一株短链和中长链PHA共聚物合成菌及其发酵培养方法和应用

一株短链和中长链pha共聚物合成菌及其发酵培养方法和应用
技术领域
1.本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一株短链和中长链pha共聚物合成菌及其发酵培养方法和应用。


背景技术：

2.聚羟基脂肪酸酯(pha)是微生物在不均衡生长条件下所产生的胞内聚酯，其具有良好的生物相容性和可降解性，是组织工程生物材料的重要组成部分。目前，已有很多研究报道了多种由不同微生物合成并具有不同结构的新pha。迄今为止，已发现150种以上的pha。现在人们对pha的生物合成途径已经有了很好的了解，并为提高pha的生物合成效率做了各种尝试。
3.pha作为一类高分子聚酯，是由羟基脂肪酸单体在细胞内经特定酶的催化通过酯键相互连接而形成的具有不同结构的聚酯。常见的pha单体有3-羟基丁酸(3hb或c4)、3-羟基戊酸(3hv或c5)、3-羟基己酸(3hhx或c6)、3-羟基辛酸(3ho或c8)、3-羟基癸酸(3hd或c10)和3-羟基十二酸(3hdd或c12)以及4-羟基丁酸(4hb)。
4.pha可根据不同单体碳链长度来进行分类，其中单体碳链长度在c3～c5之间的称为短链pha(short-chain-length pha，scl-pha)，目前研究较为广泛的phb就属于scl-pha，它的单体为3-羟基丁酸；而单体碳链长度在c6～c14之间则称为中长链pha(medium-chain-length pha，mcl-pha)。不同碳链长度的pha具有不同的物理性质，scl-pha具有结晶度高，脆性大及延展性差等特征，这使其应用受到很多限制。mcl-pha则具有较低的熔融温度(tm)和结晶度，这使得其具有较大的拉伸长度和较强的弹性，但机械强度相对较差。短链和中长链共聚的pha(scl-co-mcl pha)同时含有scl和mcl单体，因此其物理性质结合了两者的优点，具有更为广泛的发展前景和应用价值。
5.当前，生物塑料pha的应用受到了限制，主要是由于pha生产成本高，尤其是发酵底物和灭菌成本高。天然微生物一般只能合成scl-pha或mcl-pha。目前通过代谢工程策略也可以使假单胞菌等传统生产菌株积累scl-co-mcl pha，但是培养基和发酵设备需要进行严格灭菌，而且发酵所用碳源的价格高，因此，pha产量低、生产成本高。pha合成酶由phac基因编码，根据pha合成酶的底物特异性，可以分为三类：scl特异性pha合成酶、mcl特异性pha合成酶、低特异性pha合成酶。目前已知并用于生产的绝大多数pha合成酶都属于前两类，只能特异性结合scl单体或mcl单体。仅有少数几种phac被发现能够同时聚合scl单体和mcl单体，因此具有低特异性。当前，缺乏优良的scl-co-mcl pha生产菌株和低特异性pha合成酶已成为制约scl-co-mcl pha研究及其产业化的关键因素。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一株短链和中长链pha共聚物(scl-co-mcl pha)合成菌及其应用，具有较高的合成产量。
7.本发明的目的还在于提供一种短链和中长链pha共聚物合成菌的发酵培养方法，通过采用开放式连续发酵模式，同时使用特异性底物进行发酵，能够大大提高短链和中长链pha共聚物的产量和细胞干重，降低pha生产成本。
8.本发明提供了一株短链和中长链pha共聚物合成菌，所述合成菌为渴望盐单胞菌(halomonas cupida)j9菌株，保藏编号为cgmcc no.24707。
9.本发明提供了一种生产短链和中长链pha共聚物的菌剂，包括所述短链和中长链pha共聚物合成菌和辅料。
10.本发明提供了葡萄糖和/或甘油作为碳源在所述合成菌发酵生产短链和中长链pha共聚物中的应用。
11.优选的，所述短链和中长链pha共聚物的分子量为500 000～600 000；
12.所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；
13.所述羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％～96％，所述羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％～6％。
14.本发明提供了葡萄糖和/或甘油作为碳源在制备所述合成菌生产短链和中长链pha共聚物的发酵培养基中的应用。
15.优选的，所述发酵培养基为碳源30g/l、酵母提取物1g/l、nh4cl 2g/l、mgso
4 0.2g/l、na2hpo4·
12h2o 9.65g/l、kh2po
4 1.5g/l、nacl 60～100g/l。
16.本发明提供了一种基于所述合成菌或所述菌剂发酵生产短链和中长链pha共聚物的方法，包括以下步骤：
17.将活化的所述合成菌的菌种接种至发酵培养基中好氧培养，在36～38℃下振荡培养45～52h；
18.所述发酵培养基为碳源30g/l、酵母提取物1g/l、nh4cl 2g/l、mgso
4 0.2g/l、na2hpo4·
12h2o 9.65g/l、kh2po
4 1.5g/l、nacl60～100g/l、10ml/l微量元素溶液i和1ml/l微量元素溶液ii；
19.所述碳源为葡萄糖和/或甘油。
20.本发明提供了所述渴望盐单胞菌j9菌株来源的pha合成酶和底物在合成短链和中长链pha共聚物中的应用，所述pha合成酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。
21.优选的，所述底物为3hdd-coa和/或3hb-coa。
22.优选的，所述短链和中长链pha共聚物的分子量为500 000～600 000；
23.所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；
24.所述羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％～96％，所述羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％～6％。
25.本发明提供了一株短链和中长链pha共聚物合成菌，为渴望盐单胞菌j9菌株，该菌株具有高效合成短链和中长链pha共聚物的生物学功能，通过gc-ms来检测产物单体组成，短链和中长链pha共聚物包含短链的羟基丁酸酯(c4)和长链的羟基月桂酸酯(c12)两种单体，产量最大达到2.0g/l以上，填补了嗜盐菌低成本合成短链和中长链pha共聚物的空白。同时菌株产短链和中长链pha共聚物的营养要求简单，遗传稳定，且培养方式简单易行，具
有良好的应用前景。
26.本发明提供了葡萄糖和/或甘油作为碳源在所述合成菌发酵生产短链和中长链pha共聚物中的应用。本发明验证以葡萄糖和/或甘油作为碳源使所述合成菌能高效发酵生产短链和中长链pha共聚物，同时提高细胞干重。本发明证明所述j9菌株产pha共聚物的营养要求简单，遗传稳定，培养方式易行，培养无需严格无菌环境，解决了当前pha生产成本高的劣势，具有良好的应用前景。
27.本发明提供了所述渴望盐单胞菌j9菌株来源的低特异性pha合成酶(phac)和底物在合成短链和中长链pha共聚物中的应用，所述phac的氨基酸序列如seq id no:2所示。本发明通过酶底物特异性验证实验来证实j9中的pha合成酶属于低特异性pha合成酶，为今后通过人工设计创造出能识别短链和各种中长链单体的低特异性phac以及利用构建的嗜盐菌细胞工厂定制化合成含有不同中长链单体的scl-co-mclpha奠定理论基础。
附图说明
28.图1为基于16s rrna分析构建的菌株j9的系统发育树，根据16s rrna序列，选取了物种水平上彼此最接近的19株菌株，采用mega 11.0和neighbor-joining法构建系统发育树，j9菌株与halomonas cupida显示出大于99％的相似性，序列的注册号是从genbank获得的；
29.图2为以葡萄糖(a)或甘油(b)为碳源，分别在盐浓度为6％、8％和10％(w/v)的条件下发酵，j9菌株的细胞干重(cdw)和pha含量(wt％)；每个实验重复三次，其中*，**和***分别表示p《0.05，p《0.005和p《0.001；
30.图3为通过gc-ms鉴定j9菌株积累的pha组分和单体鉴定结果；
31.图4为j9菌株开放式发酵摇瓶实验结果，使用葡萄糖(a)或甘油(b)为底物，发酵过程灭菌和不灭菌条件下细胞生长曲线(左)和j9菌株的细胞干重和pha产量(wt％)(右)；(c)使用葡萄糖(1～5)或甘油(16～30)作为底物在48小时未灭菌发酵后挑取菌株的pcr鉴定结果；引物是根据h.cupida j9的特殊序列设计的；m：标记物，pc：阳性对照，nc1：e.coli jm110为阴性对照，nc2：ddh2o为空白对照，1～30：随机选择的菌落的pcr结果。生长曲线和pcr扩增的结果显示，在8％或10％nacl(w/v)培养条件下没有杂菌污染。此外，开放式发酵后的细胞干重和pha产量略好于非开放式发酵；
