一种深海神盾螺抗菌肽Gigantin及其应用的制作方法

一种深海神盾螺抗菌肽gigantin及其应用
技术领域
1.本发明属于海洋生物来源的多肽技术领域，具体涉及一种从深海热液区获得的神盾螺(gigantopelta)中发现的抗菌肽gigantin及其应用。


背景技术：

2.抗菌肽为内源性非特异性免疫系统重要组成部分，在水产动物免疫防御机制中发挥重要作用。抗菌肽具有广谱性、低耐药性的优点，在水产养殖业中可替代抗生素,缓解因抗生素和药物大量使用造成的养殖动物药物残留、病原菌耐药性增强以及水环境污染等问题；并能够显著提高水产动物的生长性能和免疫功能(胡丰晓等，2019)。目前在水生无脊椎动物(水母、贝、虾、蟹等)和脊椎动物(鱼类)中都有抗菌肽的发现。其中软体动物抗菌肽主要来自于牡蛎、扇贝等常见物种，但还未见腹足类水生动物抗菌肽的报道。
3.深海是地球上最大的生态系统，拥有许多独特的生物资源，是发现新化合物和生物活性物质的来源。深海热液生态系统主要以化能自养微生物为初级生产力。在体表或体内共生的高密度微生物，为底栖无脊椎动物提供能量和碳源。热液区无脊椎动物的生存与其共附生菌密切相关。因此，与近海动物相比，抗菌肽作为非特异性免疫屏障，在深海热液区无脊椎动物体内和体外免疫防御中的作用更加重要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种抗菌肽gigantin及其应用，本发明的抗菌肽gigantin对革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌)都具有抗菌活性，且对革兰氏阳性菌的抑制效果更强。本发明的抗菌肽gigantin具有低溶血活性，良好的耐热耐盐耐酸碱能力。因此，本发明抗菌肽gigantin有潜力成为抗生素的替代品，在水产养殖动物养殖业中挥作用。
5.本发明首先提供一种抗菌肽gigantin，所述抗菌肽gigantin的氨基酸序列为mltvlryviqglhhcsgipgrslksnmetktrsgrc(seq id no：1)
6.所述的抗菌肽gigantin有36个氨基酸残基，其分子量为4030.76da，等电点为10.31，其预测的二级结构为α-螺旋结构。
7.本发明还保护所述的神盾螺抗菌肽gigantin在制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂中的应用。
8.本发明还保护所述的抗菌肽gigantin的衍生肽，是在氨基酸序列为seq id no.1的多肽上经过取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有与抗菌肽gigantin相同或类似功能的抗菌肽；
9.所述的衍生肽，其与抗菌肽gigantin具有90％或以上的同源性，即不超过4个氨基的差异；
10.更进一步的，所述的衍生肽，其包含抗菌肽gigantin功能域lryviqglhh 90％或以上的同源性序列，即不超过1个氨基的差异；
11.本发明再一个方面还提供所述的抗菌肽gigantin或衍生肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。
12.本发明的抗菌肽gigantin或衍生肽还可用于制备水产动物饲料添加剂、免疫增强剂、食品防腐剂等。
13.本方面再一个方面提供一种抗菌制品，所述的抗菌制品中包含有上述的抗菌肽gigantin或衍生肽。
14.本发明提供了一种神盾螺来源的抗菌肽gigantin，经实验证明，该抗菌肽gigantin对革兰氏阳性菌(金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌)都有抗菌活性，抗菌作用快且较强，且溶血性低，耐热能力、耐盐能力和耐酸碱能力强。本发明的抗菌肽gigantin在水产动物养殖业有较好的应用前景。
附图说明
15.图1为本发明抗菌肽gigantin的高效液相色谱图。
16.图2为本发明抗菌肽gigantin的质谱图。
17.图3为本发明抗菌肽gigantin的抑菌活性测定结果，图中的1-7的数字代表抗菌肽的不同浓度，分别是15mg/ml、7.5mg/ml、3.75mg/ml、1.88mg/ml、0.94mg/ml、0.47mg/ml和0.23mg/ml；8代表阴性对照，去离子水；9代表阳性对照，50μg/ml庆大霉素。
