一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法及其应用

1.本发明涉及纳塑料分析技术领域，尤其是涉及一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法及其应用。


背景技术：

2.作为一种新污染物的纳米材料，纳塑料(nps)广泛分布于世界各个角落，也导致人类在不知不觉中接触到nps。其中，接触途径主要有三种：摄入、吸入和直接接触。由于人类暴露于nps的风险，许多研究人员也开始评估和确定nps的危害。目前，可以知道nps对人体没有急性毒性，但它们会在人体内积累到一定程度，并对人体产生微妙的影响。此外，不仅nps的毒性会对人体造成不良影响，而且nps中的添加剂渗漏和吸附在nps表面的持久性有机污染物和重金属污染物也会造成巨大的危害和不良影响。根据文献中的报告，nps可以影响多个人类系统，包括消化系统、呼吸系统、神经系统和胎盘屏障。有害影响还包括但不限于能量消耗、体重变化、炎症、氧化损伤等。而细胞作为所有生物基本的结构和功能单位，细胞在纳米材料毒理学研究中有着非常重要的地位。更为复杂的是，纳米材料进入细胞后，会因为其特殊的性质，如巨大比表面积、表面电荷等，在细胞内分布于不同的细胞器，对特定的细胞器产生毒性效应，最终影响到生物体的生命活动。因此对细胞内的nps定量是非常有必要的。
3.前nps的定量方法主要有：目测法、色谱法、光谱法和其他方法。其优势及局限性如下：
4.目测法主要是依靠人眼观察和计数nps的颗粒数量，这种方法主要是借助显微镜或者结合称重和质量计算。这种方法的优点是成本低，缺点是人为误差干扰，而且需要非常复杂的预处理后才能直接目测观察计数。
5.色谱法是目前最常用的nps定量检测的方法，包括气相色谱-质谱(gc-ms)和液相色谱(lc)。gc-ms技术需要结合热解技术，通过热解技术将nps降解后再进行质谱分析，从而获得nps的组成信息。这种方法的优点是可以分析nps的成分和类型，并且准确度较高，缺点是只能检测nps的化学组成信息，不能直接检测nps的大小和数量，导致无法定量nps的数量和质量
3.。
6.光谱法是更为常用的nps定量检测的方法，其中使用最多的是傅里叶变换红外光谱(ft-ir)和拉曼光谱。其原理是基于光与分子相互作用产生的光谱来分析nps。这种方法是非破坏性方法，ft-ir可以显示不同聚合物的特定红外光谱，具有不同的谱带类型，而拉曼光谱是基于振动光谱。这种方法的优点是非破坏性方法，可以保持nps本身的形态，缺点是由于可解释光谱的不足，ft-ir仅适用于具有ir活性且尺寸大于20μm的微塑料(mps)。拉曼光谱对非极性官能团非常敏感，很容易受到污染物或色素的影响。
7.其他方法主要包括扫描电子显微镜结合能量色散x射线光谱(tem/edx)、表面增强拉曼光谱(sers)、浊度测定和动态光散射(dls)等。
8.综上，目前所使用的几种nps的定量方法都存在一定的局限性，且对细胞体系中的
nps研究和定量技术和研究方法还没有出现。因此，开发一种应用于细胞体系内的nps的定量方法是非常有必要的。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于提供一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法及其应用，该方法能够解决在细胞体系中nps的示踪和定量测定。
10.本发明的第一方面，提供一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法及其应用，包括以下步骤：
11.s1、将pd掺入核壳结构的纳塑料中，pd作为示踪剂位于纳塑料的核部；
12.s2、细胞培养；
13.s3、用含有步骤s1纳塑料的培养基处理步骤s2的细胞，测定细胞活力；
14.s4、通过icp-ms测定细胞中pd的浓度，再通过pd的掺杂率确定纳塑料的浓度；
15.s5、通过tem表征细胞内化纳塑料。
16.优选的，步骤s1包括：
17.s11、通过丙烯腈、氯酸钯亚钾、引发剂、表面活性剂制备掺杂pd的pan；
18.s12、向掺杂pd的pan中加入苯乙烯、二乙烯苯制备掺杂pd的核壳结构的psnps；
19.s13、表征掺杂pd的pan、掺杂pd的核壳结构的psnps。
