使用荧光和化学发光标记两者的检测方法与流程

1.本发明涉及使用荧光和化学发光标记两者来检测液体样品中的分析物的方法。双标记提供对高浓度和低浓度两种样品的准确定量。


背景技术：

2.抗原抗体对、受体配体对和互补核苷酸对通常用作诊断测试中的检测基础。固定在基底上以捕获样品中的靶标的抗体、互补核酸或受体通常称为捕获分子。在捕获分子与样品中的靶标分析物结合后，使用检测抗体、核酸或受体来检测所捕获的靶标分析物。检测抗体、核酸或受体可在其上具有荧光、化学发光或电化学发光标记，以提供检测信号。
3.在这些标记中，通常使用荧光分子。然而，在诊断检测中，样品中靶标分子的数目变化很大，并且它们的浓度变化至少5,000倍；对于某些特定靶标，浓度变化甚至超过300,000倍。尽管荧光标记可有效地检测具有低端浓度的靶标，但是当靶标浓度较高时，荧光标记的浓度可增加若干数量级。当荧光分子彼此靠近时，将发生自淬灭，这导致荧光信号与靶标浓度之间的非线性关系，并且导致定量不准确。
4.化学发光标记无需外部辐射能就能进行检测。能量来自于化学反应打破化学键之后释放的光子。然而，化学发光标记的能量转换效率不是1 00％。大量能量通过热耗散而不是产生光子。当分析物浓度低时，化学发光免疫测定通常显示出测定变异。
5.仍然需要改进的检测方法来解决免疫测定中遇到的问题。
附图说明
6.图1示出了用于从探头的感测表面检测荧光信号和化学发光信号两者的光学检测系统。
具体实施方式
7.定义
8.权利要求和说明书中使用的术语应根据本领域技术人员所理解的它们的通常含义来解释，除了如下所述的定义之外。
9.如本文所用，
″
约
″
是指在所述值的
±
10％内。
10.如本文所用，
″
分析物结合分子
″
是指能够参与与分析物分子的特异性结合反应的任何分子。
11.形状的
″
纵横比
″
是指其较长尺寸与其较短尺寸的比率。
12.″
结合分子
″
是指能够结合另一个感兴趣的分子的分子。
13.如本文所用，
″
结合对
″
是指彼此吸引并且彼此特异性结合的两个分子。结合对的示例包括但不限于抗原和针对抗原的抗体、配体及其受体、核酸的互补链、生物素和亲和素、生物素和链霉亲和素、生物素和中性亲和素(亲和素的去糖基化形式)、凝集素和碳水化合物。优选的结合对是生物素和链霉亲和素、生物素和亲和素、生物素和中性亲和素、荧光
素和抗荧光素、地高辛/抗地高辛、dnp(二硝基苯酚)/抗dnp。
14.如本文所用，
″
化学发光
″
是指作为化学反应的结果，具有有限发光发射的能量发射。例如，当鲁米诺(1umin01)与过氧化氢在合适的催化剂存在下反应时，其产生激发态的3-氨基邻苯二甲酸酯，当其衰减至较低能级时发光。
15.如本文所用，
″
固定
″
是指试剂被固定到固体表面。当试剂固定到固体表面时，它非共价结合或者共价结合到表面。
16.如本文所用，
″
单片基底
″
是指单片固体材料。
17.如本文所用，
″
探头
″
是指在感测侧涂覆有分析物结合分子薄膜层的基底。探头具有远端和近端。近端(在本技术中也指探头尖端)具有涂覆有分析物结合分子薄层的感测表面。优选地，基底具有低荧光背景，并且基底可以是石英、硅、金属、陶瓷或塑料。
18.本发明改进了用于测量分析物浓度的荧光检测方法，例如，如美国公开号201i/0312105中所述。本发明方法除了在该方法中使用荧光标记外，还使用化学发光标记。荧光检测提供了针对低浓度分析物的灵敏度和准确性，并且化学发光检测提高了高浓度分析物的准确性。
19.在本发明的检测方法中，使用荧光标记和化学发光标记两者。首先读取荧光信号，以获得低端灵敏度和精确性的优点。然后读取化学发光信号。当荧光信号高且接近饱和时，化学发光信号提供靶标分析物的准确高端浓度。
20.第一方面
