第二类型的靶分子214(尖端向下指向的三角形)的样品被施加到传感器，并且第二类型的靶分子214结合到第二类型的亲和元素211。这导致第一晶胞200和第二晶胞210的散射质量的差δm增加，如从右手侧的图示可看出，该图示示出了质量差δm随时间t(δm
–
纵坐标；t-横坐标)。在时间段t0结束时，散射元素202被添加并结合到第一晶胞200中的结合位点203。由于这种散射质量补偿，在时间段t1期间，散射质量的差δm再次变小，如从右手侧的图示可看出。在第二类型的亲和元素211能够结合某种类型的靶分子214(例如，一组不同的靶分子214具有共同的结合位点或部分，以便该组的所有靶分子214可结合第二类型的亲和元素211)的情况下，可能有必要识别这种类型(或组)的特异性靶分子。例如，在时间段t1结束时，可添加特定类型的检测抗体216，其能够仅结合到第二类型(或组)的靶分子214中的一个特异性靶分子。因此，可能从一种类型(或一组)的靶分子214中识别出特异性靶分子，这些特异性靶分子都可结合到第二类型的亲和元素211。当特定类型的检测抗体216结合到靶分子214时，散射质量的差δm在时间段t2期间再次增加，如从右手侧上的图表可看出。这种传感器能够检测样品中的靶分子，该样品包含大量且种类繁多的免洗格式的背景分子。
[0111]
参考图11中所示的实施例，示出了一种测定，其中选择的偏置允许增加测量的动态范围，同时保持测量所需的低精度(以便可使用简单且廉价的测量设备执行测量)。为此，在时间段t0的初始状态下，第一晶胞200包括第一类型的亲和元素201以及布置在第一晶胞200中的散射元素202(例如，散射元素202被固定在第一晶胞200中)。在该时间段t0期间，第二晶胞210仅包括第二类型的亲和元素211，但是没有靶分子与其结合。
[0112]
图11右手侧上所示的两个图示示出了散射质量的差δm随时间t(最右边：散射质量的差δm
–
纵坐标；时间t
–
横坐标)和强度i随时间t(第二最右边：强度i
–
纵坐标；时间t
–
横坐标)。在时间段t0期间，散射质量的差δm为正(由于包含在第一晶胞200中的散射元素202，第一晶胞200的散射质量大于第二晶胞210的散射质量)。
[0113]
在时间段t0结束时，将包含第二类型的靶分子214的样品施加到传感器，并且该第二类型的靶分子214开始结合到包含在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211。
[0114]
看一下图中示出散射质量的差δm随时间t的过程的曲线，可看出——例如——散射质量的差δm线性减小，并且在时间段t1期间的某个时间之后(例如，当靶分子214中的三个靶分子已经结合到包含在第二晶胞210中的三个亲和元素211时)，散射质量的差δm为零(曲线与横坐标相交)。在检测器5所在的预先确定的检测位置50处，由第一晶胞200(表示第一亲和光栅20)和第二晶胞210(表示第二亲和光栅21)衍射的相干光的幅值直接是与第一晶胞200(表示第一亲和光栅20)和第二晶胞(表示第二亲和光栅21)的散射质量的差δm成正比，由于由第一晶胞200(表示第一亲和光栅20)衍射的相干光和由第二晶胞210(表示第
二亲和光栅21)衍射的相干光是反相的，如上文已经解释的。
[0115]
看一下图中示出强度i随时间t的曲线，可看出在同一时间期间，强度i也减小到零。强度i与检测器5所在的预先确定的检测位置50处的相干光的振幅的平方成正比。这就是为什么强度i随时间的曲线呈抛物线形状并沿着抛物线曲线减小到零的原因。
[0116]