32.图5为j9菌株基因组圈图；
33.图6为j9菌株中的pha合成途径及甘油代谢途径的推测图；
34.图7为phac
j9
蛋白模型构建结果图；
35.图8为3hb-coa与phac的结合模式；(a)3hb-coa与phac的二维结合模式；(b)3hb-coa与phac的表面结合模式；(c)3hb-coa与phac的三维结合模式；其中3hb-coa表示为青色棍棒模型，结合口袋周围的残基表示为黄色棍棒模型，受体的主链表示为灰色卡通，氢键以红色虚线表示；
36.图9为3hdd-coa与phac的结合模式；(a)3hdd-coa与phac的二维结合模式；(b)3hdd-coa与phac的表面结合模式；(c)3hdd-coa与phac的三维结合模式。其中3hdd-coa表示为青色棍棒模型，结合口袋周围的残基表示为黄色棍棒模型，受体的主链表示为灰色卡通，氢键以红色虚线表示；
37.图10为纯化鉴定n-末端6
×
his标记的phac
j9
，(a)蛋白质印迹(western-blotting)和(b)sds-page显示了phac
j9
的成功表达，m：marker，nc：阴性对照，e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac的细胞裂解物，泳道1：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac的细胞裂解物，泳道2：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac细胞裂解物的上清液，泳道3：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac细胞裂解物的沉淀，泳道4：纯化后的蛋白phac
j9
，蛋白大小用kda为单位；
38.图11为纯化鉴定n-末端6
×
his标记的phac
j9-ala489结果，(a)蛋白质印迹(western-blotting)和(b)sds-page显示了phac
j9
的成功表达；m：marker，nc：阴性对照，e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的细胞裂解物，泳道1：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489的细胞裂解物，泳道2：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489细胞裂解物的上清液，泳道3：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489细胞裂解物的沉淀，泳道4：纯化后的蛋白phac
j9
，蛋白大小用kda为单位；
39.图12为天然phac
j9
和突变phac
j9
体外酶活测定实验，使用e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的细胞裂解物作为阴性对照，*表示p《0.05。
40.生物保藏信息
41.渴望盐单胞菌(halomonas cupida)j9，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022.4.18。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，生物保藏编号为cgmcc no.24707。
具体实施方式
42.本发明提供了一株短链和中长链pha共聚物合成菌，所述合成菌为渴望盐单胞菌(halomonas cupida)j9菌株，保藏编号为cgmcc no.24707。
43.在本发明中，所述渴望盐单胞菌j9菌株分离自高盐废水中，16s rdna鉴定，确定为渴望盐单胞菌菌属菌种，j9菌株的16s rdna的核苷酸序列如seq id no:1所示。所述渴望盐单胞菌j9菌株的形态特征为在固体lb平板上表现为菌落呈圆形，边缘整齐，较粘稠，且不透明。综合形态学鉴定和分子鉴定结果，分离的j9菌株为渴望盐单胞菌，进行生物保藏至中国微生物研究所。
44.在本发明中，j9菌株能够在6％～10％的nacl浓度下利用葡萄糖或者甘油，开放式发酵生产pha；且该菌株发酵培养合成的pha为短链和中长链pha共聚物，所述短链和中长链pha共聚物的分子量为500 000～600 000；所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；所述羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％～96％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％～6％。
45.本发明提供了一种生产短链和中长链pha共聚物的菌剂，包括所述短链和中长链pha共聚物合成菌和辅料。
46.在本发明中，所述菌剂的剂型包括粉剂或水剂。所述辅料根据菌剂的剂型不同而有所差异。本发明对所述菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的菌剂的制备方法即可。
47.本发明提供了葡萄糖和/或甘油作为碳源在所述合成菌发酵生产短链和中长链pha共聚物中的应用。
48.在本发明中，葡萄糖和甘油均能够作为碳源为所述合成菌的发酵过程提供营养，并且实验表明在相同浓度下，葡萄糖比甘油在提高短链和中长链pha共聚物的产量方面更具有优势。葡萄糖和/或甘油的浓度优选为28～32g/l，更优选为30g/l。
49.在本发明中，所述发酵生产过程中，发酵培养基中盐浓度优选为4％～19％，更优选为6％～10％，最优选为8％～10％。不同碳源种类和盐度浓度组合，发酵生产pha共聚物的产量有差异，例如本发明实施例记载，当葡萄糖作为碳源时，j9菌株在盐浓度为8％(w/v)时发酵后，得到32.225
±
0.275wt％(pha共聚物占细胞干重的质量百分比)的pha共聚物产量，高于盐浓度为6％(w/v)(31.25
±
0.35wt％)和10％(w/v)(29.95
±
0.4wt％)时的发酵结果。而以碳源为甘油时，j9在发酵后所得的pha共聚物产量随着盐浓度的增大而增大，在nacl浓度为10％(w/v)的情况下得到了最大的pha共聚物产量，分别为28.555
±
0.425wt％，高于盐浓度为6％(w/v)(16.005
±
0.225wt％)和8％(w/v)(24
±
0.12wt％)时的发酵结果。
50.在本发明中，葡萄糖和/或甘油作为碳源在所述合成菌发酵中能有效提高细胞干重。在本发明实施例中，当葡萄糖作为碳源时，j9菌株在盐浓度为8％(w/v)时发酵后，得到6.0015
±
0.0235g/l的细胞干重，高于盐浓度为6％(w/v)的细胞干重(4.075
±
0.125g/l)和10％(w/v)(5.839
±
0.021g/l)时的发酵结果。而以碳源为甘油时，j9在发酵后所得的细胞干重随着盐浓度的增大而增大，在nacl浓度为10％(w/v)的情况下得到了最大的细胞干重，为3.8375
±
0.0375g/l，高于盐浓度为6％(w/v)(2.885
±
0.015g/l)和8％(w/v)(3.1
±
0.05g/l)时的发酵结果。
51.本发明提供了葡萄糖和/或甘油作为碳源在制备所述合成菌生产短链和中长链pha共聚物的发酵培养基中的应用。
52.在本发明中，所述发酵培养基优选为碳源30g/l、酵母提取物1g/l、nh4cl 2g/l、mgso
4 0.2g/l、na2hpo4·
12h2o 9.65g/l、kh2po
4 1.5g/l、nacl 60～100g/l、10ml/l微量元素溶液i和1ml/l微量元素溶液ii。所述碳源优选为葡萄糖和葡萄糖与甘油组成的混合物。所述nacl的浓度优选为80g/l。所述发酵培养基优选以葡萄糖为碳源，nacl的浓度为80g/l。
53.本发明提供了一种基于所述合成菌或所述菌剂发酵生产短链和中长链pha共聚物的方法，包括以下步骤：
54.将活化的所述合成菌的菌种接种至发酵培养基中好氧培养，在36～38℃下振荡培养45～52h；
55.所述发酵培养基为碳源30g/l、酵母提取物1g/l、nh4cl 2g/l、mgso
4 0.2g/l、na2hpo4·
12h2o 9.65g/l、kh2po
4 1.5g/l、nacl 60～100g/l；
56.所述碳源为葡萄糖和/或甘油。
57.在本发明中，所述合成菌的菌种的培养方法，优选包括以下步骤：
58.将j9菌株接种至60-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时，得到活化的菌株；