21.在第一方面，本发明涉及检测液体样品中的分析物的方法。该方法包括以下步骤：(a)将探头尖端浸入样品溶液中以使若存在的分析物与探头尖端上的第一抗体结合，其中探头具有固定在探头尖端上的第一抗体；(b)将探头尖端浸入包含生物素缀合的第二抗体的试剂溶液中，以在探头尖端上的分析物、第一抗体和第二抗体之间形成免疫复合物，其中第一抗体和第二抗体是各自针对分析物的两种不同抗体；(c)将探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将探头尖端浸入包含用荧光标记物标记的链霉亲和素和用化学发光标记物标记的链霉亲和素的溶液中；(e)将探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在探头尖端上的材料的荧光信号；(f)基于荧光信号对照第一校准曲线对分析物浓度进行定量；(g)将探头尖端浸入触发溶液中，以生成结合在探头尖端上的材料的化学发光信号；(h)基于化学发光信号对照第二校准曲线对分析物浓度进行定量，以及(i)根据分析物的荧光信号，使用预先建立的截止值，基于荧光信号对照第一校准曲线或基于化学发光信号对照第二校准曲线确定分析物浓度。
22.在步骤(a)中，探头可以是任何形状，诸如杆状、圆柱形、圆形、正方形、三角形等。在一个实施方案中，探头具有至少5比1，或10比1的长宽比。优选杆状。
23.探头具有用于结合分析物的小尖端。尖端具有较小的表面积，其中直径≤5mm，优选地≤2mm或≤1mm，例如0.5mm至2mm。
24.探头尖端涂覆有与样品中的分析物结合的第一抗体。将试剂固定到固相(探头尖端的感测表面)的方法在免疫化学中是常见的，并且涉及在固相与试剂之间形成共价键、疏水键或静电键。第一抗体可以直接固定在感测表面上。或者，第一抗体可通过结合对间接固定在感测表面上。例如，可通过吸附到固体表面或通过共价结合到涂覆在固体表面上的氨基丙基硅烷来首先固定抗荧光素。然后，用荧光素标记的第一抗体可通过荧光素和抗荧光
素的结合(结合对)而结合到固体表面。
25.将探头尖端浸入样品容器中20秒至60分钟，优选20秒至10分钟，以使分析物与探头尖端上的第一抗体结合。
26.在步骤(a)之后，任选地将探头在含有洗涤溶液的洗涤容器中洗涤1至5次，优选1至3次。可能不需要该额外的洗涤步骤，因为由于结合表面积小，残留溶液的量很少。洗涤溶液通常含有缓冲液和表面活性剂诸如tween 20。
27.在步骤(b)中，将探头尖端浸入试剂容器中20秒至10分钟，优选20秒至2分钟，以结合针对分析物的生物素缀合的第二抗体，从而形成免疫复合物。
28.在步骤(c)中，将探头在含有洗涤溶液的洗涤容器中洗涤1至5次，优选1至3次。洗涤溶液通常含有缓冲液和表面活性剂诸如tween 20。
29.在步骤(d)中，使用两种链霉亲和素试剂，即，标记有荧光标记的链霉亲和素和标记有化学发光标记的链霉亲和素。
30.在一个实施方案中，每种链霉亲和素是链霉亲和素的单体。
31.在另一个实施方案中，每种链霉亲和素试剂进一步与聚合物缀合。聚合物可以是多糖(例如蔗糖和表氯醇的共聚物或葡聚糖)、多核苷酸、树枝状聚合物、多元醇或聚乙二醇。多糖通常与免疫测定中常用的许多固相材料表现出可忽略的非特异性结合。该聚合物应具有低的非特异性结合，具有大于400kd或500kd的分子量，以用作多个结合的链霉亲和素的有效载体。市售可得分子量为70k和400k道尔顿的一种优选的聚合物是交联例如，一个荧光链霉亲和素缀合物携带每个(2百万道尔顿)约20至30个链霉亲和素以及每个链霉亲和素2至3个cy5分子。例如，一个化学发光链霉亲和素缀合物携带每个(2百万道尔顿)约20至30个链霉亲和素以及每个链霉亲和素2至3个吖啶酯分子。
32.荧光标记和化学发光标记的大小优选地是小的，分子量≤5000道尔顿；优选≤2000道尔顿；例如，200至2000道尔顿或300至1200道尔顿。当与链霉亲和素缀合时，高分子量标记可能改变其生物素结合能力并呈现空间位阻。
33.荧光标记选自由花青、香豆素、呫吨以及它们的衍生物组成的组。例如，荧光染料是cy5(分子量mw792)、alexafluor647、dylight350(mw 874)、dylight 405(mw793)、dylight 488(mw 71011)、dylight 550(mw 982)、dylight 594(mw 1078)、dylight 633(mw 1066)、dylight 650(mw 1008)、dylight 680(mw 950)、dylight 755(mw 1092)、dylight 800(mw 1050)、oyster荧光染料、irdye或包含与稀土金属诸如镧系元素(eu、th、sm或dy)螯合的多个环的有机化合物。
