冬凌草甲素含氮衍生物及其合成方法和应用

1.本发明涉及机合成技术领域，具体是一种冬凌草甲素含氮衍生物及其合成方法和应用。


背景技术：

2.癌症一直是全球人类健康的主要威胁，随着化疗的广泛应用，药物相关的毒性和不良反应成为严重的临床问题，尤其是在化疗期间和化疗后发生的获得性耐药，即化疗耐药，是造成这些问题的最主要原因。因此为了减少毒性，克服化疗的耐药性，并提高抗癌药物的疗效，人们试图从自然界来找到解决办法。
3.自古以来，天然产物就被用于治疗人类疾病。现代医学中，天然产物被认为是先导化合物的重要来源。如冬凌草是唇形科(lamiaceae)植物碎米桠(rabdosia rubescens)的干燥地上部分，冬凌草具有抗肿瘤作用，用于民间防治食管癌；与化疗相结合使用，不仅可以减少、减轻化疗药物引起的不良反应，还能起到提高疗效的作用。冬凌草中的主要抗肿瘤活性成分为二萜类化合物，如冬凌草甲素(oridonin)、冬凌草乙素(ponicidin)和延命草素(enmein)等，其中以冬凌草甲素为代表化合物。像冬凌草甲素这种天然产物具有突出的生物活性，其复杂多样的结构和独特的立体中心，可以更好地与相应的靶点结合。对天然产物的结构转化、修饰和优化，可以获得活性更好、毒副作用更小的药物分子，从而为突破分子靶向药物的开发瓶颈提供了新的思路。
4.冬凌草甲素的抗肿瘤作用及机制包括遏制肿瘤细胞周期、降低端粒酶的活性、抑制肿瘤细胞的dna、rna以及蛋白质合成、诱导肿瘤细胞凋亡、干扰肿瘤细胞信号转导通路等多个方面，在抗肿瘤天然药物领域有广阔的应用前景。然而，虽然冬凌草甲素具有良好的抗肿瘤活性，但较低的水溶性和生物利用度限制了它的治疗潜力和进一步的临床应用，因此，如何大幅提高冬凌草甲素的水溶性，是本领域亟需解决的问题。
5.结构修饰对于优化药物结构、提高药物溶解度、提高药物活性具有积极作用。现有技术中，对冬凌草甲素的包括对1位和14位羟基的修饰、对a环的修饰和对17位双键的修饰，如根据“shen q k,chen z a,zhang h j,et al.design and synthesis of novel oridonin analogues as potent anticancer agents[j].j enzyme inhib med chem,2018,33(1):324-333.”，shen等人报道了在c-17位置具有取代苯基团的二十余种冬凌草甲素衍生物，几乎所有化合物都对6种癌细胞株(ags、mgc803、bel7402、hct116、a549、hela)表现出较强的生长抑制作用，目前对冬凌草甲素的结构修饰集中在分子内羟基和a环的修饰。然而，冬凌草甲素的结构修饰研究目前多是运用一些简单的酯化反应，或者是经过多步反应才能得到目标衍生物，目前尚未有经c-h活化直接引入官能团、特别是经一步反应同时引入两个官能团的文献报道，如何快速高效地进行较复杂的衍生还值得进一步研究。
[0006]
综上所述，目前亟需一种简单快速地合成活性好的冬凌草甲素衍生物的方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种冬凌草甲素含氮衍生物及其合成方法和应用，以至少达到用较少的步骤和较短的时间合成一种活性好、水溶性好的冬凌草甲素衍生物。
[0008]
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009]
如式(i)所示的化合物：
[0010][0011]
式中r选自：式中r选自：
[0012]
中的一种。
[0013]
优选的，式中r选自：
[0014]
中的一种。
[0015]
所述式(i)化合物的合成方法：包括以下步骤：
[0016]
以冬凌草甲素和n-苯甲酰基化合物为底物，在光催化剂和共催化的催化条件下进行光催化反应；
[0017]
所述n-苯甲酰基化合物的结构式为式中r同式(i)化合物。
[0018]
所述光催化剂包括三(2,2'-联吡啶)钌二(六氟磷酸)盐ru(bpy)3(pf6)2、2,4,5,6-四(9-咔唑基)-间苯二腈4czipn、三(2-苯基吡啶)合铱ir(ppy)3或铱催化剂(cf3)ppy]2(dtbpy))pf6。
[0019]
优选的，所述光催化剂为ru(bpy)3(pf6)2。
[0020]
所述的共催化剂包括cui、cubr或cucl。
[0021]
优选的，所述共催化剂为cui。
[0022]
所述光催化反应的溶剂为二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧六环、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。
[0023]
优选的，所述溶剂为二氯甲烷：n,n-二甲基甲酰胺＝5:1的混合溶剂。
[0024]
进一步的，所述冬凌草甲素、n-苯甲酰基化合物、光催化剂、共催化剂的摩尔比为1：1.1-1.5：0.02-0.05：0.1-0.3；
[0025]
优选的，所述冬凌草甲素、n-苯甲酰基化合物、光催化剂、共催化剂的摩尔比为1：1.1：0.02：0.1。
[0026]
进一步的，所述光催化反应在400-475nm的蓝色led灯照射下进行
[0027]
进一步的，所述光催化反应的反应温度为20-30℃；
[0028]
优选的，所述光催化反应的反应温度为25℃；
[0029]
进一步的，所述光催化反应的反应时间为36-48h。
[0030]
优选的，所述光催化反应的反应时间为40h。
[0031]
所述光催化反应在惰性气体氛围中进行。
[0032]
所述式(i)化合物用于制备抗癌药物。
[0033]
本发明的有益效果是：
[0034]
本发明首次采用光催化的手段，经一步反应在冬凌草甲素16位和17位的双键碳上分别同时引入含氮官能团和含氧官能团。该反应不仅简洁高效，生成的产物也具有单一的立体构型，实现了自由基反应在复杂天然产物中的立体选择性反应。
[0035]
本发明的含氮冬凌草甲素衍生物水溶性好，可有效抑制肿瘤细胞增殖活性，对mcf-7细胞和a549细胞有较好的抑制效果，有应用于治疗乳腺癌和肺癌的前景。
附图说明
[0036]
图1为实施例1中光催化反应合成c16-n-c-17-苯甲酰酯基冬凌草甲素衍生物的反
应方程式；
[0037]
图2为实施例2中水解反应生成c16-n-c-17-oh-冬凌草甲素衍生物的反应方程式；
[0038]
图3为实验例中化合物5b、10b、11b、12b、13b、16b、17b、21b、22b、25b、5c、10c、11c、12c、13c、16c、17c、21c、22c、25c在40μm下对人乳腺癌细胞mcf-7的抑制率测试结果；
[0039]
图4为实验例中化合物5b、10b、12b、16b、17b、21b、22b、25b对mcf-7细胞的体外细胞抗增殖活性测定结果；
[0040]
图5为实验例中化合物5b、10b、11b、12b、13b、16b、17b、5c、10c、11c、12c、13c、16c、17c在40μm下对人非小细胞肺癌细胞a549的抑制率测试结果；
[0041]
图6为实验例中化合物10b、11b、13b、16b对a549细胞的体外细胞抗增殖活性测定结果。
具体实施方式
[0042]
下面结合附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
[0043]
实施例1
[0044]
制备c16-n-c-17-苯甲酰酯基冬凌草甲素衍生物，具体方法为：
[0045]
①
制备n-苯甲酰基羟胺化合物：将过氧化苯甲酰(0.25mmol，61mg)和磷酸氢二钠(0.375mmol，54mg)溶于dmf(1.5ml)中，加入胺基化合物(0.30mmol)，室温下反应6h。用饱和氯化铵(nh4cl)水溶液淬灭后，经乙酸乙酯(3
×