18.图4为抗菌肽gigantin的溶血率测定结果图。
19.图5为抗菌肽gigantin的热稳定性测定结果图，其中上方图中1-6的数字代表不同温度处理后的抗菌肽，分别为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃；1
′‑6′
是阴性对照，代表对应温度下做相同处理的去离子水。上方左图为处理30min后的抗菌肽的抑菌活性测定结果，右图为处理60min后的抗菌肽的抑菌活性测定结果。
20.图6为抗菌肽gigantin对ph的稳定性的测定结果图，其中左图中1-5的数字代表不同ph，分别为2、4、6、8、10；图中1
′‑5′
是阴性对照，代表对应ph值的缓冲液。
21.图7为抗菌肽gigantin的耐盐性测定结果图，其中左图中1-5的数字代表不同的盐离子浓度，分别是50mm、100mm、150mm、200mm、250mm；1
′‑5′
是阴性对照，代表对于盐离子浓度的去离子水。
具体实施方式
22.神盾螺(gigantopelta aegis)取自西南印度洋洋中脊深海热液区，从神盾螺中发现的抗菌肽gigantin，其结构域查找(http://pfam.xfam.org/)发现与其序列同源性最高的抗菌肽为从蟾蜍pseudis paradoxa中分离的pseudin，其序列间仅有5个氨基酸的匹配。因此，gigantin是从深海热液极端环境生物中发现的新型、与其它物种中的序列同源性很低的抗菌肽。该抗菌肽对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有抑制活性，能够抑制水产动物病原弧菌。同时该抗菌肽具有较高的热稳定性，能够更好地耐受水产动物饲料添加剂或免疫制剂生产过程中的高温处理过程，在水产动物养殖业中具有较好的应用前景。
23.本发明所提供的抗菌肽gigantin，其氨基酸序列如下：mltvlryviqglhh csgipgrslksnmetktrsgrc(seq id no：1)，
24.所述的抗菌肽gigantin有36个氨基酸残基，其分子量为4030.76da，等电点为
10.31，其预测的二级结构为α-螺旋结构。
25.本发明还保护抗菌肽gigantin的衍生肽，即在序列为seq id no：1的多肽上通过取代、取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有与抗菌肽gigantin功能域序列lryviqglhh具有95％或以上的同源性，即不超过1个氨基的差异。
26.本发明再一个方面还提供所述的抗菌肽gigantin或衍生肽在制备治疗革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染的药物。
27.本发明的抗菌肽gigantin或衍生肽还可用于制备水产动物饲料添加剂、免疫增强剂等。
28.本方面再一个方面提供一种抗菌制品，所述的抗菌制品中包含有上述的抗菌肽gigantin或衍生肽。
29.本发明所述的抗菌肽gigantin由采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相化学合成法合成，合成方向为从c端到n端，纯度≥95％。
30.以下结合实施例及附图对本发明作进一步详细地描述，但实施例不限制本发明的范围。
31.实施例1：筛选抗菌肽gigantin
32.本发明抗菌肽gigantin从深海热液区底栖动物神盾螺的转录组测序数据中筛选出来的。根据转录组数据的pfam注释筛选出被注释为抗菌肽的核酸序列，再将其翻译为氨基酸序列。使用emboss programs和protparam分析上述氨基酸序列的理化性质，最终筛选出抗菌肽gigantin，其氨基酸序列为mltvlryviq glhhcsgipgrslksnmetktrsgrc(seq id no：1)。
33.该抗菌肽gigantin含有36个氨基酸残基，其分子量为4030.76da，等电点为10.31。所述抗菌肽带正电荷，可结合细菌膜表面的负电荷。
34.本发明的抗菌肽gigantin可采用自动多肽合成仪按照常规多肽固相化学合成法合成，合成抗菌肽gigantin经半制备型高效液相色谱仪进行纯化分析处理，其纯度≥95％(图1)。采用液相色谱质谱联用仪测定所得产品抗菌肽的分子量，以确认鉴定为本发明抗菌肽gigantin(图2)。
35.实施例2:抗菌肽gigantin的抑菌活性分析