34.化学发光标记选自由钌(ii)三联吡啶(mw 1057)、吖啶酯(9[[4-[3-[(2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-3-氧代丙基]苯氧基]羰基]-10-甲基-吖啶三氟甲磺酸盐，mw 632)和氯化血红素(mw 652)组成的组。
[0035]
在各步骤(a)至(d)中，可通过搅拌或混合容器中的溶液来加速反应。例如，可以诱导溶液跨过探头尖端的侧向流动(轨道流动)，这可加速靶标分子被固定到固相上的其结合配偶体捕获。例如，反应容器可以安装在轨道振荡器上，并且轨道振荡器以至少50rpm，优选地至少200rpm，更优选地至少500rpm，诸如500rpm至1,000rpm的速度旋转。任选地，探头尖
端可以按0.01mm/秒至10mm/秒的速度上下并垂直于轨道流的平面移动，以引起探头尖端上方和下方的溶液的额外混合。
[0036]
在步骤(d)之后，在读取荧光信号(步骤(e))之前，将探头在含有洗涤溶液的洗涤容器中洗涤1至5次，优选1至3次。为了读取荧光标记，将探头置于底部透明的孔中并通过检测器读取，诸如us 2011/0312105中描述的那些(参见该参考文献的图1)，或通过如本技术的图1中所示的检测器读取。
[0037]
在步骤(f)中，对照预先建立的针对荧光信号的第一校准曲线对分析物浓度进行定量。
[0038]
在步骤(g)和(h)中，生成化学发光信号，并且针对预先建立的针对化学发光信号的第二校准曲线对分析物浓度进行定量。对于化学发光标记，将探头置于含有具有共反应物的触发溶液的底部透明的孔中。例如，当化学发光标记是钌(ii)三联吡啶时，共反应物是三丙胺。当化学发光标记是吖啶酯时，共反应物是(a)在水中含有hno3和h2o2的水溶液，和(b)含有naoh和阳离子表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵(ctac)的水溶液。发射的光通过光电倍增管(pmt)测量。
[0039]
在步骤(i)中，根据分析物的荧光信号，使用基于荧光校准曲线预先建立的截止值，基于第一校准曲线(荧光信号)或第二校准曲线(化学发光信号)确定分析物浓度。通常，当分析物浓度低时，基于荧光信号和荧光校准曲线确定准确的分析物浓度。当分析物浓度高时，基于化学发光信号和化学发光校准曲线确定准确的分析物浓度。当分析物浓度在中间范围内时，使用荧光还是化学发光来导出分析物浓度是基于预先建立的荧光信号的截止值。荧光信号低于截止值的样品将具有通过荧光校准确定的分析物浓度。荧光信号高于截止值的样品将具有通过化学发光校准确定的分析物浓度。
[0040]
在本发明的第一方面中，生物素和链霉亲和素可以被结合对的第一成员和结合对的第二成员替换。
″
结合对
″
在定义中有所定义。生物素和链霉亲和素是优选的结合对。其他有用的结合对是生物素和亲和素、生物素和中性亲和素、荧光素和抗荧光素、地高辛/抗地高辛或dnp(二硝基苯酚)/抗dnp。
[0041]
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)将探头尖端浸入样品溶液中以使若存在的分析物与探头尖端上的第一抗体结合，其中探头具有固定在探头尖端上的第一抗体；(b)将探头尖端浸入包含与结合对的第一成员缀合的第二抗体的试剂溶液中，以在探头尖端上的分析物、第一抗体和第二抗体之间形成第一免疫复合物，其中第一抗体和第二抗体是各自针对分析物的两种不同抗体；(c)将探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将探头尖端浸入包含(i)用荧光标记进行标记的结合对的第二成员和(ii)用化学发光标记进行标记的结合对的第二成员的溶液中，以在探头尖端上形成具有荧光标记的第二免疫复合物和具有化学发光标记的第三免疫复合物；(e)将探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在探头尖端上的第二免疫复合物的荧光信号；(f)基于荧光信号对照第一校准曲线对分析物浓度进行定量；(g)将探头尖端浸入触发溶液中，以生成来自结合在探头尖端上的第三免疫复合物的化学发光信号；(h)基于化学发光信号对照第二校准曲线对分析物浓度进行定量，以及(i)根据分析物的荧光信号，使用预先建立的截止值，基于第一校准曲线或第二校准曲线确定分析物浓度。