再次看一下图中示出散射质量的差δm随时间t的曲线，可看出，此时所有五个靶分子214都已经结合到包含在第二晶胞210中的五个亲和元素211，由于第二晶胞210(表示第二亲和光栅21)的散射质量现在大于第一晶胞200(表示第一亲和光栅20)的散射质量，因此散射质量的差δm的符号为负(并且在布置检测器的预先确定的检测位置50处的衍射相干光的振幅也是负的)。
[0117]
当看一下图中示出强度i随时间t的曲线时，可看出在该时间期间强度i再次增加(由于强度i与散射质量的差δm或衍射相干光的振幅的平方成正比)。
[0118]
因此，在检测器处提供偏置(这里：通过在第一晶胞200中提供散射元素202)可增加靶分子质量的动态测量范围，同时保持对测量精度的要求，并且因此允许使用简单且廉价的测量设备。由于连续测量，质量差δm的符号始终是已知的。
[0119]
最后，在图12中示出了传感器阵列的实施例，其包括根据本发明的多个单独的衍射传感器，每个传感器包括两个叉指型光栅2。单独传感器的基板可由公共基板3形成。此外，用于生成预先确定的波长的相干光的光束的公共光源4设置在预先确定的光束生成位置40处，以及允许相干光通过叉指型光栅2中的每个叉指型光栅上的公共孔口41，这些叉指型光栅将预先确定的波长的相干光衍射到公共检测器5(例如ccd-阵列)，其中为由单独的叉指型光栅2衍射的光设置单独的孔口51。在传感器阵列的一个实施例中，单独相应的叉指型光栅2可能都包含相同类型的亲和元素，但是不同地偏置(散射质量差)，以便允许对大范围的可检测散射质量进行最大分辨率的测量。在传感器阵列的另一实施例中，不同的叉指型光栅2可包括不同的亲和元素，以便在样品待分析的情况下，可使用此类传感器阵列确定样品的特征
‘
指纹’(即，包含在样品中的各种不同的靶分子可以上述方式使用各种不同的叉指型光栅2识别为包含在样品中)。在传感器阵列的又一实施例中，高度特异性传感器(其可能仅结合到一个特异性靶分子)可与高度非特异性传感器(其可仅检测分子类型/组或分子的特定特征或性质，例如亲水性或疏水性)一起排列。
[0120]
虽然上文已经解释了作为根据本发明的衍射传感器的基础的一般教导，下面将通过示例的方式来解释根据本发明的传感器的一些元素的一些具体技术选择。
[0121]
亲和光栅或晶胞的组成、亲和元素和散射元素的布置
[0122]
在一些实施例中，第一亲和光栅和第二亲和光栅(晶胞)可仅包括亲和元素。另外，第一亲和光栅和第二亲和光栅中的一者可包括散射元素。在其他实施例中，第一亲和光栅和第二亲和光栅两者都可包含不同类型或数量的散射元素。
[0123]
在一些实施例中，晶胞可包括散装材料/骨架材料，其可以是允许分析物或一组分析物扩散进入的任何材料。例如，散装材料/骨架材料可包括聚合物，优选地是防污聚合物，其可用亲和元素或散射元素进行官能化。可调整散装材料/骨架材料的网格大小/孔隙率以匹配所需的应用。
[0124]
在一些实施例中，光栅的晶胞可包含可涂覆有薄聚合物的基板(仅晶胞高度的一部分)。在此类实施例中，散射元素可以任何配置布置在基板内，但优选地以上述配置布置。
[0125]
散射元素的制造
[0126]
在一些实施例中，在用散装材料/骨架材料填充晶胞之前，可通过在基板上沉积介电材料或通过蚀刻基板来形成散射元素。在其他实施例中，在晶胞中形成散装材料/骨架材料期间，可使用不同的聚合时间、交联密度、厚度、孔隙率等来形成散射元素。在又一些实施例中，在已经形成晶胞的散装材料/骨架材料之后，可使用合适的交联化学借助于光诱导沉淀或纳米颗粒或大分子的共价固定来形成散射元素。
[0127]