59.将所述活化的菌株接种至种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时，得到合成菌的菌种。
60.在本发明中，所述60-lb固体培养基优选如下：25g/l lb-mix、60g/l nacl、2g/l的琼脂，调整ph值为9.0。将配制的培养基在121℃，灭菌20min，备用。
61.在本发明中，所述好氧培养包括摇瓶振荡培养和开放式发酵。所述摇瓶振荡培养的转速优选为160～200rpm，更优选为180rpm。所述开放式发酵优选为利用摇瓶或发酵罐进
行发酵。利用发酵罐进行发酵时，溶解氧优选为50％，通气量优选为3l/min。
62.本发明提供了所述渴望盐单胞菌j9菌株来源的phac酶和底物在合成短链和中长链pha共聚物中的应用，所述phac酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。
63.在本发明中，所述底物优选为3hdd-coa和/或3hb-coa。本发明实施例证明，通过渴望盐单胞菌(halomonas cupida)j9全基因组测序、组装、基因注释及代谢途径推测，筛选pha合成酶phac
j9
，经过同源建模，选择得分最好的临时户模型作为最终模型，分别以3hb-coa和3hdd-coa作为底物与phac
j9
模拟分子对接，结合自由能最低的构象被选为最佳的结合模式。体外酶活实验证明，重组phac
j9
酶能有效催化3hdd-coa底物的聚合。通过定点突变，phac
h489a
不能有效催化3hdd-coa底物的聚合，这表明his
489
位点是phac酶与3hdd-coa底物结合的关键氨基酸残基。所述短链和中长链pha共聚物的特征与上述相同，在此不做赘述。
64.下面结合实施例对本发明提供的一株短链和中长链pha共聚物合成菌及其发酵培养方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
65.本发明所涉及的培养基和溶液配制方法：
66.富集培养基100-m9(g/l)：na2hpo4·
12h2o，17.11；kh2po4，3；nh4cl，1；mgso4，0.12；nacl，100。含0.4％葡萄糖，115℃，30min灭菌后加入培养基，ph＝7.0。
67.种子培养基：60-lb、80-lb、100-lb。
68.60-lb：取25g/l的lb-mix于蒸馏水中，加入60g/l nacl，调整ph为9.0，固体培养基再加入2g/l的琼脂，121℃，灭菌20min。
69.80-lb：取25g/l的lb-mix于蒸馏水中，加入80g/l nacl，调整ph为9.0，固体培养基再加入2g/l的琼脂，121℃，灭菌20min。
70.100-lb：取25g/l的lb-mix于蒸馏水中，加入100g/l nacl，调整ph为9.0，固体培养基再加入2g/l的琼脂，121℃，灭菌20min。
71.等渗的pbs缓冲液：3.58g/l na2hpo4·
12h2o；0.272g/l kh2po4；0.2g/l kcl；需要时分别加入60g/l、80g/l和100g/l的nacl，121℃，灭菌20min。
72.发酵培养基：60-mmg、80-mmg、100-mmg。
73.60-mmg：碳源30g/l；酵母提取物，1g/l；nh4cl，2g/l；mgso4，0.2g/l；na2hpo4·
12h2o，9.65g/l；kh2po4，1.5g/l；nacl浓度为60g/l；10ml/l微量元素溶液i；1ml/l微量元素溶液ii。碳源使用葡萄糖或甘油，分别配制成母液，115℃，30min灭菌后按终浓度加入培养基。使用5mnaoh调整培养基ph至9.0。其中10ml/l微量元素溶液i(g/l)：fe(iii)-nh
4-citrate，5；cacl2，2；hcl浓度为1m。1ml/l微量元素溶液ii(mg/l)：znso4·
7h2o，100；mncl2·
4h2o，30；h3bo3，300；cocl2·
6h2o，200；cuso4·
5h2o，10；nicl2·
6h2o，20；namoo4·
2h2o，30；hcl浓度为1m。
74.80-mmg：碳源30g/l；酵母提取物，1g/l；nh4cl，2g/l；mgso4，0.2g/l；na2hpo4·
12h2o，9.65g/l；kh2po4，1.5g/l；nacl浓度为80g/l；10ml/l微量元素溶液i；1ml/l微量元素溶液ii。碳源使用葡萄糖或甘油，分别配制成母液，115℃，30min灭菌后按终浓度加入培养基。使用5mnaoh调整培养基ph至9.0。其中10ml/l微量元素溶液i(g/l)：fe(iii)-nh
4-citrate，5；cacl2，2；hcl浓度为1m。1ml/l微量元素溶液ii(mg/l)：znso4·
7h2o，100；mncl2·
4h2o，30；h3bo3，300；cocl2·
6h2o，200；cuso4·
5h2o，10；nicl2·
6h2o，20；namoo4·
2h2o，30；hcl浓度为1m。
75.100-mmg：碳源30g/l酵母提取物，1g/l；nh4cl，2g/l；mgso4，0.2g/l；na2hpo4·
12h2o，9.65g/l；kh2po4，1.5g/l；nacl浓度为100g/l。碳源使用葡萄糖或甘油，分别配制成母液，115℃，30min灭菌后根据终浓度加入培养基。使用5m naoh调整培养基ph至9.0。10ml/l微量元素溶液i(g/l)：fe(iii)-nh
4-citrate，5；cacl2，2；hcl浓度为1m。1ml/l微量元素溶液ii(mg/l)：znso4·
7h2o，100；mncl2·
4h2o，30；h3bo3，300；cocl2·
6h2o，200；cuso4·
5h2o，10；nicl2·
6h2o，20；namoo4·
2h2o，30；hcl浓度为1m。
76.bufferi(g/l)：50mm tris-cl，ph7.9；0.5mm edta，50mm nacl，5％甘油。
77.实施例1
78.一株渴望盐单胞菌j9菌株分离和鉴定方法
79.1筛选分离方法
80.采集金城医药高盐废水池中的活性污泥，以10％(w/v)的接种量将新鲜的活性污泥接种到含有100g/lnacl的m9培养基(100-m9)中，ph为7.0。在30℃，180r/min条件下富集3天，将富集物用等渗的pbs梯度稀释至10-1
～10-5
，稀释液分别涂布于100-m9和100-lb固体平板上，挑取单菌落若干株传代纯化，得到j9菌株。
81.2鉴定方法
82.在光学显微镜下观察菌落形态，形态学特征为：在固体lb平板上表现为菌落呈圆形，边缘整齐，较粘稠，且不透明。
83.收集菌落进行16srdna鉴定，测序结果如seq id no:1所示。经序列比对与渴望盐单胞菌菌(halomonas cupida)相似度最高。使用mega 11.0和neighbor-joining算法构建系统发育树。
84.结果见图1。综合形态学和分子鉴定结果，j9菌株命名为：渴望盐单胞菌(halomonas cupida)j9菌株，保藏至中国微生物保藏中心，保藏编号为保藏编号为cgmccno.24707。
85.实施例2
86.一种渴望盐单胞菌j9菌株以葡萄糖为碳源的发酵培养与产物检测方法
87.①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9菌株至60-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时；
88.②
种子培养：将固体培养基活化的菌株接种至100ml种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时；
89.③
摇瓶发酵：以5％的接种量将od
600
为2的种子液接入含6％nacl的发酵培养基中，37℃，180r/min振荡培养48小时；
90.④
将发酵液8000r/min，4℃离心20min，弃去上清，收集菌体，将冻干的菌体进行称重，得到细胞干重；
91.⑤
pha含量测定与单体鉴定方法：称取100mg细胞干重溶于4ml氯仿中，充分溶解后加入4ml酯化液(酯化液中甲醇与浓硫酸的比例为1.7:0.3，并加入1g/l的苯甲酸标准品作为内参)混匀，利用gc-ms(agilent z7890boufitted with a 5977bmsd)检测，gc-ms具体检测条件：使用hp-5毛细管柱，载气为氦气(流速1.0555ml/min)，进样口温度250℃，传输管温度280℃，进样量0.8μl，采用分流模式(分流比50:1)。柱温80℃开始，停留1min，然后以10℃/min的速率升温至250℃后，停留3min。柱压10psi开始，停留1.5min，然后以2.5psi/min