[0042]
第二方面
[0043]
在本发明的第二方面，检测的方法步骤类似于第一实施方案，不同的是(i)用针对半抗原的抗体预先涂覆探头，和(ii)在与探头尖端反应之前，将样品、与半抗原缀合的第一抗体和与生物素缀合的第二抗体混合。
[0044]
在第二方面，本发明方法包括以下步骤：(a)混合包含样品、与半抗原缀合的第一抗体、与生物素缀合的第二抗体的溶液，其中第一抗体和第二抗体是各自针对分析物的两种不同抗体；(b)将探头尖端浸入(a)的溶液中，以在探头尖端上的分析物、第一抗体和第二抗体之间形成免疫复合物；(c)将探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将探头尖端浸入包含用荧光标记进行标记的链霉亲和素和用化学发光标记进行标记的链霉亲和素的溶液中；(e)将探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在探头尖端上的材料的荧光信号；(f)基于荧光信号对照第一校准曲线对分析物浓度进行定量；(g)将探头尖端浸入触发溶液中，以生成结合在探头尖端上的材料的化学发光信号；(h)基于化学发光信号对照第二校准曲线对分析物浓度进行定量，以及(i)根据分析物的荧光信号，使用预先建立的截止值，基于荧光信号对照第一校准曲线或基于化学发光信号对照第二校准曲线确定分析物浓度。
[0045]
本发明第二方面的步骤(c)至(i)与第一方面所述的那些相同或相似。
[0046]
在本发明的第二方面中，生物素和链霉亲和素可以分别被结合对的第一成员和结合对的第二成员替换。
″
结合对
″
在定义中有所定义。生物素和链霉亲和素是优选的结合对。其他有用的结合对是生物素和亲和素、生物素和中性亲和素、荧光素和抗荧光素、地高辛/抗地高辛或dnp(二硝基苯酚)/抗dnp。
[0047]
在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)混合包含样品、与半抗原缀合的第一抗体、与结合对的第一成员缀合的第二抗体的溶液，其中第一抗体和第二抗体是各自针对分析物的两种不同抗体；(b)将探头尖端浸入(a)的溶液中，以在探头尖端上的分析物、第一抗体和第二抗体之间形成第一免疫复合物；(c)将探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将探头尖端浸入包含(i)用荧光标记进行标记的结合对的第二成员和(ii)用化学发光标记进行标记的结合对的第二成员的溶液中，以在探头尖端上形成具有荧光标记的第二免疫复合物和具有化学发光标记的第三免疫复合物；(e)将探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在探头尖端上的第二免疫复合物的荧光信号；(f)基于荧光信号对照第一校准曲线对分析物浓度进行定量；(g)将探头尖端浸入触发溶液中，以生成来自结合在探头尖端上的第二免疫复合物的化学发光信号；(h)基于化学发光信号对照第二校准曲线对分析物浓度进行定量，以及(i)根据分析物的荧光信号，使用预先建立的截止值，基于第一校准曲线或第二校准曲线确定分析物浓度。
[0048]
检测装置
[0049]
图1是读取荧光和化学发光标记两者的检测装置的结构图。该检测装置包括光学模块，该光学模块包括激光器、光子计数器、透镜、可移动滤波器和数值孔径系统。通过光电倍增管(pmt)检测所发射的光的荧光信号和化学发光信号。为了测量化学发光信号，关闭激光器并移除滤波器和数值孔径系统。然后将浓缩的发光触发剂a和触发剂b添加到具有基底泵的读取池中，并生成化学发光信号。