20.优选的，步骤s11包括以下步骤：
21.s111、向烧瓶中加入水，用氮气填充，填充过程确保排气管道插入水面以下，以排除水中溶解的少量氧气影响合成效果；
22.s112、向烧瓶中加入十二烷基硫酸钠和丙烯腈并充分溶解，在磁力搅拌器的剧烈搅拌下，加入过硫酸钾溶液，充分反应；
23.s113、用注射泵将聚(乙烯二醇)4-壬基苯基3-硫代丙基醚钾和氯酸钯亚钾注入反应体系；
24.s114、反应结束时，观察烧瓶中的液体颜色，若是黄色或淡黄色时为pan合成成功；将烧瓶转移至装有冰块的不锈钢锅里，冷却降温，同时充氮气，使pan停止生长。
25.优选的，步骤s12包括：
26.s121、制备的pan重新装入一个口烧瓶中，使用磁力搅拌器剧烈搅拌并同时加热；
27.s122、将过硫酸钾溶于水中充分溶解后，快速加入烧瓶反应体系；
28.s123、将苯乙烯、二乙烯苯和去离子水混合均匀，用注射泵匀速注入烧瓶，反应完成后，在反应体系中充氮气；
29.s124、通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜和动态光散射对合成的psnps的大小和形貌进行表征；
30.s125、通过超滤测定溶解pd的释放量，研究掺杂pd的psnps的稳定性。
31.优选的，步骤s13包括：
32.s131、动态光散射仪表征pan和psnps的动态水合粒径和zeta电位；
33.s132、透射电子显微镜表征pan和psnps的粒径分布；
34.s133、扫描电子显微镜表征pan和psnps的形貌；
35.s134、psnps的稳定性；
36.s135、icp-ms表征pd的掺杂率。
37.优选的，步骤s2包括：将ges-1细胞在添加胎牛血清、抗生素的完全培养基中培养，每两天常规传代培养一次，用胰蛋白酶处理。
38.优选的，步骤s3包括：
39.s31、取对数生长期的ges-1细胞，接种于孔板中，孵育；
40.s32、将含有一系列浓度梯度psnps的培养基处理细胞；
41.s33、利用ctl发光细胞活力测定法确定每个孔中活细胞的百分比。
42.优选的，步骤s4包括：
43.s41、取对数生长期的ges-1细胞，接种于细胞培养皿中孵育；
44.s42、用含有一系列浓度梯度psnps的培养基处理细胞；
45.s43、消化离心收集细胞；
46.s44、采用王水消解细胞；
47.s45、采用icp-ms测定pd浓度，将离子pd标准溶液和rh标准溶液分别稀释为校准溶液和内标；
48.s46、根据pd的掺杂率确定psnps的浓度。
49.优选的，步骤s5包括：
50.s51、取对数生长期的ges-1细胞，接种于细胞培养皿中，孵育，用含有psnps的培养基处理细胞；
51.s52、处理结束时，用细胞刮板快速小心地刮去细胞，离心并收集在ep管中，然后丢弃上清；
52.s53、用胰蛋白酶分离细胞，制成颗粒状，并固定在戊二醛、多聚甲醛和碳酸钙酸缓冲液中；
53.s54、用锇后固定，丙酮脱水，然后嵌入，最后聚合，用超微切片仪切割；
54.s55、将超薄切片置于铜网格中，与醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅溶液进行对比，并使用配备相机的透射电子显微镜进行观察。
55.本发明的第二方面，提供了上述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法在研究纳塑料在细胞体系内的聚集和毒性效应方面的应用。
56.有益效果：
57.本发明的技术方案通过合成了一种痕量贵金属钯(pd)掺杂的nps，用于细胞体系中示踪和定量。该技术通过合成一种核壳结构的nps，将pd作为示踪剂，掺杂nps的核部分。该方法的优势在于可以通过icp-ms定量测定pd浓度，再根据中的pd掺杂率计算得到nps的量，而且pd可以聚集分布在psnps核心位置，稳定性好，对细胞无毒。该方法操作简单，定量准确，灵敏度高，重现性好是该方法的显著优势，可以很好的解决细胞体系中nps定量问题，为研究nps在细胞体系内的聚集和毒性效应提供一个很好的技术手段和评估方法。
附图说明
58.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前
提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
