一种与罗氏沼虾体长相关的SSR标记及其应用

一种与罗氏沼虾体长相关的ssr标记及其应用
技术领域
1.本发明属于罗氏沼虾育种分子标记筛选应用技术领域，具体涉及一种与罗氏沼虾体长相关的ssr标记及其应用。


背景技术：

2.罗氏沼虾(macrobrachium rosenbergii)为世界上最大的淡水虾类，具有食性广、养殖周期短、营养价值高、抗病力强等优良生物学特性，因此具有重要的经济价值，它是世界上许多地区内陆水产养殖中重要的经济甲壳动物之一，也是继罗非鱼之后，联合国粮农组织(fao)向全球，尤其是向发展中国家推广养殖的种类。我国于1976年从日本引进该虾进行养殖推广，经40多年的发展，我国成为全球罗氏沼虾产业最大国。据不完全统计，至2022年，我国苗种年生产量达到400亿尾，养殖面积超过3.5万公顷，总产量超过16万吨(占全球养殖总产的68％)。同时带动了饲料、成品虾加工、出口等环节，产业链总产值超200亿元。同时，形成了颇具特色、分工明确的苗种与养殖区块。产业的稳定快速发展得益于育种项目的开展及选育良种的产业化推广，通过传统的家系选育，经全国水产原种和良种审定委员会审定通过的罗氏沼虾选育新品种“南太湖2号”和“南太湖3号”是目前产业中养殖最为广泛的新品种。经遗传改良后，罗氏沼虾“南太湖2号”与未选育苗种相比，生长速度提高36.87％，成活率提高7.76％。而“南太湖3号”生长速度又在“南太湖2号”的基础上提高了23.36％。
3.然而，传统的选择育种改良罗氏沼虾性状是基于表型值进行选育，育种周期长、效率低。而随着高通量测序技术的发展，规模化、通量化、快速化挖掘分子标记成为可能，使得分子标记在辅助传统育种方面运用越来越广泛。该技术能有效地克服传统育种过程中所采用的形态学标记存在数目少、受环境影响较大、不易直接选择等缺点，从而可加速育种进程，提高育种效率，缩短育种年限。
4.一般在采集生长性状表型数据用于育种中，体重和体长是评价生长速度的重要表型数据，对于鱼类而言，测量的个体体重数据基本是真实的表型情况，而对于甲壳动物而言，尤其罗氏沼虾，测量的个体体重数据往往有偏差，造成这种偏差的主要原因为罗氏沼虾好斗、蜕皮期自相残杀、蜕皮不顺遂，导致罗氏沼虾的附肢、额刺断裂，尤其是测量时第二步足残缺，大大影响了体重表型值的真实性。此外，测量时雌性抱卵与不抱卵，也直接影响体重表型值。因此，采集体长表型数据能够更真实的反应其生长情况，用体长数据关联得到的分子标记比体重数据更可靠。