20ml)萃取，收集有机相，分别用5％的氯化钠水溶液和饱和食盐水洗涤两次，再用无水硫酸钠(na2so4)，过滤，减压旋蒸除去挥发性物质，残留物利用柱层析(石油醚：乙酸乙酯)分离，得到n-苯甲酰基羟胺化合物5a、10a、11a、12a、13a、16a、17a、21a、22a、25a。
[0046]
所述氨基化合物包括(r)-3-甲基哌啶、4-哌啶甲酸乙酯、4-氟哌啶、4,4-二氟哌啶、4-(三氟甲基)哌啶、n-甲基环己胺、n-甲基-2-苯基乙烷-1-胺、n-甲基-4-氟苄胺、n-(4-氯苄基)-n-甲胺、n-甲基-1-萘甲胺中的一种。
[0047]
②
将光催化剂ru(bpy)3(pf6)2(2mol％)，cui(1mol％)，和用适量dmf溶解的冬凌草甲素(oridonin，36mg，0.10mmol)溶于超干二氯甲烷(2ml)中，向其中加入步骤
①
所得n-苯甲酰基羟胺化合物(0.11mmol)。在3w蓝光(450nm)照射下，室温搅拌40h，反应体系逐渐由黄色变为深绿色，tlc监测反应进程至反应结束。加入乙酸乙酯(10ml)和5％的氯化钠水溶液(3x 50ml)萃取，合并有机相，用饱和食盐水洗涤两次，经无水硫酸钠(na2so4)干燥，过滤，减压浓缩除去溶剂，残留物用硅胶柱层析(二氯甲烷：甲醇)纯化，得到目标产物5b、10b、11b、12b、13b、16b、17b、21b、22b和25b。
[0048]
化合物5a无色液体(46mg,70％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.04
–
7.96(m,2h),7.58
–
7.53(m,1h),7.45
–
7.41(m,2h),7.22
–
7.13(m,3h),7.08
–
7.04(m,1h),4.43(d,j＝1.0hz,2h),3.63
–
3.43(m,2h),3.15
–
3.09(m,2h)。hresims m/z 220.1338[m+h]
+
(calcd for c
13h17
no2,220.1338)；
[0049]
化合物10a白色固体(63mg,75％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.05
–
7.94(m,2h),7.59
–
7.49(m,1h),7.47
–
7.37(m,2h),3.51(t,j＝8.7hz,2h),2.78(t,j＝8.5hz,2h),1.87
–
1.78(m,4h),1.67(t,j＝11.0hz,1h),1.28(t,j＝11.1 1h)。hresims m/z 278.1398[m+h]
+
(calcd for c
15h19
no4,278.1392)；
[0050]
化合物11a无色液体(35mg,52％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.06
–
7.94(m,2h),7.55
–
7.50(m,1h),7.44
–
7.38(m,2h),3.53(d,j＝9.5hz,1h),2.89
–
2.77(m,1h),2.69(t,j＝11.5hz,1h),1.89
–
1.81(m,1h),1.76(d,j＝11.8hz,2h),1.65(d,j＝13.7hz,1h),1.56(d,j＝13.0hz,1h),1.28(m,1h),1.15(d,j＝6.1hz,3h)。hresims m/z 224.1107[m+h]
+
(calcd for c
12h14
fno2，224.1087)；
[0051]
化合物12a无色液体(36mg,49％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.68(dt,j＝8.6,1.0hz,1h),8.07
–
7.98(m,2h),7.85(m,2h),7.67(m,1h),7.54(m,3h),7.49
–
7.33(m,3h),4.63(s,2h),2.94(s,3h)。hresims m/z 242.0999[m+h]
+
(calcd for c
12h13
f2no2,242.0993)；
[0052]
化合物13a无色液体(44mg,53％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ7.98
–
7.90(m,2h),7.53
–
7.44(m,1h),7.41
–
7.32(m,2h),3.48(p,j＝5.5hz,1h),3.29(s,3h),3.28
–
2.66(m,4h),2.11
–
1.73(m,4h)。hresims m/z 274.1065[m+h]
+
(calcd for c
13h14
f3no2,274.1055)；
[0053]
化合物16a化合物16a，无色液体(51mg,73％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.02
–
7.98(m,2h),7.60
–
7.54(m,1h),7.47
–
7.42(m,2h),3.65(t,j＝8.9,2h),2.75(t,j＝8.9,2h),2.11
–
1.95(m,4h)。hresims m/z 234.1496[m+h]
+
(calcd for c
14h19
no2,234.1494)；
[0054]
化合物17a无色液体(68mg,88％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.06
–
7.99(m,2h),7.58
–
7.53(m,1h),7.47
–
7.40(m,2h),2.87(s,3h),2.79(p,j＝5.7,1h),2.00(t,j＝11.8hz,2h),1.81(t,j＝12.8,3.4hz,2h),1.46
–
1.25(m,4h),1.26
–
1.08(m,2h)。hresims m/z 256.1358[m+h]
+
(calcd for c
16h17
no2,256.1338)；
[0055]
化合物21a无色液体(49mg,63％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.94
–
7.84(m,2h),7.54
–
7.48(m,1h),7.43
–
7.33(m,4h),7.02
–
6.93(m,2h),4.10(t,j＝2.7hz,2h),2.91(s,3h)。hresims m/z 260.1097[m+h]
+
(calcd for c
15h14
fno2,260.1087)；
[0056]
化合物22a无色液体(60mg,72％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.92
–
7.85(m,2h),7.54
–
7.50(m,1h),7.41
–
7.33(m,4h),7.29
–
7.25(m,2h),4.11(t,j＝2.7hz2h),2.92(s,3h)。hresims m/z 276.0799[m+h]
+
(calcd for c
15h14
clno2,276.0791)；
[0057]
化合物25a无色液体(65mg,74％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.05
–
7.93(m,2h),7.63
–
7.54(m,1h),7.49
–
7.40(m,2h),3.52
–
3.24(m,4h),2.05
–
2.40(m,4h)。hresims m/z 292.1351[m+h]
+
(calcd for c
19h17
no2,292.1338)；
[0058]
化合物5b白色固体(44mg,76％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.64(d,j＝7.2hz,1h),8.01