升至20psi，停留1.5min。使用nist数据库分析并将保留时间与标准进行比较，以确定pha的单体成分。通过定量比较待测样品和标准品在相同保留时间下的出峰面积，计算样品中各个单体的质量，具体计算公式为：pha含量(wt％)＝(s样品峰/s苯甲酸峰/s标准品峰/s苯甲酸峰)*v氯仿/m样品*100％。最终可以得到pha单体组成与含量。
92.所述短链和中长链pha共聚物的分子量为550 000；所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；羟基丁酸酯的摩尔百分含量为96％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％。
93.实施例3
94.渴望盐单胞菌j9菌株以葡萄糖为碳源的发酵培养与产物检测方法
95.按照实施例2的方法进行发酵培养，区别仅在于采用含8％nacl的发酵培养基进行。
96.短链和中长链pha共聚物的分子量为550000。所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯。所述羟基丁酸酯的摩尔百分含量为96％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％。
97.实施例4
98.一种渴望盐单胞菌j9菌株以葡萄糖为碳源的发酵培养与产物检测方法
99.按照实施例2的方法进行发酵培养，区别仅在于采用含10％nacl的发酵培养基进行。
100.短链和中长链pha共聚物的分子量为550 000。所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；羟基丁酸酯的摩尔百分含量为96％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％。
101.实施例5
102.一种渴望盐单胞菌j9菌株以甘油为碳源的发酵培养与产物检测：
103.①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9菌株至60-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时；
104.②
种子培养：将固体培养基活化的菌株接种至100ml种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时；
105.③
摇瓶发酵：以5％的接种量将种子液接入含6％nacl的发酵培养基中，37℃，180r/min振荡培养48小时；
106.④
将发酵液8000r/min，4℃离心20min，弃去上清，收集菌体，将冻干的菌体进行称重，得到细胞干重；
107.⑤
pha含量测定与单体鉴定方法：称取100mg细胞干重溶于4ml氯仿中，充分溶解后加入4ml酯化液(酯化液中甲醇与浓硫酸的比例为1.7:0.3，并加入1g/l的苯甲酸标准品作为内参)混匀，利用gc-ms检测，gc-ms具体检测条件：使用hp-5毛细管柱，载气为氦气(流速1.0555ml/min)，进样口温度250℃，传输管温度280℃，进样量0.8μl，采用分流模式(分流比50:1)。柱温80℃开始，停留1min，然后以10℃/min的速率升温至250℃后，停留3min。柱压10psi开始，停留1.5min，然后以2.5psi/min升至20psi，停留1.5min。使用nist数据库分析并将保留时间与标准进行比较，以确定pha的单体成分。通过定量比较待测样品和标准品在相同保留时间下的出峰面积，计算样品中各个单体的质量，具体计算公式为：pha含量
(wt％)＝(s样品峰/s苯甲酸峰/s标准品峰/s苯甲酸峰)*v氯仿/m样品*100％。
108.短链和中长链pha共聚物的分子量为550000。所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯。羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为6％。
109.实施例6
110.一种渴望盐单胞菌j9菌株以甘油为碳源的发酵培养与产物检测方法
111.按照实施例5的方法进行发酵培养，区别仅在于采用含8％nacl的发酵培养基进行。
112.短链和中长链pha共聚物的分子量为550000。所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯。羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为6％。
113.实施例7
114.一种渴望盐单胞菌j9以甘油为碳源的发酵培养与产物检测方法
115.按照实施例5的方法进行发酵培养，区别仅在于采用含10％nacl的发酵培养基进行。
116.所述短链和中长链pha共聚物的分子量为550 000。短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯。羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％，羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为6％。
117.实施例2～7的发酵结果见图2。图2为以葡萄糖(a)或甘油(b)为碳源，分别在盐浓度为6％、8％和10％(w/v)的条件下发酵，j9菌株的细胞干重(cdw)和pha含量(wt％)结果。葡萄糖作为碳源时，j9菌株在盐浓度为8％(w/v)时发酵后，得到6.0015
±
0.0235g/l的细胞干重和32.225
±
0.275wt％的pha产量，高于盐浓度为6％(w/v)(4.075
±
0.125g/l，31.25
±
0.35wt％)和10％(w/v)(5.839
±
0.021g/l，29.95
±
0.4wt％)时的发酵结果。而以碳源为甘油时，j9在发酵后所得的细胞干重和pha产量随着盐浓度的增大而增大，在nacl浓度为10％(w/v)的情况下得到了最大的细胞干重和pha产量，分别为3.8375
±
0.0375g/l和28.555
±
0.425wt％，高于盐浓度为6％(w/v)(2.885
±
0.015g/l,16.005
±
0.225wt％)和8％(w/v)(3.1
±
0.05g/l，24
±
0.12wt％)时的发酵结果。
118.图3结果表明通过gc-ms鉴定j9菌株积累的pha组分，同时将保留时间与标准品3-羟基丁酸甲酯(a)和3-羟基十二烷酸甲酯(b)进行比较，使用葡萄糖(c)或甘油(d)作为底物在37℃，180r/min下发酵48小时后收集冻干细胞酯化处理后上样。结果显示，j9菌株所产pha的产物峰存在c4和c12单体结构。通过对j9发酵后冻干细胞进行酯化，并将酯化后产物进行gc-ms检测，检测见过显示发酵产物pha包括c4和c12单体组成。gc-ms具体检测条件：使用hp-5毛细管柱，载气为氦气(流速1.0555ml/min)，进样口温度250℃，传输管温度280℃，进样量0.8μl，采用分流模式(分流比50:1)。柱温80℃开始，停留1min，然后以10℃/min的速率升温至250℃后，停留3min。柱压10psi开始，停留1.5min，然后以2.5psi/min升至20psi，停留1.5min。使用nist数据库分析并将保留时间与标准进行比较，以确定pha的单体成分。
119.对比例1
120.传统的发酵方案(以葡萄糖作为碳源)
121.步骤一培养基灭菌：将lb培养基、磷酸缓冲液pbs和m9gpha发酵培养基用蒸馏水配
制，115℃，灭菌30min，以葡萄糖作为碳源；
122.步骤二菌株活化：将保存于-80℃的pseudomonas putida ktu及其衍生菌株在lb平板上划线活化；挑取单菌落于5mllb液体试管中，30℃，180r/min过夜培养；
123.步骤三种子液培养：将上步菌液以1％的接种量转接到含有100ml的lb液体培养基的500ml三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养约12h，取1ml菌液在紫外分光光度计下测定od
600
数值；
124.步骤4菌体收集与发酵：将种子液全部倒入已灭菌的250ml离心筒中，8000r/min，4℃离心4min。弃去培养基，用适量的磷酸盐缓冲液pbs对菌体进行洗涤。混匀后，再次8000r/min，4℃离心4min；
125.步骤四发酵：彻底弃去上清，取适量的pbs缓冲液重悬菌体，混合均匀。以1％的接种量将菌液转接到m9g pha发酵培养基中，发酵液初始od
600
为0.1，30℃，180r/min发酵60h。
126.菌株ktu发酵后可得到2.941
±
0.151g/l的细胞干重(cdw)，其中pha含量(wt％)为21.40
±
1.577％。
127.实施例8
128.渴望盐单胞菌j9菌株以葡萄糖为碳源利用摇瓶进行开放式发酵的方法