技术实现要素：

5.本发明提供一种罗氏沼虾体长相关ssr标记，通过对罗氏沼虾转录组中的ssr位点进行了多态性筛选，而后进行ssr标记与体长关联分析，最终获得了与罗氏沼虾体长相关的ssr标记，为今后开展罗氏沼虾的分子标记辅助育种打下基础。
6.本发明首先提供一种与罗氏沼虾体长相关的ssr标记，分子标记命名为lszx001或
lszx304；其中lszx001的序列如下：gaggagggtgaaggaacacatggtgatggcattgaggaggaggagctctctaaagaagaggaacac attgaagagccaagtactgaacagaaggaa(caagaa)ngaacaacaagaacaggaacagggacaa gaccaagatcagg；其中n为3-5；
7.lszx304的序列如下：
8.cctggtttctgtggccttatatggtgaggtcactaccaaccaaggtcaggcggaccttgcgtacgtacatt ctctctttctccgggccaataagagtgcacattgacattcactt(cgtc)ngcctctgcaaaaatattcactg gggttttatctcgttcggatcgttttctttgcccgagaggaagtggaaatgacctcga；其中n为3-5，由重复数来确定。
9.用于检测lszx001标记的引物对，其上游引物序列为5
′‑
gaggagggtgaaggaacaca-3
′
，下游引物序列为5
′‑
cctgatcttggtcttgtccc-3
′
；
10.检测lszx304标记的引物对，其上游引物序列为5
′‑
tcctggtttctgtggcctta-3
′
，下游引物序列为5
′‑
tcgaggtcatttccacttcc-3
′
。
11.本发明所提供的ssr标记用于筛选高体长的罗氏沼虾；
12.本发明再一个方面是提供一种筛选高体长罗氏沼虾的方法，是通过检测待筛选个体中lszx001标记的基因型是否为162/165或162/168或165/174或168/174或174/174或168/168；lszx304标记的基因型是否为210/214来实现的。
13.所述的方法，是通过pcr引物对进行扩增后，再对扩增产物进行测序后，对基因型进行分析完成的。
14.本发明所提供的筛选高体长罗氏沼虾的方法，其一种具体操作如下：
15.1)提取待检测个体的基因组dna，
16.2)pcr扩增与荧光检测：
17.在正向引物5
′
端标记荧光素进行pcr反应，pcr产物进行自动荧光检测；
18.3)数据分析
19.用genemapper4.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型；根据基因型确定是否为高体长罗氏沼虾。
20.本发明筛选获得的罗氏沼虾体长相关ssr标记是从转录组数据中筛选得到的多态性位点，与功能基因相关，可为后续与生长性状关联分析、遗传图谱构建，qtl定位等提供有力支持。
附图说明
21.图1：罗氏沼虾转录组中unigenes的ssr分析结果图，
22.图2：lszx001位点基因型分型结果图，
23.图3：lszx304位点基因型分型结果图。
具体实施方式
24.微卫星(microsatellites)又称简单重复序列(simple sequence repeats，ssr)，为第二代分子标记，具有多态性高、信息含量丰富、共显性遗传等有点，被广泛应用于水产动物的种质鉴定、遗传结构分析、遗传连锁图谱构建、qtl定位等方面。有关罗氏沼虾ssr相关的研究工作已有开展，但大多集中在群体遗传结构评估方面，目前尚未见运用ssr标记对
罗氏沼虾体长性状进行关联分析的研究。
25.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning:a laboratory manual，3nded.(sambrook,2001)和current protocols in molecular biology(ausubel，2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是本发明不限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂。
26.下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
27.实施例1：筛选ssr标记
28.1、获得实验虾
29.通过群体随机交配繁殖出苗，设置养殖密度2万/亩，养殖4个月，随机起捕199尾虾，测定每尾虾的体长。剪取肌肉组织，固定于95％的乙醇中用于dna提取。
30.2、多态性ssr引物筛选
31.采用illumina hiseqtm 4000高通量测序平台对罗氏沼虾卵巢组织进行转录组测序，原始数据经经质控、组装后，拼接获得95379个unigenes，采用misa软件对unigenes进行ssr检测。选取重复次数在5次以上的三碱基、四碱基或五碱基重复序列，使用primer premier5.0软件进行引物设计，随机选择10个个体进行多态性ssr位点筛选，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
32.3、基因组dna提取
33.采用takara基因组抽提试剂盒对群体的样品进行基因组dna抽提，具体操作方法参照说明书，1％的琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测dna质量和浓度，dna样品保存于-20℃备用。
34.4、pcr扩增与荧光检测
35.pcr反应总体积为25μl，模板为基因组dna 50ng，其它组分根据taq酶(takara)说明书要求，在正向引物5
′