–
7.93(m,2h),7.65
–
7.57(m,1h),7.51
–
7.43(m,2h),6.64(s,1h),4.96
–
4.84(m,2h),4.64(d,j＝13.2hz,1h),4.47(d,j＝13.2hz,1h),4.21(dd,j＝10.3,1.5hz,1h),4.06(dd,j＝10.3,1.8hz,1h),3.72(dd,j＝11.9,6.0hz,1h),3.44(dd,j＝10.8,6.1hz,1h),3.27(s,1h),3.13
–
3.07(m,1h),2.94(s,1h),2.40(s,1h),2.28(m,1h),2.07(m,1h),2.02
–
1.90(m,1h),1.86(m,1h),1.74
–
1.68(m,2h),1.66
–
1.56(m,3h),1.53
–
1.40(m,4h),1.28
–
1.21(m,3h),1.19(dd,j＝6.1,1.3hz,1h),1.12(s,3h),1.10(s,3h),0.86(d,j＝6.7hz,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ221.1,165.9,133.7,129.6,129.6,129.6,128.8,128.8,96.8,75.8,75.7,73.8,73.7,64.5,63.1,61.1,60.3,57.1,55.5,48.5,41.3,39.1,38.8,33.9,32.6,32.0,30.0,29.4,26.2,22.2,21.7,19.6,18.4。hresims m/z 584.3236[m+h]
+
(calcd for c
33h45
no8,584.3223)；
[0059]
化合物10b白色固体(33mg,55％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.23(s,1h),7.97
–
7.92(m,2h),7.62
–
7.58(m,1h),7.49
–
7.44(m,2h),6.54(s,1h),4.89(s,1h),4.86(dd,j＝11.7,2.8hz,1h),4.65(dd,j＝13.3,2.6hz,1h),4.43(dd,j＝
13.4,2.7hz,1h),4.20(d,j＝10.3hz,1h),4.11
–
4.04(m,3h),3.71(dd,j＝12.5,6.1hz,1h),3.42(dd,j＝11.1,5.8hz,1h),3.35(s,1h),3.07(d,j＝10.9hz,1h),3.02
–
2.92(m,1h),2.60(s,1h),2.42(s,1h),2.36
–
2.24(m,2h),2.08(dd,j＝14.1,7.8hz,1h),1.96(d,j＝12.6hz,2h),1.90
–
1.82(m,2h),1.71(s,1h),1.62(d,j＝11.2hz,2h),1.53
–
1.41(m,4h),1.25(d,j＝12.8hz,1h),1.21(d,j＝2.3hz,1h),1.17(d,j＝6.0hz,1h),1.10(s,3h),1.08(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ220.9,174.0,165.8,133.8,129.6,129.6,129.5,128.9,128.9,96.7,75.8,75.7,73.8,73.7,64.6,63.2,61.0,60.7,60.4,57.1,57.1,47.0,41.3,39.3,38.8,33.9,33.9,32.6,30.0,28.8,28.8,22.3,21.7,18.4,14.3。hresims m/z 642.3292[m+h]
+
(calcd for c
35h47
no
10
,642.3278)；
[0060]
化合物11b白色固体(28mg,48％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ8.07
–
7.97(m,2h),7.67
–
7.63(m,1h),7.54
–
7.51(m,2h),4.92(d,j＝1.8hz,1h),4.74(d,j＝13.1hz,1h),4.72
–
4.61(m,1h),4.58
–
4.55(m,1h),4.23(dd,j＝10.3,1.4hz,1h),4.10(q,j＝7.1hz,1h),4.05(dd,j＝10.3,1.9hz,1h),3.64(d,j＝6.1hz,1h),3.41(dd,j＝10.5,6.4hz,1h),3.22(dt,j＝11.1,1.6hz,1h),3.17(s,1h),3.07(s,1h),2.86
–
2.80(m,1h),2.70
–
2.64(m,1h),2.34(m,1h),2.17
–
2.09(m,1h),2.01(s,1h),1.98(m,1h),1.85(d,j＝25.7hz,4h),1.65
–
1.59(m,3h),1.54(dd,j＝14.0,6.8hz,1h),1.45(dt,j＝13.5,3.4hz,1h),1.30(dd,j＝12.3,4.3hz,2h),1.25
–
1.22(m,2h),1.11(s,3h),1.06(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ222.7,167.0,134.7,130.9,130.5,130.5,129.9,129.9,97.8,79.4(d,j＝170.6hz),76.9,76.8,75.0,73.7,65.8,64.6,61.8,61.1,58.1,44.8,42.4,40.7,39.8,34.6,33.1,33.0(d,j＝19.0hz),33.0(d,j＝19.0hz),30.3,23.1,21.9(d,j＝7.6hz),21.9(d,j＝7.6hz),19.3。hresims m/z588.2984[m+h]
+
(calcd for c
32h42
fno8,588.2973)；
[0061]
化合物12b白色固体(32mg,52％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.99
–
7.91(m,2h),7.81(d,j＝7.7hz,1h),7.65
–
7.59(m,1h),7.51
–
7.45(m,2h),6.42(s,1h),4.92(d,j＝5.8hz,1h),4.80(d,j＝11.9hz,1h),4.63(d,j＝13.4hz,1h),4.48(d,j＝13.4hz,1h),4.22(dd,j＝10.3,1.4hz,1h),4.08(dd,j＝10.4,1.8hz,1h),3.73(dd,j＝11.9,6.2hz,1h),3.44(dd,j＝10.9,6.0hz,1h),3.24
–
2.97(m,3h),2.92
–
2.76(m,2h),2.32(m,1h),2.12
–
1.96(m,5h),1.87(m,1h),1.66
–
1.59(m,2h),1.53
–
1.45(m,3h),1.29
–
1.25(m,2h),1.20
–
1.18(m,1h),1.12(s,3h),1.10(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ220.4,165.7,133.9,129.6,129.6,129.3,128.9,128.9,120.5(t,j＝241.1hz),96.7,75.8,75.2,73.8,73.6,64.7,63.2,60.9,60.4,57.1,44.6(t,j＝5.6hz),44.6(t,j＝5.6hz),41.3,39.7,38.8,34.6(t,j＝23.4hz),34.6(t,j＝23.4hz),33.9,32.6,30.0,22.2,21.7,18.4。