59.图1本发明pan和psnps的sem、tem和edx表征图，其中，a为pan的sem和tem表征图，b为psnps的sem和tem表征图，c为pan的edx表征图，d为psnps的edx表征图；
60.图2为本发明psnps的平均粒径分布直方图；
61.图3为本发明不同浓度的psnps颗粒和icp-ms测得的pd浓度的对应关系图；
62.图4为本发明设置一系列浓度梯度的psnps暴露于ges-1细胞24h或48h后的细胞活力图；
63.图5为本发明设置一系列浓度梯度的psnps暴露于ges-1细胞24h或48h后的细胞平均摄入量图；
64.图6为本发明tem表征的细胞内psnps的分布情况，其中，a为对照组tem表征图，b为psnps处理组tem表征图，箭头表示psnps颗粒。
具体实施方式
65.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
66.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
67.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
68.本实施例提供一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，包括以下步骤：
69.一、纳塑料的合成(聚苯乙烯是最常见的塑料)
70.1、制备流程
71.1)聚丙烯腈(pan)的制备
72.丙烯腈(an)作为单体，kps用作引发剂，聚(乙烯二醇)4-壬基苯基3-硫代丙基醚钾(kpe)和十二烷基硫酸钠(sds)作为表面活性剂，目的是防止反应器内纳米粒子的自发聚集。水溶性前体氯酸钯亚钾(k2pdcl4)用于乳液聚合。去离子水是本实验中所有类型聚合的反应介质，在聚合开始前用n2(g)填充反应器，避免由于氧气的存在导致任何自由基失活。具体的制备过程如下：
73.(1)提前向一个干燥洁净的三口烧瓶中加入40ml水，用氮气填充30min，填充过程确保排气管道插入水面以下，以排除水中溶解的少量氧气影响合成效果；
74.(2)在三口烧瓶中加入0.19g十二烷基硫酸钠(sds)和7.8ml丙烯腈(acn)并充分溶解。然后，在磁力搅拌器的剧烈搅拌下，加入5ml，0.14mol/l过硫酸钾溶液(kps)，反应2min；
75.(3)尽量在2min内用注射泵将5ml，15g/l的聚(乙烯二醇)4-壬基苯基3-硫代丙基醚钾(kpe)和5ml,0.08mol/l的氯酸钯亚钾(k2pdcl4)溶液以相同的速度注入反应体系；
76.(4)反应结束时，观察三口烧瓶中的液体颜色，若是黄色或淡黄色时为pan合成成功。将三口瓶转移至装有冰块的不锈钢锅里，冷却降温(冰浴)，同时充n2，目的是为了使pan停止生长。
77.2)聚苯乙烯纳塑料(psnps)的制备
78.将上述制备pan重新装入一个干燥洁净的三口烧瓶中，使用磁力搅拌器剧烈搅拌并同时加热至60℃左右。然后，将0.23g kps溶于5ml水中充分溶解后，快速加入三口烧瓶反应体系。随后，将10.7g苯乙烯、0.42g二乙烯苯(dvb)和21ml去离子水混合均匀，用注射泵匀速注入反应器，流速为0.06ml/min。反应完成后，在反应器中充n
2 24h。通过扫描电子显微镜(sem)、透射电子显微镜(tem)和动态光散射(dls)对合成的psnps的大小和形貌进行表征。通过超滤测定溶解pd的释放量，研究psnps(pd)的稳定性。
79.2、表征手段
80.1)动态光散射仪表征pan和psnps的动态水合粒径(dls)和zeta电位
81.将制得的psnps稀释一定浓度至1ml，超声处理10min使其分散均匀，使用粒度分析仪在25℃条件下测定并记录纳米颗粒的动态水合粒径和zeta电位，独立实验平行进行三次(如表1所示)。
82.表1在不同介质中pan和psnps的dls和zeta电位
83.[0084][0085]
从表1中可以看出pan和psnps颗粒在三种介质中分散性很好，水合粒径均在150nm左右。
[0086]
psnps的平均粒径分布直方图见图2，通过拟合得到psnps平均粒径为149.16
±
23.17nm。
[0087]
2)透射电子显微镜(tem)表征pan和psnps的粒径分布
[0088]