在一些实施例中，只有能够结合散射元素的结合位点可存在于晶胞中。不同光栅的结合位点可能够结合不同类型的散射元素。散射元素可从结合位点裂解，使得它们可从晶胞中移除。在其他实施例中，亲和元素本身可以体现为组合的散射元素/亲和元素。
[0128]
散射元素的散射功率/散射强度的控制
[0129]
散射元素可以是惰性的/静态的或者可以是官能性的/可调谐的。
‘
惰性/静态’意味着散射功率/散射强度是固定的，并且不能由操作员或通过实验条件改变。
‘
官能性/可调谐’是指散射功率/散射强度可通过物理、化学或生物措施进行调整。例如，
‘
物理措施’包括在散射元素由电光材料制成的情况下施加外部场以引起折射率的变化，或者在包括渐逝场的实施例中的磁下拉。
‘
化学措施’包括散射元素的蚀刻、散射元素的聚合、散射元素在成核位点的沉淀、在散射元素处的氧化还原反应等。
‘
生物措施’包括附加散射质量与散射元素的结合或散射元素的酶促降解。
[0130]
衍射传感器的照明
[0131]
优选地，衍射传感器借助于渐逝波(例如使用平面波导)用相干光照明以便减少寄生杂散光，尽管通过自由传播光束的照明也是可能的。相干光优选地被偏振，但这不是必需的。源可以是可调谐的，或者在波长上(在关于预先确定的波长的小范围内)或者在空间方向上，以便扫描衍射条件。可优选地使用阵列检测器以便补偿微小的机械运动以及调整衍射条件。优选地，使用可以是静态的(铬屏幕)或动态的(lcd晶体显示器)的孔口。
[0132]
其他测定格式
[0133]
上述传感器实施例和受控偏置的应用中的任一者都可用所有已知的基于表面的测定格式来实现，例如直接结合测定、竞争性测定、酶促降解测定、夹心测定、反相测定、标记测定，其中标记包括散射元素。特别重要的是其中亲和元素包括识别部分的测定，该识别部分在与靶标交互后导致散射元素的裂解。此类靶标介导的裂解反应包括，例如，crispr/cas9或类似的检测系统。包括识别部分的亲和元素可连接到在裂解时释放的散射元素。在此类情况下，另一个光栅的晶胞中的散射元素可补偿连接到识别部分的散射元素。
[0134]
上文已经解释了本发明的实施例，然而，本发明不限于这些实施例。相反，在不脱离本发明的教导的情况下可进行许多改变和修改。因此，保护范围由所附权利要求定义。
[0135]
基于具有不同速率常数的生物正交化学的散射质量调谐
[0136]
在该实施例中，第一类型的亲和元素201被固定在第一光栅20的第一晶胞200中(参见例如图4和图5)，使得预先确定的波长的相干光在具有第一相的检测位置50(参见图1至图3)干扰，并且第二类型(不同于第一类型)的亲和元素211被固定在第二光栅21的第二晶胞210中，使得预先确定的波长的相干光在具有与第一相位相反的第二相位的检测位置50处干涉。
[0137]
为了实现这一点，第一光栅20的第一晶胞200包含具有官能团的元素，该官能团以
特定动力学与第一类型的亲和元素201(即大分子)的特定官能团反应，以固定在第一晶胞200中。第二光栅21的第二晶胞210包含具有不同官能团的元素，该官能团也以不同的动力学与第二类型的亲和元素211(即大分子)的特定官能团反应，第二晶胞210中的反应动力学的速率(速度)为优先与第一晶胞200中的反应动力学的速率(速度)相差二到十倍。
[0138]
具有不同反应动力学速率(速度)的两种双正交偶合化学的示例性实施例是
[0139]
(a)四嗪与反式环辛烯反应，以及
[0140]
(b)甲基四嗪与反式环辛烯反应。
[0141][0142]
四嗪与反式环辛烯(固定在第一晶胞中的第一类型(修饰)的亲和元素的特定官能团)和甲基四嗪与反式环辛烯(固定在第二晶胞中的第一类型(修饰)的亲和元素的特定官能团)的生物正交反应(如上所示)的动力学在图13的帮助下在下文进行描述。