hresims m/z 606.2893[m+h]
+
(calcd for c
32h41
f2no8,606.2878)；
[0062]
化合物13b白色固体(34mg,53％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.98
–
7.93(m,3h),7.65
–
7.59(m,1h),7.51
–
7.45(m,2h),6.47(s,1h),4.92(d,j＝6.8hz,1h),4.82(d,j＝11.8hz,1h),4.68(d,j＝13.4hz,1h),4.44(d,j＝13.4hz,1h),4.22(dd,j＝10.3,1.4hz,1h),4.07(dd,j＝10.4,1.8hz,1h),3.73(dd,j＝11.8,6.2hz,1h),3.53
–
3.47(m,1h),3.44(m,1h),3.12(d,j＝12.0hz,1h),3.11
–
3.06(m,1h),2.54(td,j＝12.1,2.6hz,1h),2.38(td,j＝12.1,2.3hz,1h),2.36
–
2.28(m,1h),2.15
–
2.02(m,2h),1.96(m,2h),1.87(m,1h),1.67
–
1.53(m,3h),1.55
–
1.44(m,4h),1.32
–
1.24(m,3h),1.19(dd,j＝6.2,1.3hz,1h),1.12(s,3h),1.10(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ220.7,165.8,133.9,129.6,129.6,129.3,128.9,128.9,126.0(q,j＝272.2hz),96.7,75.8,75.6,73.8,73.7,64.7,63.2,61.0,60.3,57.1,47.1,46.6,41.3,40.0,39.4,38.8,33.9,32.6,30.0,25.4,22.3,21.7,21.7,18.4。hresims m/z 638.2951[m+h]
+
(calcd for c
33h42
f3no8,638.2941)；
[0063]
化合物16b白色固体(42mg,70％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.40(s,1h),8.00
–
7.94(m,2h),7.63
–
7.57(m,1h),7.50
–
7.44(m,2h),6.74(s,1h),4.98(d,j＝11.7hz,1h),4.88(s,1h),4.65(d,j＝13.1hz,1h),4.53
–
4.37(m,1h),4.19(d,j＝10.3hz,1h),4.07
–
3.99(m,1h),3.70(dt,j＝11.7,5.9hz,1h),3.40(dt,j＝10.2,4.1hz,1h),3.13(s,1h),3.06(d,j＝10.9hz,1h),2.31(s,3h),2.29
–
2.12(m,1h),2.06(dd,j＝13.7,7.7hz,1h),1.86
–
1.74(m,3h),1.59(s,3h),1.57(s,1h),1.53(d,j＝12.5hz,4h),1.51
–
1.45(m,2h),1.43(dd,j＝13.4,3.8hz,1h),1.38
–
1.31(m,2h),1.29
–
1.18(m,2h),1.15(d,j＝5.6hz,1h),1.09(s,5h),1.07(s,5h),0.97(d,j＝13.1hz,2h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ221.2,166.0,133.7,129.5,129.5,129.5,128.8,128.8,96.8,75.8,75.7,73.7,73.7,64.5,63.1,60.9,57.6,56.8,56.8,41.2,40.1,38.8,33.9,32.6,30.0,29.8,26.2,26.1,25.7,22.3,21.7,21.7,18.4。hresims m/z598.3393[m+h]
+
(calcd for c
34h47
no8,598.3380)；
[0064]
化合物17b白色固体(24mg,39％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.95
–
7.84(m,2h),7.60
–
7.56(m,1h),7.46
–
7.36(m,2h),7.31
–
7.25(m,3h),7.24
–
7.19(m,1h),7.17
–
7.14(m,2h),6.75
–
6.29(m,1h),5.01(d,j＝11.6hz,1h),4.84(s,1h),4.65(d,j＝13.2hz,1h),4.51(d,j＝13.2hz,1h),4.20(d,j＝10.3hz,1h),4.06(dd,j＝10.3,1.8hz,1h),3.76(dd,j＝11.7,6.2hz,1h),3.44
–
3.40(m,1h),2.99(d,j＝10.8hz,
1h),2.82(d,j＝41.2hz,2h),2.52(s,3h),2.27(m,1h),2.06(dt,j＝13.5,6.8hz,1h),1.85(m,1h),1.73(s,1h),1.66
–
1.59(m,2h),1.55
–
1.45(m,3h),1.34
–
1.26(m,1h),1.25(d,j＝3.3hz,1h),1.22(d,j＝4.5hz,1h),1.18(dd,j＝6.3,1.3hz,1h),1.12(s,3h),1.11(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ220.4,165.8,138.4,133.7,129.6,129.6,129.4,128.8,128.8,128.8,128.8,128.7,126.8,126.8,75.7,75.2,73.7,73.7,64.5,63.1,60.9,56.6,53.7,46.6,41.2,40.1,38.8,36.5,34.7,33.9,32.7,30.1,22.1,21.7,18.4。hresims m/z 620.3231[m+h]
+
(calcd for c
36h45
no8,620.3223)；
[0065]
化合物21b白色固体(34mg,57％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.18(s,1h),7.99
–
7.97(m,2h),7.62
–
7.59(m,1h),7.49
–
7.45(m,2h),7.25
–
7.20(m,2h),7.03
–
6.99(m,2h),6.56(s,1h),4.98(s,1h),4.94(d,j＝11.6hz,1h),4.81(d,j＝13.4hz,1h),4.55(d,j＝13.4hz,1h),4.24(dd,j＝10.3,1.4hz,1h),4.08(dd,j＝10.2,1.8hz,1h),3.75(dd,j＝11.7,6.2hz,1h),3.45(dd,j＝11.1,5.8hz,1h),3.23(d,j＝10.9hz,1h),2.40
–
2.34(m,1h),2.33
–
2.23(m,3h),2.11(td,j＝13.6,12.7,7.7hz,1h),1.93
–
1.86(m,1h),1.68
–
1.52(m,4h),1.49
–
1.39(m,2h),1.25(dd,j＝7.5,5.4hz,1h),1.21
–