利用超纯水稀释psnps至一定浓度后，超声处理使其分布均匀。用移液枪吸取10μl样品分散体滴加到碳膜铜网中，再利用红外光照射使其干燥。透射电子显微镜对psnps尺寸进行拍照检测,使用nano measure1.2软件和高斯拟合对样品的尺寸分布进行分析处理，每个样品至少统计200个颗粒。
[0089]
为了更加直观显示pd在psnps中的分散情况，对所合成的pan和psnps进行tem分析的同时进行能谱分析(edx)。这两种方法的结合，可以成像pd在psnps颗粒中的分布。
[0090]
3)扫描电子显微镜(sem)表征pan和psnps的形貌
[0091]
利用超纯水稀释psnps至一定浓度后，超声处理使其分布均匀。用移液枪吸取20μl样品分散体滴加到导电胶上，真空干燥后，使用溅射涂布机对样品溅射和镀金处理，使用场发射扫描电子显微镜对样品形貌进行拍照检测。
[0092]
pan和psnps的sem、tem和edx表征结果见图1，可以从表征图中看出，pan核为规则的球状结构，合成的psnps颗粒是形如树莓的簇状核壳结构，pd主要聚集在pan核上。
[0093]
4)psnps的稳定性
[0094]
利用超纯水、人工溶酶体液、rpmi-1640培养基将psnps稀释至一系列浓度梯度(320、80、20μg/ml)。在恒温摇床上振荡60天，分别在振荡前、30天、60天时取一次样，高速离心取上清，利用icp-ms测定pd的浓度(如表2所示)。
[0095]
表2在不同条件下psnps的pd浸出情况
[0096][0097]
从表2中可以看出经过60天的震荡后，在不同条件下，psnps释放的pd均低于2％，可忽略不计，说明psnps是稳定的。
[0098]
5)电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-ms)表征pd的掺入率
[0099]
取1ml psnps样品加入10ml离心管中，用封口膜封口后，置于冷冻干燥机上干燥，用电子天平称量样品干燥后的质量，通过计算得到样品的质量浓度。独立实验平行进行三次。再取一定体积的一系列浓度梯度(0，5，10，20，50，100，200，500，1000μg/ml)样品加入10ml离心管中，用王水加热消解过夜后，利用icp-ms测定pd浓度，通过线性回归曲线拟合得到样品中pd的掺杂率。
[0100]
不同浓度的psnps颗粒和icp-ms测得的pd浓度的对应关系结果如图3所示：通过线性回归分析得到psnps与pd存在线性关系，且r2为0.9988，由此得出pd的掺杂率为0.64％。
[0101]
二、细胞培养
[0102]
人胃上皮细胞(ges-1)在添加10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素抗生素的rpmi-1640完全培养基中培养，为了维持细胞培养，每两天常规传代培养一次，用含有1％胰蛋白酶处理。
[0103]
三、细胞活力测定
[0104]
取对数生长期的ges-1细胞，接种于96孔板中，密度为4000个/ml，孵育24h。将含有一系列浓度梯度psnps(1、5、10、20、40、80、160、320、640μg/ml)的培养基处理细胞24h或48h。利用celltiter-lumi
tm
(ctl)发光细胞活力测定法确定每个孔中活细胞的百分比，测定试剂盒来自碧云天。各实验组细胞活力的相对水平由仅添加细胞培养基的实验组归一化得到。
[0105]
设置一系列浓度梯度的psnps暴露于ges-1细胞24h或48h后的细胞活力，结果如图4所示：24h和48h后，与对照组相比，细胞活力无明显变化，说明psnps对细胞几乎无毒。
[0106]
四、细胞摄入定量
[0107]
1)细胞接种
[0108]
取对数生长期的ges-1细胞，接种于10cm细胞培养皿中孵育24h，密度为8
×
104个/ml。
[0109]
2)加药
[0110]
用含有一系列浓度梯度psnps(用rpmi-1640培养基稀释)的培养基处理细胞24h或48h。每个浓度做4个平行。
[0111]
3)消化离心收集细胞
[0112]
孵育结束时，将含有psnps的培养基丢弃，用pbs仔细清洗7次，以完全去除未进入细胞的物质。每盘加入2ml胰蛋白酶消化2min，然后加入2ml培养基终止消化。用移液枪小心吹匀后，每皿取20μl用于细胞计数。将剩余的细胞悬液放入15ml离心管中，离心收集细胞，小心倒掉上清液。