36.采用琼脂平板扩散法来测定抗菌肽gigantin的抑菌活性，受试微生物菌株包括：金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌，金黄葡萄球菌cmcc26003、枯草芽孢杆菌cmcc63501、铜绿假单胞菌cmcc10104购自苏州中芯启恒科学仪器有限公司，副溶血弧菌atcc17802和溶藻弧菌atcc 17749来自实验室保存菌株。
37.按照1％的接种量将金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌接种到lb培养基(其中由于溶藻弧菌和副溶血弧菌属于嗜盐菌，因此将它们接种到3％氯化钠的lb培养基中)，置于37℃摇床中，150r/min震荡培养，直至od600值达到1左右；用lb培养基稀释上述受试菌，使其菌体密度约为2
×
10
5-2
×
107cfu/ml，取500μl稀释后的受试菌液，用棉签将其均匀涂布在lb平板上；待菌液被充分吸收后，将培养皿分为9个区域，每个区域中心放置无菌的滤纸片(直径6mm)，使之与培养基充分贴合；从-80℃冰箱中取出冻干的抗菌肽gigantin，用去离子水溶解，使抗菌肽的浓度为0.24-15mg/ml；取不同浓度的抗菌肽各15μl，缓慢滴在滤纸片上，使其均匀扩散，此外，设置50μg/ml庆大霉素为阳性对
照组，以去离子水为阴性对照组；平板晾干后用封口膜封住，于37℃培养箱倒置培养5-8h，测定抑菌圈直径大小以评估抗菌肽的抑菌活性；每个受试菌设置三次平行实验。
38.如图3所示，本发明的抗菌肽gigantin对枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌、铜绿假单胞菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌均具有较好的抑菌活性，且对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌)的抑菌效果强于革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌)。此外，从图3中可以看出，50μg/ml浓度的庆大霉素没有抑制溶藻弧菌、溶藻弧菌hd-1和副溶血弧菌的生长，而本发明的抗菌肽gigantin能够抑制。因此，本发明的抗菌肽gigantin在水产养殖业具有良好的应用前景。
39.实施例3：抗菌肽gigantin的溶血性分析
40.取新鲜花鲢鱼血液5ml，1500g离心5分钟，弃上层血清，收集下层红细胞，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤，1500g离心5分钟，弃上清，重复该步骤至上清为无色、透明，再用pbs制成浓度为1％的红细胞悬浮液。用pbs将抗菌肽gigantin的浓度调至0.2-25.6mg/ml，每个1.5ml ep管中加入20μl不同浓度的抗菌肽，然后加入80μl红细胞悬浮液。以pbs为阴性对照(溶血率0％)，以tritonx-100为阳性对照(溶血率100％)，37℃反应12h后，将上清液依次加入96孔板中，用酶标仪测定570nm处的od值。上述实验设置三个平行。根据公式溶血率(％)＝(试验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)计算溶血率，结果见图4。
41.由图4可知，随着抗菌肽浓度的增高，其溶血性也不断增高，但在5.12mg/ml的浓度内，溶血率均低于21％，说明抗菌肽gigantin的安全性高，可以应用到动物生产中去。
42.实施例4：抗菌肽gigantin的耐热性分析
43.将浓度为10.24mg/ml的抗菌肽gigantin溶液分别置于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃条件下作用30min和60min；然后按照上述的琼脂平板扩散法分析抑菌活性，受试菌株为金黄葡萄球菌cmcc26003，结果见图5。
44.由图5可知，在40-90℃下处理30min后，抑菌圈直径均没有明显变化，抗菌肽活性处于稳定状态；在40-90℃下处理60min后，抑菌圈直径虽然没有明显的变化，但随着温度的升高，抑菌圈逐渐模糊，说明抗菌肽gigantin对金黄葡萄球菌的抑菌活性逐渐降低。以上结果表明，高温处理后的抗菌肽gigantin仍能保持较好的抑菌活性，热稳定性好。