1.19(m,1h),1.12(s,3h),1.10(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ220.5,165.9,163.4(d,j＝245.1hz),133.8,132.4(d,j＝3.2hz),131.2(d,j＝7.8hz),131.2(d,j＝7.8hz),129.6,129.6,129.4,128.9,128.9,116.0(d,j＝21.0hz),115.8(d,j＝21.0hz),96.8,76.1,75.3,73.7,73.6,64.7,63.2,60.9,60.3,56.9,55.2,41.3,40.0,38.8,35.5,33.9,32.6,30.0,22.4,21.7,18.4。hresims m/z 624.2968[m+h]
+
(calcd for c
35h42
fno8,624.2973)；
[0066]
化合物22b白色固体(41mg,64％)。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.02
–
7.99(m,2h),7.76
–
7.73(m,1h),7.70
–
7.66(m,1h),7.57
–
7.52(m,2h),7.41
–
7.37(m,2h),7.34
–
7.30(m,2h),6.49(s,1h),4.93(d,j＝11.3hz,1h),4.87(dd,j＝8.0,1.6hz,1h),4.77(d,j＝13.0hz,1h),4.60(d,j＝12.9hz,1h),4.40(d,j＝5.0hz,1h),4.14
–
4.09(m,2h),3.87(dd,j＝10.0,1.6hz,1h),3.59(d,j＝13.0hz,1h),3.45(dd,j＝11.3,6.2hz,1h),3.31(d,j＝11.1hz,1h),3.30
–
3.26(m,1h),2.29
–
2.22(m,1h),2.19(s,3h),2.05(m,1h),1.99
–
1.95(m,1h),1.57
–
1.42(m,4h),1.33(dt,j＝13.4,3.4hz,1h),1.16(td,j＝13.5,3.6hz,1h),1.09(d,j＝6.2hz,1h),1.01(s,3h),0.97(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ220.8,165.2,136.7,133.6,132.2,131.0,131.0,129.2,129.2,129.2,128.9,128.9,128.5,128.5,96.4,75.4,74.3,73.2,71.6,64.3,62.8,60.4,60.2,55.5,53.8,40.4,38.4,35.8,35.0,33.3,32.5,29.2,21.6,21.4,17.8。hresims m/z 640.2679[m+h]
+
(calcd for c
35h42
clno8,640.2677)；
[0067]
化合物25b白色固体(43mg,65％)。1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.22(dd,j＝41.2,8.1hz,1h),8.06
–
8.03(m,2h),7.99
–
7.97(m,1h),7.86(dd,j＝7.8,1.6hz,1h),7.81(dd,j＝6.6,2.9hz,1h),7.64
–
7.60(m,1h),7.51
–
7.44(m,6h),6.73(s,1h),5.05
–
4.98(m,3h),4.66(d,j＝13.4hz,1h),4.58
–
4.37(m,1h),4.26(dd,j＝10.2,1.4hz,1h),4.10(dd,j＝10.3,1.8hz,1h),3.80(dd,j＝11.7,6.2hz,1h),3.46(dd,j＝11.0,5.8hz,1h),3.31(d,j＝10.8hz,1h),2.41(m,1h),2.33(s,3h),2.13(m,1h),1.93(m,1h),1.69
–
1.54(m,5h),1.48(dt,j＝13.6,3.4hz,1h),1.29(dd,j＝5.2,2.7hz,1h),1.27(d,j＝5.6hz,1h),1.24
–
1.22(m,1h),1.14(s,3h),1.12(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ220.3,165.9,133.8,133.7,132.0,132.0,129.6,129.6,129.4,129.0,128.8,128.8,127.8,128.7,126.7,125.9,125.5,123.0,96.8,75.8,75.4,73.7,73.7,64.7,63.0,60.7,60.3,56.7,51.9,41.2,40.0,38.8,36.4,33.8,32.6,30.0,22.4,21.7,18.4。hresims m/z 656.3233[m+h]
+
(calcd for c
39h45
no8,656.3223)。
[0068]
实施例2
[0069]
取实施例1中制得的化合物5b、10b、11b、12b、13b、16b、17b、21b、22b、25b分别进行水解，得到c16-n-c-17-oh-冬凌草甲素衍生物。具体方法为：分别将化合物5b、10b、11b、12b、13b、16b、17b、21b、22b、25b溶于5％ koh的甲醇溶液中(3ml)，在室温下搅拌，tlc监测反应进程。反应完全后，用2n hcl溶液调节ph至10左右，经二氯甲烷和饱和食盐水萃取3次，合并有机层，用无水硫酸钠(na2so4)干燥，过滤，通过柱层析(二氯甲烷:甲醇)对旋干后混合物进行分离，得到目标水解产物5c、10c、11c、12c、13c、16c、17c、21c、22c、25c。
[0070]
其中，化合物5c白色固体(22mg,91％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ4.85(d,j＝1.8hz,1h),4.22(dd,j＝10.2,1.4hz,1h),4.04(dd,j＝10.2,1.9hz,1h),4.01(d,j＝12.6hz,1h),3.73(d,j＝12.6hz,1h),3.61(d,j＝6.1hz,1h),3.43(dd,j＝10.6,6.3hz,1h),3.27(d,j＝11.9hz,1h),3.00(dt,j＝11.0,1.6hz,1h),2.83(d,j＝11.7hz,1h),2.51(t,j＝11.3hz,1h),2.27(m,1h),2.15
–
2.06(m,2h),1.91(m,1h),1.85
–
1.79(m,1h),1.71(m,2h),1.66
–
1.60(m,2h),1.56
–
1.50(m,2h),1.46(dt,j＝13.5,3.5hz,1h),1.40
–
1.35(m,1h),1.34
–
1.31(m,1h),1.26(dd,j＝6.1,1.3hz,1h),1.11(s,3h),1.06(s,3h),0.99(dd,j＝14.0,10.1hz,1h),0.91(d,j＝6.6hz,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ224.1,98.0,78.3,77.1,74.9,73.8,66.9,65.9,64.5,61.8,58.4,57.4,56.4,42.3,40.3,39.8,34.7,33.8,33.3,33.0,30.3,22.7,21.9,19.9,19.4。hresims m/z 480.2989[m+h]
+
(calcd for c
26h41
no7,480.2961)；
[0071]