[0143]
四嗪与反式环辛烯的反应大约比甲基四嗪与反式环辛烯的反应快四到五倍。原则上，反应速度差可通过措施诸如ph、溶剂、离子强度、温度、声学和光照进行调整。因此，在第一步骤中，将固定在第一晶胞200中并具有反式环辛烯作为官能团的第一类型的亲和元素201在叉指型光栅2的位置处施加到衍射传感器1的表面。由于反式环辛烯与四嗪(存在于第一晶胞200中的元素的官能团)的反应速度比环辛烯与甲基四嗪(存在于第二晶胞210中的元素的官能团)的反应速度快得多，第一类型的亲和元素201的反式环辛烯结合到四嗪，并且从而将第一类型的亲和元素201固定在第一晶胞20中(同时由于反式环辛烯与甲基四嗪的反应速度非常低，只有非常少的第一类型的亲和元素201被固定在第二晶胞210中)。以合适的浓度执行孵育，优先1μm(m＝摩尔＝mol/l)的第一类型的亲和元素的反式环辛烯修饰分子部分被固定在第一光栅的第一晶胞中，直到在检测器5的信号优先形成平台500(图13)。该孵育所需的时间t1在图13中示出。检测器5处信号的平台500指示大部分四嗪已经与第一晶胞200中的第一类型的亲和元素201的反式环辛烯反应。此后，从衍射传感器1的表面移除剩余的第一类型的亲和元素，并且将要固定在第二晶胞210中的第二类型的亲和元素
211被施加到叉指型光栅2的位置处的衍射传感器1的表面，也具有反式环辛烯作为官能团。由于存在于第二晶胞210中的大部分甲基四嗪尚未与第一类型的亲和元素201的反式环辛烯反应(由于反应速度非常慢)，现在允许该甲基四嗪与第二类型的亲和元素211的反式环辛烯反应。为此，现在优先执行与固定在第二光栅21的第二晶胞210中的第二类型的亲和元素211的反式环辛烯修饰的分子部分的第二次孵育，直到检测器5处的信号达到水平501，该水平表示对应于期望的散射质量差δm的偏置。该第二孵育所需的时间t2在图13中示出。从图13中还可看出，检测器5处的信号的水平501对应于大约5pg/mm2的散射质量差δm。
[0144]
与其他双正交偶合化学(诸如铜催化点击化学(cuaac))相比，上述反应对由于其相对较快的反应速度(通常在不到两小时的范围内)以及其与蛋白质的良好兼容性而特别受欢迎，这仅在蛋白质和应变促进点击化学(spaac)中表现不佳，后者的反应速度相对较慢(通常在十到二十小时的范围内)。
[0145]
虽然已经借助附图和具体示例描述了本发明的实施例，但是本发明不限于这些实施例和示例，因为在不脱离本发明的教导的情况下可以想到各种改变和修改。相反，保护范围由所附权利要求定义。

技术特征：
1.一种衍射传感器(1)，其包括：-基板(3)；-布置在所述基板上的两个叉指型亲和光栅(2；20，21)，第一亲和光栅(20)和第二亲和光栅(21)，所述第一亲和光栅(20)包括第一晶胞(200)并且所述第二亲和光栅(21)包括第二晶胞(210)，所述第一亲和光栅(20)的所述第一晶胞(200)包括能够与第一类型的靶分子(204)结合的第一类型的亲和元素(201)，并且所述第二亲和光栅(21)的所述第二晶胞(210)包括能够与第二类型的靶分子(214)结合的第二类型的亲和元素(211)，其中所述第一亲和光栅(20)的所述第一晶胞(200)被配置和被布置成使得在预先确定的光束生成位置(40)处生成并且由结合到所述第一类型的所述亲和元素(201)的所述第一类型的靶分子(204)衍射的预先确定的波长的相干光在预先确定的检测位置(50)处以第一相位相长地干涉，其中所述第二亲和光栅(20)的所述第二晶胞(210)被配置和被布置成使得在所述预先确定的光束生成位置(40