[0113]
4)王水消解
[0114]
每管加入2ml王水，得到的混合物在90℃下加热24h。消化后，所得溶液蒸发至约0.5ml，然后用超纯水稀释至5ml。
[0115]
5)icp-ms测定pd浓度
[0116]
用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms)测定pd浓度。将离子钯(pd)标准溶液(1000mg/l)和铑(rh)标准溶液(10mg/l)分别稀释为校准溶液和内标。
[0117]
6)计算
[0118]
根据pd的掺杂率确定psnps的浓度
[0119]
设置一系列浓度梯度的psnps暴露于ges-1细胞24h或48h后的细胞平均摄入量结果如图5所示：处理48h后细胞摄入psnps量明显比24h多，且细胞摄入psnps量呈现浓度依赖性。psnps的检测限在暴露24h后为40μg/ml，在暴露48h后为80μg/ml。
[0120]
结果表明本发明的方法可以很好的解决细胞体系中nps定量问题，为研究nps在细胞体系内的聚集和毒性效应提供一个很好的技术手段和评估方法。
[0121]
五、tem表征细胞内化psnps
[0122]
取对数生长期的ges-1细胞，接种于10cm的细胞培养皿中，密度为8
×
104个/ml，孵育24h，用含有psnps的rpmi-1640培养基处理细胞24h。处理结束时，用细胞刮板快速小心地刮去细胞，离心并收集在ep管中，然后丢弃上清。随后，用胰蛋白酶分离细胞，制成颗粒状，并固定在2.5％(v/v)戊二醛和2％(w/v)多聚甲醛和0.1m碳酸钙酸缓冲液中，ph值为7.4。样品首先用锇后固定，丙酮脱水，然后嵌入，最后在60℃下聚合，用超微切片仪切割。将超薄切片置于铜网格中，与醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅溶液进行对比，并使用配备相机的jeol 1400透射电子显微镜进行观察。
[0123]
tem表征的细胞内psnps的分布情况结果如图6所示，结果表明：对照组细胞内不含psnps，psnps处理组中箭头表示psnps颗粒，表明ges-1细胞确实存在内化psnps。
[0124]
六、数据分析
[0125]
实验数据以至少三个独立测定值的平均值
±
标准差(sd)表示。单因素方差分析和
tukey检验用于分析实验组之间的差异。所有统计计算和分析分别使用spss 26和graphpad 9.0软件进行。定义以*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001有统计学意义。
[0126]
表3为本发明所用到的实验材料和试剂。
[0127]
表4为本发明所用到的实验设备和仪器。
[0128]
表3实验材料和试剂
[0129][0130][0131]
[0132]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：
1.一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将pd掺入核壳结构的纳塑料中，pd作为示踪剂位于纳塑料的核部；s2、细胞培养；s3、用含有步骤s1纳塑料的培养基处理步骤s2的细胞，测定细胞活力；s4、通过icp-ms测定细胞中pd的浓度，再通过pd的掺杂率确定纳塑料的浓度；s5、通过tem表征细胞内化纳塑料。2.根据权利要求1所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s1包括：s11、通过丙烯腈、氯酸钯亚钾、引发剂、表面活性剂制备掺杂pd的pan；s12、向掺杂pd的pan中加入苯乙烯、二乙烯苯制备掺杂pd的核壳结构的psnps；s13、表征掺杂pd的pan、掺杂pd的核壳结构的psnps。3.根据权利要求2所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s11包括以下步骤：s111、向烧瓶中加入水，用氮气填充，填充过程确保排气管道插入水面以下，以排除水中溶解的少量氧气影响合成效果；s112、向烧瓶中加入十二烷基硫酸钠和丙烯腈并充分溶解，在磁力搅拌器的剧烈搅拌下，加入过硫酸钾溶液，充分反应；s113、用注射泵将聚(乙烯二醇)4-壬基苯基3-硫代丙基醚钾和氯酸钯亚钾注入反应体系；s114、反应结束时，观察烧瓶中的液体颜色，若是黄色或淡黄色时为pan合成成功；将烧瓶转移至装有冰块的不锈钢锅里，冷却降温，同时充氮气，使pan停止生长。