化合物10c白色固体(24mg,91％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ4.85(d,j＝1.8hz,1h),4.22(dd,j＝10.2,1.4hz,1h),4.04(dd,j＝10.2,1.9hz,1h),4.00(d,j＝12.6hz,1h),3.73(d,j＝12.6hz,1h),3.66(s,3h),3.62(d,j＝6.2hz,1h),3.43(dd,j＝10.7,6.3hz,1h),3.38
–
3.34(m,1h),2.98(dt,j＝11.0,1.5hz,1h),2.91(d,j＝12.0hz,1h),2.71
–
2.66(m,1h),2.58
–
2.54(m,1h),2.44(m,1h),2.28(dt,j＝10.9,3.4hz,1h),2.12
–
2.06(m,1h),1.97(d,j＝12.9hz,1h),1.91(m,2h),1.84
–
1.79(m,1h),1.64(m,2h),1.60
–
1.57(m,1h),1.56
–
1.50(m,2h),1.47
–
1.44(m,1h),1.33
–
1.31(m,1h),1.26(dd,j＝6.2,1.3hz,1h),1.11(s,3h),1.06(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ223.9,176.5,97.9,78.2,77.1,74.9,73.8,65.9,64.6,61.7,58.5,57.4,52.2,48.0,42.3,40.5,39.8,34.7,34.7,33.0,30.3,30.2,30.1,22.8,21.9,21.9,19.4。hresims m/z 524.2902[m+h]
+
(calcd for c
27h41
no8,524.2860)；
[0072]
化合物11c白色固体(23mg,95％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ4.66(d,j＝48.4hz,1h),4.22(dd,j＝10.2,1.4hz,1h),4.04(dd,j＝10.2,1.9hz,1h),4.02(d,j＝12.6hz,1h),3.74(d,j＝12.6hz,1h),3.62(d,j＝6.2hz,1h),3.43(dd,j＝10.7,6.3hz,1h),3.10(s,1h),2.98(dt,j＝11.0,1.6hz,2h),2.92
–
2.86(m,1h),2.67(dt,j＝11.4,5.1hz,1h),2.28(m,1h),2.10(m,1h),1.94
–
1.72(m,6h),1.66
–
1.59(m,2h),1.57
–
1.51(m,1h),1.46(dt,j＝13.5,3.5hz,1h),1.35
–
1.29(m,2h),1.26(dd,j＝6.2,1.4hz,1h),1.11(s,3h),1.06(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ223.8,97.9,91.1(d,j＝170.6hz),78.0,77.1,74.9,73.8,65.9,64.6,61.7,58.5,57.4,44.9,42.3,40.6,39.8,34.7,33.3(d,j＝19.0hz),33.1(d,j＝19.0hz),33.0,30.3,22.8,21.9(d,j＝7.6hz),21.9(d,j＝7.6hz),19.4。hresims m/z 484.2773[m+h]
+
(calcd for c
25h38
fno7,484.2711)；
[0073]
化合物12c白色固体(22mg,86％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ4.57(s,1h),4.23(dd,j＝10.2,1.4hz,1h),4.04(dd,j＝10.2,1.9hz,1h),4.01(d,j＝12.6hz,1h),3.74(d,j＝12.6hz,1h),3.63(d,j＝6.3hz,1h),3.44(dd,j＝10.7,6.2hz,1h),3.10(s,2h),3.00(dt,j＝11.0,1.5hz,1h),2.87(dt,j＝12.3,5.8hz,2h),2.30(m,1h),2.10(m,1h),2.00
–
1.92(m,4h),1.83(td,j＝14.3,6.6hz,1h),1.67
–
1.59(m,2h),1.55(dd,j＝14.3,6.9hz,1h),1.47
–
1.43(m,1h),1.32(t,j＝6.3hz,1h),1.30(s,1h),1.26(dd,j＝6.3,1.4hz,1h),1.12(s,3h),1.06(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ223.5,113.7(t,j＝241.1hz),97.9,77.6,77.0,75.0,73.8,65.9,64.6,61.7,58.7,57.4,45.6(t,j＝5.6hz),
45.6(t,j＝5.6hz),42.3,40.8,39.8,35.6(t,j＝23.4hz),35.4(t,j＝23.4hz),34.7,33.0,30.3,22.9,21.9,19.4。hresims m/z 501.2598[m+h]
+
(calcd for c
25h37
f2no7,501.2538)；
[0074]
化合物13c白色固体(24mg,89％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ4.86(d,j＝1.7hz,1h),4.22(dd,j＝10.2,1.4hz,1h),4.07
–
3.99(m,2h),3.75(d,j＝12.6hz,1h),3.62(d,j＝6.2hz,1h),3.53
–
3.46(m,1h),3.44(dd,j＝10.7,6.3hz,1h),3.00(tt,j＝10.9,2.3hz,2h),2.60(m,2h),2.32
–
2.22(m,2h),2.10(m,1h),1.97(dt,j＝13.2,3.2hz,1h),1.91(m,2h),1.86
–
1.78(m,1h),1.63(m,2h),1.57
–
1.51(m,1h),1.49
–
1.36(m,3h),1.35
–
1.29(m,2h),1.26(dd,j＝6.2,1.3hz,1h),1.12(s,3h),1.06(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ223.7,129.6(q,j＝272.2hz)97.9,78.0,77.2,75.0,73.8,65.9,64.6,61.7,58.6,57.4,47.7(q,j＝1.0hz),47.5(q,j＝1.0hz),42.3,40.9(q,j＝28.5hz),40.5,39.8,34.7,33.0,30.3,26.5,22.8,21.9(q,j＝3.7hz),21.9(d,j＝3.7hz),19.4。hresims m/z 534.2721[m+h]
+
(calcd for c
26h38
f3no7,534.2679)；
[0075]
化合物16c白色固体(22mg,89％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ4.85(q,j＝1.8hz,1h),4.21(m,1h),4.03(m,1h),3.98(dd,j＝12.2,3.8hz,1h),3.80(dd,j＝12.2,4.0hz,1h),3.62(dd,j＝6.3,3.9hz,1h),3.43(m,1h),3.17(td,j＝9.9,8.1,4.1hz,1h),2.94(dd,j＝11.1,3.6hz,1h),2.29(d,j＝4.1hz,3h),2.26(m,1h),2.11
–
2.03(m,1h),1.96(m,1h),1.93
–