)处生成并且由结合到所述第二类型的所述亲和元素(211)的所述第二类型的所述靶分子(214)衍射的所述预先确定的波长的所述相干光在所述预先确定的检测位置(50)处以与所述第一相位相反的第二相位相长地干涉，并且其中所述第一亲和光栅(20)和所述第二亲和光栅(21)相对于所述第一亲和光栅(20)和所述第二亲和光栅(21)的散射质量平衡，以在所述预先确定的检测位置(50)处生成偏置信号，所述偏置信号对应于所述第一亲和光栅(20)和所述第二亲和光栅(21)的散射质量的差(δm)，所述散射质量的差在0.001pg/mm2到30000pg/mm2的范围内。2.根据权利要求1所述的衍射传感器，其中与所述第一亲和光栅(20)和所述第二亲和光栅(21)的所述散射质量的差(δm)对应的所述偏置信号在0.1pg/mm2到1000pg/mm2的范围内，更具体地在0.1pg/mm2到100pg/mm2的范围内，并且甚至更具体地在1pg/mm2到10pg/mm2的范围内。3.根据权利要求1或2中任一项所述的衍射传感器，其中所述第一类型的所述亲和元素(201)在所述第一晶胞(200)中的浓度或空间布置和所述第二类型的所述亲和元素(211)在所述第二晶胞(210)中的浓度或空间布置是不同的。4.根据权利要求3所述的衍射传感器，其中所述第一类型的所述亲和元素(201)和所述第二类型的所述亲和元素(211)是相同的。5.根据权利要求1至3中任一项所述的衍射传感器，其中所述第一类型的所述亲和元素(201)和所述第二类型的所述亲和元素(211)是不同的。6.根据权利要求1至3中任一项所述的衍射传感器，其中所述第一类型的所述亲和元素(201)对于所述第二类型的所述靶分子是非结合的，或者所述第二类型的所述亲和元素(211)对于所述第一类型的所述靶分子是非结合的，或者两者都是。7.根据前述权利要求中任一项所述的衍射传感器，其中所述两个叉指型亲和光栅(2)中的至少一个(20，21)进一步包括能够结合散射元素(202，212)的结合位点(203，213)。8.根据前述权利要求中任一项所述的衍射传感器，其中所述两个叉指型亲和光栅(2)中的至少一个(20，21)进一步包括散射元素(202，212)。
9.根据权利要求8所述的衍射传感器，其中所述散射元素(202，212)被布置在所述第一晶胞(200)中或在所述第二晶胞(210)中或者在所述两个叉指型亲和光栅的所述第一晶胞(200)和所述第二晶胞(210)两者中。10.根据权利要求7和8所述的衍射传感器，其中所述散射元素(202，212)被结合到所述结合位点(203，213)。11.根据权利要求8至10中任一项所述的衍射传感器，其中所述散射元素(202，212)是可调谐的或可裂解的，以允许调整散射功率或移除所述散射元素(202，212)。12.根据前述权利要求中任一项所述的衍射传感器，其中所述两个叉指型亲和光栅(2)被布置在所述基板(3)的表面上。13.根据权利要求12所述的衍射传感器，其进一步包括光学耦合器(10)，所述光学耦合器被配置和被布置成将来自所述预先确定的光束生成位置(40)的所述相干光引导到布置在所述基板(3)的所述表面上的所述两个叉指型亲和光栅(2)。14.根据权利要求12或权利要求13所述的衍射传感器，其进一步包括光学解耦器(10)，所述光学解耦器被配置和被布置成将由所述两个叉指型亲和光栅(2)衍射的所述相干光引导到所述预先确定的检测位置(50)。15.