45.实施例5：抗菌肽gigantin对ph的稳定性分析
46.用ph值分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0的缓冲液溶解抗菌肽至10.24mg/ml，37℃下处理4h，然后按照上述的琼脂平板扩散法分析抑菌活性，受试菌株为金黄葡萄球菌cmcc26003，结果见图6。
47.由图6可知，抗菌肽gigantin在不同的ph值缓冲液的处理下，抑菌圈直径并没有显著变化，说明抗菌肽gigantin具有较好的耐酸碱能力，在不同ph条件下能够保持活性稳定。
48.实施例6：抗菌肽gigantin的耐盐性分析
49.配制1m氯化钠溶液和1m氯化钾溶液，再稀释为50、100、150、200、250mm，用以上浓度的盐溶液分别溶解抗菌肽gigantin，使其终浓度为10.24mg/ml；溶解后将抗菌肽gigantin置于室温条件下放置30分钟，然后按照上述的琼脂平板扩散法分析抑菌活性，受试菌株为金黄葡萄球菌cmcc26003，结果见图7。
50.由图7可知，在50-200mm氯化钠溶液处理后的抗菌肽，抑菌圈直径没有显著变化，
抗菌肽活性稳定，但随着盐离子浓度的升高(200mm)，抑菌圈有模糊的情况，说明抗菌肽gigantin的抑菌活性呈下降趋势。同样，在50-150mm氯化钾溶液处理后的抗菌肽，抑菌圈直径没有显著变化，抗菌肽活性稳定，但随着盐离子浓度的升高(200-250mm)，抑菌圈有模糊的情况，说明抗菌肽gigantin的抑菌活性呈下降趋势。由此表明，在高盐度(高于生理浓度)处理下，抗菌肽gigantin能够保持较好的抑菌活性，说明抗菌肽gigantin具有较好的耐盐性。
51.综上所述，本发明抗菌肽gigantin能够有效抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，抗菌范围较广、溶血性低，同时具有良好的耐热性、耐盐性和耐酸碱能力。因此，本发明抗菌肽gigantin在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌所致疾病的药物中具有潜在的发展前景，此外，还可应用于动物饲料、食品防腐等行业中。

技术特征：
1.一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列为seq id no：1。2.权利要求1所述的抗菌肽的衍生肽，其特征在于，所述的衍生肽是在氨基酸序列为seq id no.1的多肽上经过取代、缺失、添加一个或数个氨基，且具有与氨基酸序列为seq id no.1的抗菌肽具有相同或类似功能的多肽。3.如权利要求2所述的衍生肽，其特征在于，所述的衍生肽与权利要求1所述的抗菌肽具有90％或以上的同源性。4.如权利要求2所述的衍生肽，其特征在于，所述的衍生肽与权利要求1所述的抗菌肽的功能域lryviqglhh存在90％或以上的同源性。5.权利要求1所述的抗菌肽或权利要求2所述的衍生肽在制备抗菌药物中的应用。6.一种抗菌药物，其特征在于，所述的抗菌药物中包含有药理有效浓度的权利要求1所述的抗菌肽和/或权利要求2所述的衍生肽。7.权利要求1所述的抗菌肽或权利要求2所述的衍生肽作为饲料添加剂的应用。8.一种水产饲料，其特征在于，所述的水产饲料中添加有权利要求1所述的抗菌肽和/或权利要求2所述的衍生肽。9.权利要求1所述的抗菌肽或权利要求2所述的衍生肽作为免疫增强剂的应用。10.权利要求1所述抗菌肽或权利要求2所述衍生肽作为防腐剂的应用。

技术总结
本发明提供一种抗菌肽Gigantin及其应用，本发明的抗菌肽Gigantin的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的来源于神盾螺的抗菌肽Gigantin对革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌都有抗菌活性，抗菌作用快且较强，且溶血性低，耐热能力、耐盐能力和耐酸碱能力强。本发明的抗菌肽Gigantin在水产动物养殖业都有较好的应用前景。都有较好的应用前景。都有较好的应用前景。


技术研发人员：刘晨临 牛圆圆
受保护的技术使用者：自然资源部第一海洋研究所
技术研发日：2023.06.15
技术公布日：2023/8/28