129.①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9至80-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时；
130.②
种子培养：将固体培养基活化的菌株接种至100ml种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时；
131.③
摇瓶发酵：以5％的接种量将种子液接入以葡萄糖为碳源，含8％nacl的发酵培养基(配方同80-mmg)中，37℃，180r/min振荡培养48小时；
132.④
取培养48小时后的发酵液稀释涂布含6％nacl的lb培养基，随机挑取单菌落使用j9的特异性检测引物进行pcr验证；其中pcr体系如下：
[0133][0134]
pcr反应条件：
[0135][0136]
j9菌株特异性检测引物：
[0137]
j9-f ctgagcgagaacggaaacccaacgc(seq id no：3)
[0138]
j9-r ccgttccgccatctttgttcgctgc(seq id no：4)
[0139]
⑤
scl-co-mcl pha的检测：按照实施例2方法采用gc-ms检测pha单体组成与含量。
[0140]
实验过程中使用的全部试剂及设备均无需灭菌，配制培养基使用未灭菌的蒸馏水。
[0141]
实施例9
[0142]
渴望盐单胞菌j9菌株以甘油为碳源利用摇瓶进行开放式发酵的方法
[0143]
①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9至100-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时；
[0144]
②
种子培养：将固体培养基活化的菌株接种至100ml种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时；
[0145]
③
摇瓶发酵：以5％的接种量将种子液接入以甘油为碳源，含8％nacl的发酵培养基(配方同80-mmg)中，37℃，180r/min振荡培养48小时；
[0146]
④
取培养48小时后的发酵液稀释涂布含6％nacl的lb培养基，随机挑取单菌落使用j9的特异性检测引物进行pcr验证；验证方法同实施例8；
[0147]
⑤
scl-co-mcl pha的检测：gc-ms检测；pha单体组成与含量。实验过程中使用的全部试剂及设备均无需灭菌，配制培养基使用未灭菌的蒸馏水。
[0148]
实施例10
[0149]
渴望盐单胞菌j9以葡萄糖为碳源利用5-l发酵罐进行开放式发酵的方法
[0150]
①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9至100-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时；
[0151]
②
种子培养：将固体培养基活化的菌株接种至100ml种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时；
[0152]
③
5-l发酵罐发酵：以1％的接种量将种子液接入以葡萄糖为碳源，含8％nacl的发酵培养基(配方同80-mmg)中，37℃，通气量为3l/min，溶氧量为50％，搅拌速度为200r/min至800r/min，使用5m naoh和5m naoh将ph保持在9.0。振荡培养48小时；
[0153]
④
取培养48小时后的发酵液稀释涂布含6％nacl的lb培养基，随机挑取单菌落使用j9的特异性检测引物进行pcr验证；验证方法同实施例8；
[0154]
⑤
scl-co-mcl pha的检测：gc-ms检测；pha单体组成与含量。实验过程中使用的全部试剂及设备均无需灭菌，配制培养基使用未灭菌的蒸馏水。
[0155]
实施例11
[0156]
渴望盐单胞菌j9菌株以甘油为碳源利用5-l发酵罐进行开放式发酵：
[0157]
①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9菌株至100-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时；
[0158]
②
种子培养：将固体培养基活化的菌株接种至100ml种子培养基中，37℃，180r/min振荡培养12小时；
[0159]
③
5-l发酵罐发酵：以1％的接种量将种子液接入以甘油为碳源，含10％nacl的发酵培养基中，37℃，通气量为3l/min，溶氧量为50％，搅拌速度为200r/min至800r/min，使用5m naoh和5m naoh将ph保持在9.0。振荡培养48小时；
[0160]
④
取培养48小时后的发酵液稀释涂布含6％nacl的lb培养基，随机挑取单菌落使用j9的特异性检测引物进行pcr验证；验证方法同实施例8；
[0161]
⑤
scl-co-mcl pha的检测：gc-ms检测；pha单体组成与含量。实验过程中使用的全部试剂及设备均无需灭菌，配制培养基使用未灭菌的蒸馏水。
[0162]
实施例8～9的检测结果见图4。图4为使用葡萄糖(a)或甘油(b)为底物j9菌株进行摇瓶开放式发酵实验结果，其中发酵过程灭菌和不灭菌条件下细胞生长曲线(左)和j9菌株的细胞干重和pha产量(wt％)(右),使用葡萄糖(泳道1～15)或甘油(泳道16～30)作为底物在48小时未灭菌发酵后挑取菌株的pcr鉴定结果(c)，其中引物是根据j9菌株的特殊序列设计的。m：标记物，pc：阳性对照，nc1：e.coli jm110为阴性对照，nc2：ddh2o为空白对照，1～30：随机选择的菌落的pcr结果。生长曲线和pcr扩增的结果显示，在8％或10％nacl(w/v)培养条件下没有杂菌污染。此外，开放式发酵后的细胞干重和pha产量略好于非开放式发酵。
[0163]
实施例10-11中5-l发酵罐开放式发酵结果：以葡萄糖为碳源，在含8％nacl的发酵培养基mmg中发酵48小时后，得到了细胞干重为11.45g/l，含有2.35g/l pha共聚物。
[0164]
实施例12
[0165]
渴望盐单胞菌j9菌株全基因组测序、组装、基因注释及代谢途径的研究
[0166]
①
菌株活化：接种渴望盐单胞菌j9菌株至60-lb固体培养基，在37℃恒温培养12小时。挑取单菌落转接至5ml60-lb液体培养基，37℃，180r/min培养过夜。以1％的接种量将活化好的菌液转接至100ml60-lb，37℃，180r/min培养12小时后，12000r/min离心1min收集菌体；
[0167]
②
dna提取：按照基因组dna纯化试剂盒(promega)说明书进行基因组dna提取。纯化的基因组dna使用nanodrop 2000检验纯度，使用quantus fluorometer(picogreen)检验浓度，使用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检验dna完整性。
[0168]
③
illumina文库构建及测序：取至少1μg基因组dna，利用covaris进行基因组dna片段化，将dna样本剪切成约400bp的片段，琼脂糖凝胶鉴定片段大小分布，富集300-500bp范围的基因组片段，使用nextflex
tm
rapid dna-seq试剂盒进行文库制备。制备的文库在illumina hiseq x ten仪器上进行双端测序(2
×
150bp)。
④
单分子文库构建及测序:取至少15μg基因组dna，利用g-tubes(covaris，ma)将基因组dna处理成～10kb的片段，然后根据pacbio说明书(pacific biosciences，ca)进行片段纯化，末端补平，两端分别连接smrt bell测序接头。得到的测序文库用0.45倍体积的agencourt ampure xp beads(beckman coulter genomics，ma)试剂进行三次纯化，然后，将文库单链环退火，结合到固定的zmw(zero-mode waveguides，零模波导孔)底部的聚合酶上，加入测序反应试剂，每个碱基配对合成后会发出相应的光并被检测，每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰，配上高分辨率的光学检测系统，进行实时检测。
⑤
基因组组装：二代测序数据原始数据(raw data)以fastq格式储存，为了使后续的组装更加准确，会对原始数据进行质量剪切，去除测序质量较低、含n比例较高及质量修剪后长度较小的reads，得到高质量的clean data。利用canu及hgap软件进行pacbio数据组装，将reads组装成contigs，然后判断成环，得到完整的染色体和质粒基因组。最后利用illumina测序数据对组装结果进行校正，并判断环状基因组的起始位点。