4.根据权利要求2所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s12包括：s121、制备的pan重新装入一个口烧瓶中，使用磁力搅拌器剧烈搅拌并同时加热；s122、将过硫酸钾溶于水中充分溶解后，快速加入烧瓶反应体系；s123、将苯乙烯、二乙烯苯和去离子水混合均匀，用注射泵匀速注入烧瓶，反应完成后，在反应体系中充氮气；s124、通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜和动态光散射对合成的psnps的大小和形貌进行表征；s125、通过超滤测定溶解pd的释放量，研究掺杂pd的psnps的稳定性。5.根据权利要求2所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s13包括：s131、动态光散射仪表征pan和psnps的动态水合粒径和zeta电位；s132、透射电子显微镜表征pan和psnps的粒径分布；s133、扫描电子显微镜表征pan和psnps的形貌；s134、psnps的稳定性；s135、icp-ms表征pd的掺杂率。6.根据权利要求1所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s2包括：将ges-1细胞在添加胎牛血清、抗生素的完全培养基中培养，每两天常规传代培养一次，
用胰蛋白酶处理。7.根据权利要求1所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s3包括：s31、取对数生长期的ges-1细胞，接种于孔板中，孵育；s32、将含有一系列浓度梯度psnps的培养基处理细胞；s33、利用ctl发光细胞活力测定法确定每个孔中活细胞的百分比。8.根据权利要求1所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s4包括：s41、取对数生长期的ges-1细胞，接种于细胞培养皿中孵育；s42、用含有一系列浓度梯度psnps的培养基处理细胞；s43、消化离心收集细胞；s44、采用王水消解细胞；s45、采用icp-ms测定pd浓度，将离子pd标准溶液和rh标准溶液分别稀释为校准溶液和内标；s46、根据pd的掺杂率确定psnps的浓度。9.根据权利要求1所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法，其特征在于，步骤s5包括：s51、取对数生长期的ges-1细胞，接种于细胞培养皿中，孵育，用含有psnps的培养基处理细胞；s52、处理结束时，用细胞刮板快速小心地刮去细胞，离心并收集在ep管中，然后丢弃上清；s53、用胰蛋白酶分离细胞，制成颗粒状，并固定在戊二醛、多聚甲醛和碳酸钙酸缓冲液中；s54、用锇后固定，丙酮脱水，然后嵌入，最后聚合，用超微切片仪切割；s55、将超薄切片置于铜网格中，与醋酸铀酰和雷诺柠檬酸铅溶液进行对比，并使用配备相机的透射电子显微镜进行观察。10.根据权利要求1-9任一项所述的细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法在研究纳塑料在细胞体系内的聚集和毒性效应方面的应用。

技术总结
本发明涉及纳塑料分析技术领域，尤其是涉及一种细胞体系中纳塑料的示踪与定量方法及其应用，包括以下步骤：S1、将Pd掺入核壳结构的纳塑料中，Pd作为示踪剂位于纳塑料的核部；S2、细胞培养；S3、用含有步骤S1纳塑料的培养基处理步骤S2的细胞，测定细胞活力；S4、通过ICP-MS测定细胞中Pd的浓度，再通过Pd的掺杂率确定纳塑料的浓度；S5、通过TEM表征细胞内化PSNPs。本发明的方法能够解决在细胞体系中纳塑料的示踪和定量测定。踪和定量测定。踪和定量测定。


技术研发人员：周宏钰 黄欣欣 刘建 莫宇聪 文宇婷 周小霞 闫兵
受保护的技术使用者：广州大学
技术研发日：2023.05.24
技术公布日：2023/8/24