1.89(m,1h),1.82
–
1.72(m,4h),1.68
–
1.60(m,3h),1.55(m,1h),1.45(dd,j＝13.5,3.8hz,1h),1.40(m,2h),1.35
–
1.28(m,4h),1.25(dt,j＝6.1,2.1hz,1h),1.11(d,j＝3.8hz,3h),1.06(d,j＝3.9hz,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ224.0,98.0,78.5,77.3,74.9,73.9,65.8,64.5,61.6,59.8,58.7,56.9,42.3,41.4,39.8,34.7,33.1,32.5,31.7,31.1,30.4,27.3,27.2,26.9,22.8,21.9,19.4。hresims m/z 494.3135[m+h]
+
(calcd for c
27h43
no7,494.3118)；
[0076]
化合物17c白色固体(25mg,96％)。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.91(d,j＝8.0hz,1h),7.28
–
7.26(m,2h),7.20
–
7.17(m,3h),6.55
–
6.48(m,1h),5.16
–
5.13(m,1h),4.89(t,j＝4.4hz,1h),4.67(dd,j＝8.2,1.7hz,1h),4.35(d,j＝5.0hz,1h),4.03(d,j＝10.1hz,1h),3.85(dd,j＝12.3,4.6hz,1h),3.81(dd,j＝10.2,1.7hz,1h),3.55(dt,j＝12.4,3.7hz,1h),3.42
–
3.39(m,1h),3.30(dd,j＝10.9,5.4hz,1h),3.09(d,j＝12.0hz,1h),2.77(d,j＝10.8hz,1h),2.73
–
2.66(m,2h),2.66(s,1h),2.37(s,3h),2.12
(td,j＝7.3,3.1hz,1h),1.94(dt,j＝13.2,6.6hz,1h),1.79(dt,j＝11.5,3.8hz,1h),1.71(dt,j＝13.8,7.0hz,1h),1.49(t,j＝4.8hz,1h),1.48
–
1.43(m,1h),1.40
–
1.36(m,1h),1.33
–
1.30(m,1h),1.21
–
1.17(m,1h),1.11
–
1.09(m,1h),1.00(s,3h),0.97(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ222.4,139.2,128.7,128.7,128.4,128.4,126.2,96.5,75.9,75.3,73.1,71.6,64.3,62.6,60.2,56.7,54.9,53.0,40.3,40.1,38.4,36.0,34.3,33.4,32.5,29.3,21.4,21.3,18.0。hresims m/z 516.3009[m+h]
+
(calcd for c
29h41
no7,516.2926)；
[0077]
化合物21c白色固体(25mg,95％)。1h nmr(600mhz,cd3od)δ7.34
–
7.28(m,2h),7.06(t,j＝8.6hz,2h),5.49(s,1h),4.94(s,1h),4.25(d,j＝10.1hz,1h),4.12(t,j＝13.7hz,2h),4.05(d,j＝10.2hz,1h),3.85(d,j＝12.6hz,1h),3.63(t,j＝10.6hz,2h),3.47(m,2h),3.15(d,j＝10.7hz,1h),2.34(q,j＝9.6,8.3hz,1h),2.24(s,3h),2.12(dt,j＝13.6,6.7hz,1h),1.96(d,j＝6.1hz,1h),1.65
–
1.63(m,1h),1.59(d,j＝7.4hz,1h),1.46(d,j＝13.0hz,1h),1.32(d,j＝4.3hz,1h),1.19
–
1.16(m,1h),1.12(s,3h),1.07(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,cd3od)δ223.6,164.6(d,j＝245.1hz),132.3(d,j＝7.8hz),132.2(d,j＝7.8hz),124.4(d,j＝3.2hz),116.4(d,j＝21.0hz),116.3(d,j＝21.0hz),98.0,77.8,77.6,74.9,73.8,66.1,64.5,61.6,58.4,57.0,55.9,42.3,41.4,39.8,35.8,34.7,33.1,30.4,22.9,21.9,19.5。hresims m/z 520.2762[m+h]
+
(calcd for c
28h38
fno7,520.2711)；
[0078]
化合物22c白色固体(26mg,95％)。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ7.98(d,j＝7.8hz,1h),7.44
–
7.37(m,2h),7.32
–
7.25(m,2h),6.52(s,1h),5.14(d,j＝11.2hz,1h),5.02(t,j＝4.4hz,1h),4.80(dd,j＝7.9,1.7hz,1h),4.37(d,j＝5.0hz,1h),4.09
–
4.02(m,2h),3.97(dd,j＝12.4,4.4hz,1h),3.84(dd,j＝10.1,1.8hz,1h),3.67(dd,j＝12.4,4.4hz,1h),3.55(d,j＝13.5hz,1h),3.41(dd,j＝11.2,6.2hz,1h),3.33
–
3.29(m,1h),3.17(d,j＝5.2hz,1h),3.00(d,j＝10.7hz,1h),2.19(m,1h),2.13(s,3h),2.05
–
1.97(m,1h),1.88
–
1.83(m,1h),1.79(td,j＝14.1,6.7hz,1h),1.53
–
1.49(m,1h),1.45
–
1.41(m,1h),1.33(dt,j＝13.7,3.4hz,1h),1.22
–
1.17(m,1h),1.12
–
1.10(m,1h),1.00(s,3h),0.97(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ222.6,137.6,132.5,131.3,131.3,128.9,128.9,97.0,76.3,76.1,73.6,72.1,64.9,63.2,60.6,57.3,55.3,54.7,49.1,40.8,38.9,35.7,33.8,32.9,29.7,21.9,21.9,18.5。hresims m/z 536.2448[m+h]
+
(calcd for c
28h38
clo7,536.2415)；
[0079]
化合物25c白色固体(27mg,96％)。1h nmr(600mhz,dmso-d6)δ8.15
–
8.10(m,1h),7.94(dd,j＝7.8,1.8hz,1h),7.91(d,j＝7.8hz,1h),7.86(d,j＝8.1hz,1h),7.54(m,2h),7.50(dd,j＝8.1,7.1hz,1h),7.45(dd,j＝7.2,1.3hz,1h),6.65(s,1h),5.23(d,j＝11.1hz,1h),5.12(t,j＝4.5hz,1h),4.81(dd,j＝7.8,1.6hz,1h),4.45(d,j＝14.0hz,1h),4.38(d,j＝5.1hz,1h),4.25(d,j＝14.1hz,1h),4.19(dd,j＝12.5,4.7hz,1h),4.10(d,j＝3.0hz,1h),3.88