[0050]
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为将本发明的范围限制在其中描述的特定程序。
[0051]
实施例
[0052]
实施例1：具有固定的第一抗体的探头的制备
[0053]
使用化学气相沉积方法(yield engineering systems，1224p)，按照制造商的方案，用氨基丙基硅烷涂覆直径为1mm且长度为2cm的石英探头。然后将探头尖端浸入10μg/ml的鼠单克隆抗荧光素(biospacific)的pbs(磷酸缓冲盐水)(ph 7.4)溶液中。在使抗体吸附到探头20分钟之后，在pbs中洗涤探头尖端。
[0054]
实施例2.标记的捕获抗体和信号抗体的制备
[0055]
降钙素原(pct)的捕获抗体是从hytest获得的单克隆抗体，并通过标准方法用荧光素标记。通常，每个抗体有约4个荧光素取代。
[0056]
pct的信号抗体是从hytest获得的多克隆抗体，并通过标准方法用生物素标记。通常，每个抗体有约4个生物素。
[0057]
实施例3.cy5-链霉亲和素的制备
[0058]
使32μl的cy 5-nhs(ge healthcare)的dmf溶液(5mg/m1)与ph9.5的0.1m碳酸钠缓冲液中的1ml链霉亲和素(scripps labs)(2.4mg/m1)在30℃下反应40分钟。通过将混合物施加到pd 10柱(pharmacia)除去未缀合的cy 5。光谱分析显示每个链霉亲和素分子连接2.8个cy 5。
[0059]
实施例4.交联400的制备
[0060]
向胺化至每400kd(skold technology)含有88个胺的2ml400(sigma/aldrich)的pbs溶液(20mg/m1)中添加10μl spdp(琥珀酰亚胺基6-[3-[2-吡啶基二硫代]-丙酰胺基]己酸酯)的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶液(50mg/m1)。mcr为15。混合物在室温下反应1小时，然后透析。通过标准方法估计硫醇掺入为400kd。
[0061]
为了使spdp标记的400上的硫醇脱保护，将30μl dtt的pbs溶液(38mg/ml)添加到20mg在1ml pbs中的溶液中，并使其在室温下反应两小时。在pd10柱上纯化
[0062]
smcc(琥珀酰亚胺基4-[n-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯)如下连接至胺化的400(88个胺/ficoll)：将1ml pbs中10mg胺化的400与25μl smcc的dmf溶液(10mg/m1)混合，smcc/ficoll mcr为30。混合物在室温下反应1小时，然后在pd10柱(ge healthcare)上纯化。
[0063]
为了交联400和400，将1ml pbs中的10mg400与1ml pbs中的10mg400混合。混合物在室温下反应过夜。
[0064]
实施例5.吖啶酯-链霉亲和素-交联的制备
[0065]
为了提供用于随后链霉亲和素与交联400缀合的连接位点(实施例4)，然后使残留的胺与过量的spdp反应。将20mg交联400与75μl spdp的dmf溶液(50mg/m1)混合。混合物在室温下反应1小时，然后用pbs透析。然后将spdp标记的交联
400制剂在sepharose 4b cl柱上纯化。
[0066]
将1ml pbs中的1.5mg/ml的链霉亲和素(sa)与5μl smcc的dmf溶液(5mg/m1)混合并在室温下反应1小时，随后在pd 10柱上纯化。
[0067]
交联400-spdp上的硫醇通过以下方法来脱保护：将30μl 38mg/ml的dtt添加到1ml pbs中的0.7mg交联400-spdp中并在室温下反应1小时，随后通过pd 10柱纯化交联400-sh。
[0068]
将sa-smcc与交联400-sh混合并在室温下反应过夜。然后添加10μl12.5mg/ml的nem(n-乙基-马来酰亚胺)并在室温下反应1/2小时。然后在sepharose 4b cl柱上纯化链霉亲和素-交联缀合物。