[0169]
⑥
genbank序列号获取：将j9全基因组序列上传ncbi官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并获取genbank序列号：cp094345。
[0170]
⑦
利用glimmer对基因组中的编码序列(cds)进行预测，质粒基因采用genemarks
软件预测，trnascan-se进行trna预测，barrnap进行rrna预测。利用blastp、diamond、hmmer等序列比对工具，从nr、swiss-prot、pfam、go、cog、kegg数据库中对预测到的cds进行功能注释。
[0171]
⑧
代谢途径推测：通过基因注释信息对pha相关合成途径进行推测。
[0172]
图5为j9菌株基因组圈图。j9菌株的全基因大小为5,340,780bp，gc含量为59.73％，共编码4976个开放阅读框，其中4191个基因得到了cog(cluster of orthologous group，直源同系簇)注释。在得到cog注释的基因中，约有1/3的基因功能未知，说明嗜盐菌尚存在许多值得探索的生命功能。大多数功能明确的蛋白质集中于氨基酸、碳水化合物、无机离子、脂质、辅酶等的转运和代谢，能量代谢和细胞膜合成，以及染色体的复制、转录、翻译及蛋白质的合成修饰。从外到内圆圈对应的信息依次为基因组大小标识、正链、负链上的基因信息、ncrna、gc含量、gc-skew。j9菌株的全基因组genbank序列号为cp094345。
[0173]
图6为j9菌株中pha合成途径及甘油代谢途径的推测图。phaa；β-酮基硫解酶；phab；乙酰乙酰辅酶a还原酶；phac；pha合成酶；fadl；长链脂肪酸转运蛋白；fadd；长链脂肪酸辅酶a连接酶；fade；酰基辅酶a脱氢酶；ter；酰基辅酶a还原酶；fadba；s型烯脂酰辅酶a水合酶；fadb；3-羟基脂酰辅酶a脱氢酶；fada；3-酮脂酰辅酶a硫解酶；phaj；烯酰辅酶a水合酶；fabd；丙二酰辅酶a-酰基载体蛋白转酰酶；acca；乙酰辅酶a羧化酶羧基转移酶；fabb/fabf/faby；β-酮脂酰-酰基载体蛋白合成酶i/ii/y；fabg；nadph依赖性3-酮脂酰还原酶；faba/fabz；3-羟基脂酰-酰基载体蛋白脱水酶a/z；fabi；烯酰-酰基载体蛋白还原酶；glda；甘油脱氢酶；dhak；二羟丙酮激酶；glpk；甘油激酶；glpa/gpsa；甘油-3-磷酸脱氢酶。基于基因组组装与注释，j9具有一个pha合成酶基因phac，并拥有三条pha合成途径。j9携带经典的短链pha(scl-pha)合成途径i，β-酮基硫解酶(phaa)可将pha合成前体乙酰辅酶a转化成乙酰乙酰辅酶a，随后乙酰乙酰辅酶a在乙酰乙酰辅酶a还原酶(phab)的作用下转化为3-羟基丁酰辅酶a，最终在pha合成酶(phac)的作用下生成phb。乙酰辅酶a还可流入脂肪酸从头合成途径ii产生中链pha(mcl-pha)。j9中含有此途径所需的大部分基因，但缺乏可将(r)-3-羟基脂酰-acp催化为pha合酶重要底物(r)-3-羟基脂酰辅酶a的基因phag，然而有研究表明j9基因组中存在的fabd和fabh可以替代phag的作用。同时，j9中存在的fabh也可以将3-酮酰基-acp转化为3-酮酰基辅酶a，然后3-酮酰基辅酶a在fabg的作用下生成pha合酶的底物(r)-3-羟基脂酰辅酶a。j9中还存在pha合成途径iii—β-氧化循环的全部基因，如fada/b/d/e/l,phaj及fabg，这为利用各种脂肪酸产生具有不同链长的pha创造了可能性。脂肪酸在fadl和fadd下的作用生成酰基辅酶a进入β氧化途径，随后酰基辅酶a脱氢酶(fade)将酰基辅酶a还原为烯脂酰辅酶a，烯脂酰辅酶a在s型烯脂酰辅酶a水合酶(fadba)的作用下被进一步转化为s-(3)-羟基脂酰辅酶a。随后被3-羟基脂酰辅酶a脱氢酶(fadb)转化为3-酮脂酰辅酶a，最后通过3-酮脂酰辅酶a硫解酶(fada)的作用释放一个酰基辅酶a，从而进入下一个β-氧化循环。β氧化循环的中间产物烯脂酰辅酶a可在烯脂酰辅酶a水合酶(phaj)的作用下，直接被转化为(r)-3-羟基脂酰辅酶a，成为pha合成酶的前体。此外，β氧化途径的的中间产物(s)-3-羟基脂酰辅酶a被异构化，3-酮脂酰辅酶a可被fabg还原，均生成(r)-3-羟基脂酰辅酶a。最终(r)-3-羟基脂酰辅酶a在phac的作用下合成mcl-pha。β氧化循环会形成不同碳链长度的(r)-3-羟基脂酰辅酶a，因此为合成不同链长的mcl-pha提供了可能性。
[0174]
在j9中，甘油可以首先被甘油激酶glpk磷酸化生成甘油-3-磷酸，然后甘油-3-磷
酸在脱氢酶gpsa及glpa的作用下被氧化为二羟丙酮。此外，甘油也可直接被甘油脱氢酶glda氧化生成二羟丙酮。二羟丙酮随后会在二羟丙酮激酶dhak的作用下，转化为的甘油异化的终产物磷酸二羟丙酮，磷酸二羟丙酮随后将流入糖酵解途径生成乙酰辅酶a，乙酰辅酶a作为pha合成途径i和途径ii的前体可将甘油代谢和pha合成联系到一起。
[0175]
实施例13
[0176]
渴望盐单胞菌j9中pha合成酶phac
j9
的同源建模
[0177]
①
选择模板蛋白：将phac
j9
酶的序列通过blast程序找到同源性较好的模板蛋白，并从rcsb蛋白质数据库下载模板蛋白的晶体结构(pdbid；5hz2)。
[0178]
②
同源建模：用moe软件进行同源建模。首先通过ligx模块，在ph为7和温度为300k的条件下优化模板蛋白的质子化状态和氢原子的取向。然后，将phac蛋白序列与模板序列比对，并构建10个独立的临时结构模型。这些不同的同源模型是对有不同loop结构和侧链翻转的异构体按照评分进行排列选择的结果。
③
模型打分确定及能量优化：根据gb/vi评分函数进行打分，选择得分最好的临时模型作为最终模型，并使用amber10；eht力场对选择的最终模型进一步进行能量优化。
[0179]
图7为phac
j9
蛋白模型构建结果图。该结果显示了phac
j9
三维结构的成功构建，并以此结构进行后续分子对接。
[0180]
实施例14
[0181]
渴望盐单胞菌j9菌株中pha合成酶phac
j9
与底物3hb-coa分子对接
[0182]
①
配体与受体的预处理：从pubchem中下载3hb-coa的二维结构，然后在moe中通过能量优化得到低能三维构象，作为配体。使用同源建模得到的phac蛋白晶体结构作为受体，结合位点参考原模板蛋白中催化位点。在正式对接之前，选择amber10:eht力场以及r-field隐式溶剂模型。
[0183]
②
分子对接：对接流程采用柔性的inducedfit模式，结合口袋氨基酸的侧链可根据配体构象进行优化调整，约束侧链转动的权重设置为10。配体的结合模式首先通过londondg打分函数进行排序，前90个构象通过进一步优化和gbvi/wsadg方法对结合自由能再次评价。结合自由能最低的构象被选为最佳的结合模式。结合模式图采用pymol绘制。
[0184]
图8为3hb-coa与phac的结合模式，其中(a)3hb-coa与phac的二维结合模式；(b)3hb-coa与phac的表面结合模式；(c)3hb-coa与phac的三维结合模式。其中3hb-coa表示为青色棍棒模型，结合口袋周围的残基表示为黄色棍棒模型，受体的主链表示为灰色卡通，氢键以红色虚线表示。该结果显示c4-coa与phac的结合位点形成了适当的空间互补关系。除此之外，c4-coa与phac也形成了氢键作用。c4-coa的oh基团中的氧原子作为氢键受体，与phac的残基leu362主链上的氮原子形成氢键；c4-coa的硫原子作为氢键供体，与残基cys331侧链上的硫原子形成氢键；c4-coa另一个oh基团上的氧原子作为氢键供体，与残基his489主链上的氧原子形成氢键；c4-coa磷酸根上的氧原子作为氢键受体与残基his489主链上的氮原子形成氢键。c4-coa与phac之间也存在范德华力。c4-coa与phac的结合能主要来自以上这些相互作用。
[0185]
实施例15
[0186]
渴望盐单胞菌j9菌株中pha合成酶phac
j9
与底物3hdd-coa分子对接
[0187]
①
配体与受体的预处理：从pubchem中下载3hdd-coa的二维结构，然后在moe中通
过能量优化得到低能三维构象，作为配体。使用同源建模得到的phac蛋白晶体结构作为受体，结合位点参考原模板蛋白中催化位点。在正式对接之前，选择amber10:eht力场以及r-field隐式溶剂模型。
[0188]
②
分子对接：对接流程采用柔性的induced fit模式，结合口袋氨基酸的侧链可根据配体构象进行优化调整，约束侧链转动的权重设置为10。配体的结合模式首先通过london dg打分函数进行排序，前90个构象通过进一步优化和gbvi/wsa dg方法对结合自由能再次评价。结合自由能最低的构象被选为最佳的结合模式。结合模式图采用pymol绘制。