端标记荧光素fam(蓝色)。pcr反应条件如下：94℃2min；94℃30s，60℃45s，72℃2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。用abi3730xl(美国应用生物系统公司)dna分析仪对pcr产物进行自动荧光检测。
36.5、数据分析
37.用genemapper4.0软件生成每个位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型。popgene32计算等位基因数(numbers of the alleles，na)、有效等位基因数(numbers of the effective alleles，ne)、期望杂合度(expected heterozygosity，he)、观测杂合度(observed heterozygosity，ho)及hard-weinberg平衡检验(p值)。参照botstein等的方法计算多态信息含量(polymorphism information content，pic)。
38.利用spss17.0软件进行统计分析，首先对表型数据正态性检验，应用一般线性模型(general linear model，glm)进行微卫星位点与体长关联分析，并对同一位点不同基因型进行多重比较(lsd)。
39.共查找到18592个由一至六个核苷酸重复序列组成的ssr位点，占unigenes总数的比例为19.49％。单核苷酸重复类型比例最高，达52.71％，随后依次为二、三、四、五、六核苷酸重复类型，占比分别为32.61％、15.90％、0.80％、0.05％、0.04％。在单、二、三核苷酸重
复类型中，数量最多的重复基元分别为a/t(9407个)、ag/ga(2244个)、aat/ata/taa(344个)，数量最少的重复基元分别为c/g(392个)、cg/gc(12个)、cgg/ggc/gcg(15个)。随机选取了63个位点进行了多态性筛选，结果31个位点表现出多态，32个位点没有多态性，多态位点比例占49.2％。
40.在31个多态位点中，选取19个位点进行遗传多样性分析。结果显示，共检测到65个等位基因，平均等位基因数为3.4211，有效等位基因数为1.0901-4.2309，平均值为2.0941，观测杂合度为0.0854-0.6734，平均值为0.4105，期望杂合度为0.0826-0.7656，平均值为0.4496，多态信息含量为0.0805-0.7267，平均值为0.3882,6个位点pic值大于0.5,4个位点pic值小于0.25，9个位点的pic值在0.25至0.5之间，19个位点中，lszx008、lszx100、lszx107、lszx202、lszx207、lszx300、lszx304、lszx406与lszx605位点符合hard-weinberg平衡，其余10个位点显著(p＜0.05)或极显著(p＜0.01)偏离hard-weinberg平衡(表1)。
41.表1：群体遗传多样性分析信息表
[0042][0043][0044]
其中标记lszx001核心序列为(caagaa)n，标记lszx304核心序列为(cgtc)n，
[0045]
其中检测lszx001标记的引物，其上下游引物的序列信息如下：
[0046]
f:5
′‑
gaggagggtgaaggaacaca-3
′
、
[0047]
r:5
′‑
cctgatcttggtcttgtccc-3
′
；
[0048]
其中检测lszx304标记的引物，其上下游引物的序列信息如下：
[0049]
f:5
′‑
tcctggtttctgtggcctta-3
′
、
[0050]
r:5
′‑
tcgaggtcatttccacttcc-3
′
。
[0051]
两个位点扩增的基因型的信息如下表2所示。
[0052]
表2：lszx001和lszx304的基因型信息表
[0053][0054]
实施例2：与体长关联的ssr位点
[0055]
利用glm模型进行ssr位点与罗氏沼虾体长关联分析，结果显示，lszx001、lszx304两个ssr位点与体长显著相关(p＜0.05)(表3)。对具有显著差异的ssr位点进行不同基因型与体长多重比较，其中lszx001位点162/174基因型个体体长均值极显著低于其他基因型个体(p＜0.01)；而lszx304位点210/214基因型个体体长均值显著高于210/210、210/214基因型个体(p＜0.05)(表4)。
[0056]
表3：lszx001、lszx304位点与体长性状的关联性
[0057][0058]
注：表中数值为微卫星位点与体长关联分析的概率值，上标“*”代表体长性状与标记呈显著相关(p＜0.05)，上标“**”代表体长性状与标记呈极显著相关(p＜0.01)。
[0059]
表4：基因型与体长多重比较表
[0060][0061]
实施例3：两个位点在养殖群体中的验证
[0062]
随机抽取同塘养殖的一个养殖群体56尾虾，测定每尾虾的体长与体重，对筛选到的ssr标记进行验证。结果显示，lszx001位点的162/165或168/168或174/174或162/168或168/174的基因型个体体长显著高于162/174的基因型个体(p＜0.05)，体长平均高27.36％，162/165基因型高体长个体在体重方面显著高于162/174的基因型个体，体重平均高53.25％(表5)。lszx304位点的210/214基因型个体体长显著高于其他基因型个体(p＜0.05)，体长平均高12.59％，210/214基因型高体长个体在体重方面显著高于210/210和214/214基因型个体，体重平均高24.47％(表5)。
[0063]
表5两个位点在养殖群体中的验证结果
[0064][0065]
上述结果表明本发明中所筛选到的与体长相关标记可以快速准确筛选生长性状优良亲本用于罗氏沼虾育种，选择目标明确，省时省力。