[0069]
为了将吖啶酯(ae)连接至链霉亲和素-交联将4.5ul的9-[[[4-[(2，5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-4-氧代丁基][(4-甲基苯基)磺酰基]氨基]羰基]-10-(3-磺丙基)-吖啶内盐(同义词nsp-sa-nhs，biosynth carbosynth)的dmf溶液(10mg/ml)与ph 7.4的pbs中的3.0ml链霉亲和素-交联(0.3mg/ml)混合，并使其在室温下反应1小时。然后将缀合物在pd10柱上纯化以除去未连接的ae。
[0070]
实施例6.cy5-链霉亲和素-交联的的制备
[0071]
使5.8μl smcc(4-[n-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯，pierce chemical)的dmf溶液(10mg/ml)与ph 7.4的1ml pbs中的2mg cy5-链霉亲和素(实施例3)在室温下反应1小时。将混合物施加到pd 10柱除去未缀合的smcc。
[0072]
交联400-spdp上的硫醇通过以下方法来脱保护：将30μl 38mg/ml的dtt添加到1mg交联400-spdp的1ml pbs溶液中并在室温下反应1小时，随后通过pd 10柱纯化交联
[0073]
将cy5-链霉亲和素-smcc与交联的400-sh混合并在室温处反应过夜。然后添加10μl 12.5mg/ml的nem(aldrich)并在室温下反应1/2小时。然后在sepharose 4b cl柱上纯化缀合物。据估计，缀合物携带每个(2百万道尔顿)约20至30个链霉亲和素以及每个链霉亲和素约2至3个cy5。
[0074]
实施例7：钌(ii)三联吡啶-链霉亲和素-交联的制备
[0075]
将35μl二甲基甲酰胺中的0.176μg钌(ii)三联吡啶-nhs(mesoscale discovery，r91bn-2)与ph 7.4的pbs中的1mg链霉亲和素混合，并使其在室温下反应一小时。通常每个链霉亲和素分子连接约2至4个ru标记。将所得的ru-链霉亲和素缀合物在pd—10柱(pharmacia)上纯化。使2.9μl smcc(pierce chemical)的dmf溶液(10mg/ml)与ph 7.4的1ml pbs中的1mg ru-链霉亲和素在室温下反应1小时。将混合物施加到pd 10柱上以除去未结合的smcc。
[0076]
交联400-spdp上的硫醇通过以下方法来脱保护：将30μl38mg/ml的dtt添加到1ml pbs中的1mg交联400-spdp中并在室温下反应1小时，随后通过pd 10
柱纯化交联
[0077]
将ru-链霉亲和素-smcc与交联400-sh混合并在室温下反应过夜。然后添加10μl 12.5mg/ml的nem(aldrich)并在室温下反应1/2小时。然后在sepharose 4b cl柱上纯化缀合物。所得的缀合物具有约20个链霉亲和素/交联和2至4个ru/链霉亲和素。
[0078]
实施例8.测定结果
[0079]
该实施例提供了一种集荧光和化学发光于一体的快速检测方法，用于检测全血样品中的降钙素原(pct)。
[0080]
用与交联ficoll聚合物缀合的抗荧光素抗体预涂覆探头。
[0081]
将4μl全血、100μl 0.2μg/ml的荧光酰化的小鼠抗人pct单克隆抗体和100μl 0.2μg/ml的生物素化的多株抗人pct抗体添加至抗荧光素涂覆的探头并反应240秒。
[0082]
探头用pbst(pbs-tween)洗涤，然后转移到含有100μl 10μg/ml的cy5-链霉亲和素-交联和100μl 10μg/ml的吖啶酯-链霉亲和素-交联的另一个孔中并反应15秒。
[0083]
用pbst洗涤探头，然后通过图1的装置读取探头的荧光信号并针对荧光标准曲线进行定量。然后，将探头移至含有130μl引发剂a和130μl引发剂b的孔中，以生成化学发光信号。引发物a含有0.1m hno3和0.3％h2o2水溶液，引发剂b含有0.25m naoh和7mm ctac水溶液。化学发光信号也通过图1的装置读取，并针对化学发光标准曲线进行定量。结果汇总在表1至表3中。