根据权利要求1至11中任一项所述的衍射传感器，其进一步包括谐振波导结构，所述谐振波导结构被布置在所述基板(3)的所述表面上，所述谐振结构被配置为允许将在所述预先确定的光束生成位置(40)处生成的所述预先确定的波长的所述相干光耦合到所述谐振波导结构中，以生成沿着所述谐振波导结构的与所述谐振波导结构的面向所述基板(3)的表面相对的最外表面传播的渐逝场，并且其中所述两个叉指型亲和光栅(2)被布置在所述谐振波导结构的所述最外表面上。16.根据权利要求15所述的衍射传感器，其中布置在所述基板的所述表面上的所述谐振波导结构为平面波导(6)，并且其中所述两个叉指型亲和光栅(2)被布置在所述平面波导(6)的与所述平面波导(6)的面向所述基板(3)的表面相对的表面上。17.根据权利要求16所述的衍射传感器，其中所述平面波导(6)被构造成引导所述预先确定的波长的所述相干光，所述相干光在所述光束生成位置(40)处生成并且在沿着所述平面波导(6)的与面向所述基板(3)的表面相对的表面的一个或多个预先确定的方向上耦合到所述平面波导(6)中。18.根据权利要求16或17中任一项所述的衍射传感器，其进一步包括光学耦合器(10)，所述光学耦合器被布置在所述平面波导上并且被配置为将在所述光束生成位置(40)处生成的相干光的光束耦合到所述平面波导(6)中以撞击在所述两个叉指型亲和光栅(2)上。19.根据权利要求16至18中任一项所述的衍射传感器，其进一步包括光学解耦器(11)，所述光学解耦器被布置在所述平面波导(6)上并且被配置为将由所述两个叉指型亲和光栅(2)衍射的所述相干光从所述平面波导(6)解耦并且将所述相干光引导到所述预先确定的检测位置(50)。20.根据权利要求16至19中任一项所述的衍射传感器，其进一步包括检测器(5)，所述检测器用于检测由所述两个叉指型亲和光栅(2)衍射的所述相干光，所述检测器(5)被集成在所述平面波导(6)中或者在所述基板(3)中。21.根据权利要求16至20中任一项所述的衍射传感器，其进一步包括光源(4)，所述光
源用于生成所述预先确定的波长的相干光的光束，所述光源(4)被集成在所述平面波导(6)中或者在所述基板(3)中。22.根据权利要求15所述的衍射传感器，其中布置在所述基板的所述表面上的所述谐振波导结构包括金属层，并且其中所述两个叉指型亲和光栅被布置在所述金属层的与所述金属层的面向所述基板的表面相对的表面上。23.根据前述权利要求中任一项所述的衍射传感器，其中包含在所述第一光栅的所述第一晶胞中的所述第一类型的所述亲和元素以及包含在所述第二光栅的所述第二晶胞中的所述第二类型的所述亲和元素是使用生物正交偶合化学获得的。

技术总结
本发明提供了一种衍射传感器(1)，其包括：-基板(3)；-两个叉指型亲和光栅(2)，第一亲和光栅(20)和第二亲和光栅(21)，该第一亲和光栅包括具有亲和元素(201)的第一晶胞(200)，该第二亲和光栅包括具有亲和元素(211)的第二晶胞(210)，其中该第一晶胞(200)和该第二晶胞(210)被配置和被布置成使得在预先确定的光束生成位置(40)处生成并且由结合到这些亲和元素(201，211)的靶分子(204，214)衍射的预先确定的波长的相干光在预先确定的检测位置(50)处以相反相位相长地干涉，并且其中该第一亲和光栅(20)和该第二亲和光栅(21)平衡，以在该预先确定的检测位置(50)处生成偏置信号，该偏置信号对应于该第一亲和光栅(20)和该第二亲和光栅(21)的散射质量的差(Δm)，该散射质量的差在0.001pg/mm2到30000pg/mm2的范围内。的范围内。的范围内。


技术研发人员：克里斯托夫
受保护的技术使用者：苏黎世联邦理工学院
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2023/8/28