–
3.83(m,1h),3.79(dd,j＝12.5,4.4hz,1h),3.45(dd,j＝11.2,6.3hz,1h),3.34
–
3.30(m,1h),3.08
–
3.03(m,1h),2.25
–
2.20(m,1h),2.19(s,3h),2.01(td,j＝13.7,7.9hz,1h),1.93
–
1.85(m,2h),1.54
–
1.44(m,3h),1.33(dt,j＝13.2,3.4hz,1h),1.20(dd,j＝13.4,3.6hz,1h),1.14(d,j＝6.2hz,1h),1.02(s,3h),0.99(s,3h)。
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ222.1,133.6,133.4,131.6,128.6,127.9,127.1,126.3,125.8,125.5,123.4,96.6,76.0,75.5,73.2,71.6,64.5,62.7,60.0,57.0,54.7,51.4,48.6,40.3,38.4,36.0,33.4,32.6,29.3,21.6,21.5,18.0。hresims m/z 552.3009[m+h]
+
(calcd for c
32h41
no7,552.2961)。
[0080]
实验例
[0081]
采用mtt法评价所有合成的冬凌草甲素含氮衍生5b、10b、11b、12b、13b、16b、17b、21b、22b、25b、5c、10c、11c、12c、13c、16c、17c、21c、22c、25c，对人乳腺癌细胞mcf-7及人非小细胞肺癌细胞a549的抗增殖活性，实验结果如说明书附图3、图4、图5和图6所示。具体操作如下。
[0082]
将冻存细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃恒温水浴锅中解冻，待冻存管内细胞解冻后，用移液枪将冻存管内细胞移入离心管，加入2ml培养液，用离心机离心三分钟(800rpm)。弃去上清液，向离心管中加入1ml培养液，用移液枪将细胞轻轻吹散混匀。另准备培养瓶，向其中加入4-5ml培养液，将吹散混匀的细胞均匀加入培养瓶中，轻轻晃动摇匀。置于37℃、5％co2的培养箱中，24h后换液或者传代。
[0083]
培养瓶中细胞长至80-90％左右可进行传代操作。弃去上清液，用2ml pbs润洗细胞两次后，加入含有25％ edta的胰酶，消化细胞1-2min。用移液枪轻轻吹打细胞使细胞不再贴壁，将其转移到离心管中，用离心机离心5min(1000rpm)。弃去上清液，向离心管中加入2ml培养液，用移液枪将细胞轻轻吹散。另准备两个培养瓶，分别向其中加入4-5ml培养液，将吹散混匀的细胞均匀分别加入两个培养瓶中，轻轻晃动摇匀，置于37℃、5％ co2的培养箱中。一般细胞传代两次左右，生长速度达到对数周期时可进行实验。
[0084]
铺板：取呈对数生长周期的细胞，弃去上清液，用2ml pbs润洗细胞两次。加入含有25％ edta的胰酶，消化细胞1-2min后，用移液枪轻轻吹打细胞使细胞不再贴壁，将其转移到离心管中，离心机离心5min(1000rpm)。弃去上清液，向离心管中加入2ml培养液，用移液枪将细胞轻轻吹散。计数板计数细胞，配置好细胞浓度后将细胞转移至96孔板中，每孔加入100μl(每孔5000个细胞)。为避免边缘效应，边缘孔加入pbs溶液，设为空白对照组。将96孔板放入培养箱中培养24h后进行加药操作。
[0085]
加药：将待测化合物溶于dmso中，配置成一定浓度的母液。用含有10％胎牛血清的
培养液将化合物浓度稀释为实验浓度。吸去96孔板中的培养基，在96孔板中加入100μl稀释后的含有药物的培养基。每个药物或者每个浓度做3-6个复孔，另外设置对照组和dmso组。加完药物处理后，将96孔板放在37℃，5％ co2培养箱中继续培养48h。避光条件下，向96孔板中每孔中加入20μl配置好的mtt溶液(mtt配置：称取50mg mtt，将其溶于pbs中配置成5g/l的溶液。pbs溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，置于4℃环境中避光保存)，将加入mtt的96孔细胞培养板放在37℃，5％ co2培养箱中避光孵育4h，显微镜下能够看到孔板底部形成深蓝色的结晶。用移液枪或注射器小心弃去培养基，注意避免吸走结晶固体。每孔加入150μl dmso试剂，摇床上充分振荡使紫色结晶充分溶解。最后，用酶标仪检测溶解后的孔板中490nm下的吸光度值，根据以下公式计算细胞抑制率。
[0086]
抑制率(ir％)＝(od
对照组-od
处理组
)/(od
对照组-od
空白组
)
×
100％
[0087]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.如式(i)所示的化合物：式中r选自：式中r选自：式中r选自：中的一种。2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：式中r选自：2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：式中r选自：
中的一种。3.如权利要求1-2任一所述的化合物的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：以冬凌草甲素和n-苯甲酰基化合物为底物，在光催化剂和共催化的催化条件下进行光催化反应；所述n-苯甲酰基化合物的结构式为式中r同式(i)化合物。4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述光催化剂包括三(2,2'-联吡啶)钌二(六氟磷酸)盐、2,4,5,6-四(9-咔唑基)-间苯二腈、三(2-苯基吡啶)合铱或铱催化剂。5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述的共催化剂包括碘化亚铜、溴化亚铜或氯化亚铜。6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述光催化反应的溶剂为二氯甲烷、乙腈、1,4-二氧六环、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。7.根据权利要求3-6所述的合成方法，其特征在于：所述冬凌草甲素、n-苯甲酰基化合物、光催化剂、共催化剂的摩尔比为1：1.1-1.5：0.02-0.05：0.1-0.3。8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述光催化反应在400-475nm的蓝色led灯照射下进行；和/或，所述光催化反应在惰性气体氛围中进行。9.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述光催化反应的反应温度为20-30℃；所述光催化反应的反应时间为36-48h。10.如权利要求1-2所述化合物的应用，其特征在于：用于制备抗癌药物。

技术总结
本发明公开了一种冬凌草甲素含氮衍生物及其合成方法和应用。所述冬凌草甲素含氮衍生物的结构式为：。本发明提供了一种所述冬凌草甲素含氮衍生物的合成方法，首次采用光催化的手段，经一步反应在冬凌草甲素16位和17位的双键碳上分别同时引入含氮官能团和含氧官能团。该反应不仅简洁高效，生成的产物也具有单一的立体构型，实现了自由基反应在复杂天然产物中的立体选择性反应。本发明的含氮冬凌草甲素衍生物，可有效抑制肿瘤细胞增殖活性，对MCF-7细胞和A549细胞有较好的抑制效果。效果。效果。


技术研发人员：李晓欢 高峰 陆尤赣
受保护的技术使用者：西南交通大学
技术研发日：2023.05.22
技术公布日：2023/8/24