[0084]
该方法检测了全血中的pct，并且从添加样品到结果读数仅花费了6分钟。分析灵敏度为0.01ng/ml，并且检测范围为0.01ng/ml至1,000ng/ml。低端和高端检测信号均表现出良好的线性度，如下表所示。
[0085]
表1：降钙素原荧光信号的测试结果
[0086][0087][0088]
表2：降钙素原化学发光信号的测试结果
[0089]
浓度(ng/ml)化学发光信号100096798
50052051250289201001484033.3460311.117963.76951.232670.4121090.137790.04689075
[0090]
表3：荧光和发光方法的测试结果的可重复性
[0091][0092]
荧光系统与化学发光系统之间的主要区别在于高浓度与低浓度之间的不同分辨率。
[0093]
分辨率被计算为一种浓度的信号与其紧邻的较低浓度的信号的比率。分辨率示于表4中。
[0094]
表4：分辨率
[0095]
浓度(ng/ml)荧光信号分辨率化学发光信号分辨率1000140094 96798 5001269281.10520511.86250990601.28289201.80100773911.28148401.9533.3456021.7046033.2211.1224432.0317962.563.780952.776952.581.2327932.902672.60
0.4129932.811092.450.1373422.90791.380.046983.49890.890195.16751.19
[0096]
分辨率》2.0被认为是可接受的，以区分低(0ng/ml至1.23ng/m1)、中(1.24ng/ml至11.1ng/ml)和高(11.2ng/ml至1,000ng/ml)浓度。
[0097]
表5.血液样品的精确测试
[0098][0099]
[0100][0101]
表5显示，荧光检测在低和中浓度样品中均具有高准确度，并且化学发光检测在中和高浓度样品中均具有高准确度。
[0102]
基于浓度切换系统的血浆样品回收测试：
[0103]
选择已知浓度的pct高浓度样品，然后用阴性样品进行3倍系列稀释。每个样品测试两次。计算平均浓度与理论值的比率作为回收率(表6)。
[0104]
表6.比较荧光检测和化学发光检测
[0105][0106]
选择并组合表6的荧光和化学发光结果，以选择最佳回收率(表7)。在表7中，0.11至8.18的测量平均值是基于荧光信号的，并且24.3至78.2的测量平均值是基于化学发光信号的。
[0107]
表7.组合荧光检测和化学发光检测进行定量
[0108][0109]
通过组合低端荧光系统和高端化学发光系统的优点，全部浓度的回收率结果均在96％至104％的范围内。
[0110]
本发明以及其制造和使用方式和方法现在以完整、清晰、简洁和确切的术语进行描述，以便使其所属领域的任何技术人员能够制造和使用本发明。应理解，前述内容描述了本发明的优选实施方案，并且可在不脱离如权利要求中所阐述的本发明的范围的情况下对其进行修改。为了特别指出并清楚地要求被视为发明性的主题，本说明书以以下权利要求书结束。

技术特征：
1.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将探头尖端浸入样品溶液中以使若存在的分析物与所述探头尖端上的第一抗体结合，其中所述探头具有固定在所述探头的所述尖端上的第一抗体；(b)将所述探头尖端浸入包含与结合对的第一成员缀合的第二抗体的试剂溶液中，以在所述探头尖端上的所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体之间形成第一免疫复合物，其中所述第一抗体和所述第二抗体是各自针对所述分析物的两种不同抗体；(c)将所述探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