技术特征：
1.一种与罗氏沼虾体长相关的ssr标记，其特征在于，所述的分子标记lszx001的核苷酸序列如下：gaggagggtgaaggaacacatggtgatggcattgaggaggaggagctctctaaagaagaggaacacattgaag agccaagtactgaacagaaggaa(caagaa)
n
gaacaacaagaacaggaacagggacaagaccaagatcagg；分子标记lszx304标记的核苷酸序列如下：cctggtttctgtggccttatatggtgaggtcactaccaaccaaggtcaggcggaccttgcgtacgtacattctctcttt ctccgggccaataagagtgcacattgacattcactt(cgtc)
n
gcctctgcaaaaatattcactggggttttatctcgttcggat cgttttctttgcccgagaggaagtggaaatgacctcga；其中n为3-5。2.用于检测权利要求1所述ssr标记的引物对在制备用于筛选罗氏沼虾高体长个体的检测试剂中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的检测对，其上游引物序列为5
′‑
gaggagggtgaaggaacaca-3
′
，下游引物序列为5
′‑
cctgatcttggtcttgtccc-3
′
；或上游引物序列为5
′‑
tcctggtttctgtggcctta-3
′
，下游引物序列为5
′‑
tcgaggtcatttccacttcc-3
′
。4.一种用于筛选高体长罗氏沼虾的方法，其特征在于，所述的方法是检测权利要求1所述的分子标记来筛选高体长的个体。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法，是通过pcr引物对进行扩增后，再对扩增产物进行测序后，对基因型进行分析完成的。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法，其步骤如下：1)提取待检测个体的基因组dna，2)pcr扩增与荧光检测：在正向引物5
′
端标记荧光素进行pcr反应，pcr产物进行自动荧光检测；3)数据分析用genemapper4.0软件生成位点的图谱文件，测出pcr扩增产物长度与荧光强度峰值，获得每个位点的基因型；根据基因型确定是否为高体长罗氏沼虾。7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法，是筛选lszx001标记的基因型是否为162/165、162/168、165/174、168/174、174/174或168/168的个体。8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法，是筛选lszx304标记的基因型是否为210/214的个体。

技术总结
本发明提供一种罗氏沼虾体长相关SSR标记，通过对罗氏沼虾转录组中的SSR位点进行了多态性筛选，而后进行SSR标记与体长关联分析，最终获得了与罗氏沼虾体长相关的SSR标记，为今后开展罗氏沼虾的分子标记辅助育种打下基础。本发明筛选获得的罗氏沼虾体长相关SSR标记是从转录组数据中筛选得到的多态性位点，与功能基因相关，可为后续与生长性状关联分析、遗传图谱构建，QTL定位等提供有力支持。QTL定位等提供有力支持。QTL定位等提供有力支持。


技术研发人员：陈雪峰 楼宝
受保护的技术使用者：浙江省农业科学院
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/24