[0189]
图9为3hdd-coa与phac的结合模式，(a)3hdd-coa与phac的二维结合模式；(b)3hdd-coa与phac的表面结合模式；(c)3hdd-coa与phac的三维结合模式。其中3hdd-coa表示为青色棍棒模型，结合口袋周围的残基表示为黄色棍棒模型，受体的主链表示为灰色卡通，氢键以红色虚线表示。结果显示c12-coa与phac的结合位点形成了适当的空间互补关系。除此之外，c12-coa与phac也形成了氢键作用。c12-coa的氧原子作为氢键受体，与phac的残基his489侧链上的氮原子形成氢键；c4-coa另一个氧原子也作为氢键受体，与残基his489主链上的氮原子形成氢键。c12-coa与phac之间也存在范德华力。c12-coa与phac的结合能主要来自以上这些相互作用。
[0190]
实施例16
[0191]
渴望盐单胞菌j9菌株中pha合成酶phac
j9
表达菌株的构建、phac
j9
的纯化及体外酶活实验
[0192]
①
序列优化：将j9phac基因核苷酸序列(seq id no:7)按照大肠杆菌密码子进行优化。优化后的核苷酸序列为：gtgacccagaacatccggaatggtggtcttaacataacgccccggagccggttccagcagcgcgagttcaccgctgcccggctcgcgcgcgtcaaccattttctcttggtccacgtagccacctttcagcatccactcttgccaatgaggccaccagctaccttcatgctcctcagccgccgccagccaatcatcgtgggattccggcagttcgtcgttggtccagtaaccgtacttgtttttgtggggcgggttcacgatgcctgcaatgtggccggagccacctaacacgaaggtaactgggcctttcggcaacaacgcgccgtaatagctgctatcccaacgtgcgatgtggtcttcgcgtgtcgccacgaagtatgacggcgccgacaccttacgtaaatcgatcttcacaccgtccagttcaataccgtccggctgaaccaagcggttctcttgatacatatggcgtagataccaaccatgcgtgccagctggaaggttcgtgccatcggtattccaatacagcaaatcaaaggcagcgggctcctcgcctttcagatagttgctaatgtagaaggaccagaacaggtcattttcacgcagcaggttgaagctgtatgccatgacgcgtccgtccaggtaaccatcgcgctccagtttcgcttccacgccttgcagcacagattcagacaaaaaaacgccgatctcgcccggctcccgaaaatcttgcaaggttgccatatacgtcacgctcttgatcttacggccccgacgcgtgctcgtcagatacgcaacggtgctcgcggtcaacgtgccaccaatgcagtaactaagcagattaacggatttctcaccagtcgcctgttcgataccctccagcgcggcaatcggacccatttgcatataatctgcccaagtgagatcacgctgttccggacccggattacgccagctgatcaggaacacggtgtggccctggtcgactaaccacttgaccagggagttctcaggtctgaggtccagaacgtagtatttattgatccacggcggaatgatcaacaacggagttttgaacgccttttcggtggacggagcgtactggatcagctggattaactcgttctccataacaacagaacccggggtaactgcaatgttacgacccacctcgaacgcgctgcggtcggtcatgctcacattcagaccatcagccgagttcgccaggtcttgacgcagacgggccagaccgtccacaagattctggccacgcgtttccagggtacggcgcatgacctccgggttggtcgaaacaaagttagtcggagccattgcgttcaccagctgacgtgcataaaaggtcagattacgtttgcgctcggcagacagaccgtccaggttggtaactagttcgtcaacggtacggctgaataataggtactgttgcatcagcgcattccacgccggttcctcggtccacgcgtcgtccttaaa
acgacgatcaccacgtgccggcgcgatcaacggttcacatggggtgccgttcgccagctgcatgctttgctgccataacgcggcttgatcctgcatcaggcgcatctgggtttcccacagtaactgcggatcacgcatcaggctctcggccgcagcctgaaaagagctacgcatatcctccaatacggaatcggtagcgtcactcggaaccatgcgaccgagcatatcttccatgagcgcttggtactgggcaccaatcgcgctcagctgttcggtccattcttgttgcatggcttgagctgtattctgatctcctgccgccat(seq id no:8)。
[0193]
②
载体构建：将优化过的j9phac通过无缝连接技术连接至由xhoi和ncoi双酶切的载体pet-28a(+)上。得到pet-28a(+)-j9phac。
[0194]
③
化学转化，将载体pet-28a和pet-28a-j9phac分别通过化学转化入e.coli bl21中，得到菌株e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)和e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac。
[0195]
④
酶的表达、纯化及鉴定：将e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)和e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac分别以1％的接种量接种于新鲜lb培养基，37℃培养直od
600
＝0.6～0.8，加入终浓度为1mm的诱导剂iptg，18℃，180r/min，培养12小时。将全部培养液以6000r/min，10min离心收集，用buffer i洗涤菌体两次，最终以适当体积重悬菌体，超声破碎后得到细胞裂解物。细胞裂解物经过12000r/min，5min离心分别得到上清与沉淀。将上清液通过镍柱纯化与超滤脱盐，得到纯化后的蛋白。
[0196]
结果见图10。纯化鉴定n-末端6
×
his标记的phac
j9
，其中(a)蛋白质印迹(western-blotting)和(b)sds-page显示了phac
j9
的成功表达，m：marker，nc：阴性对照，e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac的细胞裂解物，泳道1：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac的细胞裂解物，泳道2：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac细胞裂解物的上清液，泳道3：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac细胞裂解物的沉淀，泳道4：纯化后的蛋白phac
j9
。蛋白大小用kda为单位。
[0197]
体外酶活实验：反应混合物的总体积为300μl，含有100mmtris-cl缓冲液(ph7.8)，7.5mm5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，0.2mm3hdd-coa和30μg纯化的pha合酶。通过加入蛋白质启动反应并在30℃下孵育。使用分光光度(perkinelmer llc enspire)对412nm处的吸光值进行了测定。以携带空载体的e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的全细胞裂解物作为阴性对照。此外，每组设置不含底物的混合体系以考虑携带蛋白质的硫醇。催化释放1μmol coa/min的酶量定义为酶活性的一个单位(u)。
⑤