将所述探头尖端浸入包含(i)用荧光标记进行标记的结合对的第二成员和(ii)用化学发光标记进行标记的结合对的所述第二成员的溶液中，以在所述探头尖端上形成具有所述荧光标记的第二免疫复合物和具有所述化学发光标记的第三免疫复合物；(e)将所述探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在所述探头尖端上的所述第二免疫复合物的荧光信号；(f)基于所述荧光信号对照第一校准曲线对所述分析物浓度进行定量；(g)将所述探头尖端浸入触发溶液中，以生成来自结合在所述探头尖端上的所述第三免疫复合物的化学发光信号；(h)基于所述化学发光信号对照第二校准曲线对所述分析物浓度进行定量，以及(i)基于所述荧光信号或所述化学发光信号确定所述分析物浓度。2.一种检测液体样品中的分析物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)混合包含样品、与半抗原缀合的第一抗体、与结合对的第一成员缀合的第二抗体的溶液，其中所述第一抗体和所述第二抗体是各自针对所述分析物的两种不同抗体；(b)将探头尖端浸入(a)的所述溶液中，以在所述探头尖端上的所述分析物、所述第一抗体和所述第二抗体之间形成第一免疫复合物；(c)将所述探头尖端浸入洗涤溶液中；(d)将所述探头尖端浸入包含(i)用荧光标记进行标记的结合对的第二成员和(ii)用化学发光标记进行标记的结合对的所述第二成员的溶液中，以在所述探头尖端上形成具有所述荧光标记的第二免疫复合物和具有所述化学发光标记的第三免疫复合物；(e)将所述探头尖端浸入读取容器中，并测量结合在所述探头尖端上的所述第二免疫复合物的荧光信号；(f)基于所述荧光信号对照第一校准曲线对所述分析物浓度进行定量；(g)将所述探头尖端浸入触发溶液中，以生成来自结合在所述探头尖端上的所述第三免疫复合物的化学发光信号；(h)基于所述化学发光信号对照第二校准曲线对所述分析物浓度进行定量，以及(i)基于所述荧光信号或所述化学发光信号确定所述分析物浓度。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述结合对是生物素和链霉亲和素、生物素和亲和素、生物素和中性亲和素、荧光素和抗荧光素、地高辛/抗地高辛或dnp(二硝基苯酚)/抗dnp。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合对的所述第一成员是生物素，并且所述结合对的所述第二成员是链霉亲和素。5.根据权利要求1或2所述的方法，还包括在步骤(d)之前读取所述探头尖端的背景荧
光信号，其中通过从步骤(e)的所述荧光信号中减去所述背景荧光信号来计算步骤(f)的所述荧光信号。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述探头尖端的表面≤约5mm。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述荧光标记是花青染料。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述化学发光标记是钌(ii)三联吡啶或吖啶酯。9.根据权利要求4所述的方法，其中所述链霉亲和素与蔗糖和表氯醇的共聚物缀合。10.根据权利要求9所述的方法，其中每个共聚物携带约20至30个链霉亲和素。11.根据权利要求10所述的方法，其中每个共聚物还携带每个链霉亲和素2至3个cy5分子或每个链霉亲和素2至3个吖啶酯分子。

技术总结
本发明涉及一种用于检测液体样品中的分析物的免疫测定方法；并为高浓度和低浓度两种样品提供准确性和再现性。该方法使用荧光标记和化学发光标记两者，并读取荧光信号和化学发光信号两者。使用预先建立的分析物浓度值，基于荧光信号的校准曲线或化学发光信号的校准曲线来确定分析物浓度。曲线来确定分析物浓度。曲线来确定分析物浓度。


技术研发人员：陈浩德 吴衡 谭洪 罗伯特
受保护的技术使用者：万迈医疗仪器有限公司
技术研发日：2021.12.21
技术公布日：2023/8/28