体外酶活实验：反应混合物的总体积为300μl，含有100mmtris-cl缓冲液(ph7.8)，7.5mm5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，0.2mm 3hdd-coa和30μg纯化的pha合酶。通过加入蛋白质启动反应并在30℃下孵育。使用分光光度(perkinelmer llcenspire)对412nm处的吸光值进行了测定。以携带空载体的e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的全细胞裂解物作为阴性对照。此外，每组设置不含底物的混合体系以考虑携带蛋白质的硫醇。催化释放1μmolcoa/min的酶量定义为酶活性的一个单位(u)。
[0198]
实施例17
[0199]
渴望盐单胞菌j9中pha合成酶phac突变及表达菌株构建：为进一步验证phac
j9
与
①
将phac
j9
的第489个氨基酸残基从组氨酸(his489)突变为丙氨酸(ala489)：设计氨基酸残基突变引物，利用实施例16中构建好的载体pet-28a(+)-j9phac作为模板，通过以下pcr体系和程序对片段进行扩增。向25μl扩增后的pcr产物中直接加入1μl的dpni消化酶(neb biolabs)，37℃金属浴消化过夜，得到载体pet-28a(+)-j9phac-ala489。
②
化学转化，将步
骤1得到的产物，通过化学转化入e.coli bl21中，得到菌株e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489。
[0200]
pcr体系如下：
[0201][0202]
pcr反应条件：
[0203][0204][0205]
氨基酸残基突变引物为：
[0206]
489f atcccaacgtgcgatggcgtcttcgcgtgtcgc(seq id no:5)
[0207]
489r gcgacacgcgaagacgccatcgcacgttgggat(seq id no:6)
[0208]
④
酶的表达、纯化及鉴定：将e.coli bl21/pet-28a和e.coli bl21/pet-28a-j9phac-ala489分别以1％的接种量接种于新鲜lb培养基，37℃培养直od
600
＝0.6～0.8，加入终浓度为1mm的诱导剂iptg，18℃，180r/min，培养12小时。将全部培养液以6000r/min，10min离心收集，用buffer i洗涤菌体两次，最终以适当体积重悬菌体，超声破碎后得到细胞裂解物。细胞裂解物经过12000r/min，5min离心分别得到上清与沉淀。将上清液通过镍柱纯化与超滤脱盐，得到纯化后的蛋白。
[0209]
图11为纯化鉴定n-末端6
×
his标记的phac
j9-ala489结果，(a)蛋白质印迹(western-blotting)和(b)sds-page显示了phac
j9
的成功表达；m：marker，nc：阴性对照，e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的细胞裂解物，泳道1：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489的细胞裂解物，泳道2：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489细胞裂解物的上清液，泳道3：e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)-j9phac-ala489细胞裂解物的沉淀，泳道4：纯化后的蛋白phac
j9
。蛋白大小用kda为单位；
[0210]
⑤
体外酶活实验：反应混合物的总体积为300μl，含有100mmtris-cl缓冲液(ph7.8)，7.5mm5，5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)，0.2mm3hdd-coa和30μg纯化的pha合酶。通过加入蛋白质启动反应并在30℃下孵育。使用分光光度(perkinelmer llc enspire)
对412nm处的吸光值进行了测定。以携带空载体的e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的全细胞裂解物作为阴性对照。此外，每组设置不含底物的混合体系以考虑携带蛋白质的硫醇。催化释放1μmol coa/min的酶量定义为酶活性的一个单位(u)。
[0211]
实施例16和实施例17的检测结果见图12。图12为天然phac
j9
和突变phac
j9
体外酶活测定结果，使用e.coli bl21(de3)/pet-28a(+)的细胞裂解物作为阴性对照，以3hdd-coa作为底物，his
489
位点突变后的phac
j9
酶的酶活力较天然phac
j9
酶的酶活力有大幅度降低，呈显著性差异。这表明his
489
位点是phac酶与3hdd-coa底物结合的关键氨基酸残基。
[0212]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一株短链和中长链pha共聚物合成菌，其特征在于，所述合成菌为渴望盐单胞菌(halomonas cupida)j9菌株，保藏编号为cgmcc no.24707。2.一种生产短链和中长链pha共聚物的菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述短链和中长链pha共聚物合成菌和辅料。3.葡萄糖和/或甘油在权利要求1所述合成菌发酵生产短链和中长链pha共聚物中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述短链和中长链pha共聚物的分子量为500000～600000；所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；所述羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％～96％，所述羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％～6％。5.葡萄糖和/或甘油作为碳源在制备权利要求1所述合成菌生产短链和中长链pha共聚物的发酵培养基中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述发酵培养基为碳源30g/l、酵母提取物1g/l、nh4cl 2g/l、mgso40.2 g/l、na2hpo4·
12h2o 9.65g/l、kh2po41.5 g/l、nacl 60～100g/l。7.一种基于权利要求1所述合成菌或权利要求2所述菌剂发酵生产短链和中长链pha共聚物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将活化的权利要求1所述合成菌的菌种接种至发酵培养基中好氧培养，在36～38℃下振荡培养45～52h；所述发酵培养基为碳源30g/l、酵母提取物1g/l、nh4cl 2g/l、mgso40.2g/l、na2hpo4·
12h2o 9.65g/l、kh2po41.5 g/l、nacl 60～100g/l、10ml/l微量元素溶液i和1ml/l微量元素溶液ii；所述碳源为葡萄糖和/或甘油。8.权利要求1中所述渴望盐单胞菌j9菌株来源的低特异性pha合成酶和底物在合成短链和中长链pha共聚物中的应用，所述pha合成酶的氨基酸序列如seq id no:2所示。9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述底物为3hdd-coa和/或3hb-coa。10.根据权利要求8或9所述应用，其特征在于，所述短链和中长链pha共聚物的分子量为500000～600000；所述短链和中长链pha共聚物中短链单体为羟基丁酸酯，中长链单体为羟基月桂酸酯；所述羟基丁酸酯的摩尔百分含量为94％～96％，所述羟基月桂酸酯的摩尔百分含量为4％～6％。

技术总结
本发明提供了一株短链和中长链PHA共聚物合成菌及其发酵培养方法和应用，属于功能微生物技术领域。一株短链和中长链PHA共聚物合成菌为渴望盐单胞菌(Halomonascupida)J9菌株。利用J9菌株能够在高盐条件下合成短链和中长链PHA共聚物，其盐浓度耐受范围为4％～19％，Scl-co-Mcl PHA包含短链的羟基丁酸酯(C4)和长链的羟基月桂酸酯(C12)单体。在最适盐浓度下分别以葡萄糖和甘油作为碳源发酵时，均可获得Scl-co-Mcl PHA，产量达到2.0g/L以上。J9菌株生产Scl-co-MclPHA的营养要求简单，遗传稳定，且培养方式简单易行，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：王淑芳 杨超 刘玉洁
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/24