1-O-乙酰基-6-O-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备防治哮喘药物中的应用

o-异丁酰基大花旋覆花内酯。
14.优选的，所述药物中1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯的有效剂量为1％-99％。
15.本发明的有益效果：
16.本发明首次提出1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯具有防治哮喘的作用，本发明通过体内和体外实验证明1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone可以通过减少粘蛋白5ac(muc5ac)mrna的表达从而对哮喘类疾病起到防治作用。另外，1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone具有很强的抗炎作用、较低的细胞毒性和显著的一氧化氮(no)抑制活性。本发明首次提出1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone能够有效地改善哮喘机体肺功能，减少哮喘机体血清中卵清蛋白(ova)特异性ige含量，降低肺组织和支气管肺泡灌洗液(balf)中炎症因子和muc5ac的表达并发现其通过抑制pi3k/akt/mek/erk信号通路从而起到抗哮喘作用。
附图说明
17.图1为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对raw264.7细胞毒性影响；
18.图2为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对nci-h292细胞毒性影响；
19.图3为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对一氧化氮的抑制作用；
20.图4为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone抑制il-1β的生成；
21.图5为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone抑制il-4的生成；
22.图6为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone抑制muc5ac mrna的表达；
23.图7为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对哮喘小鼠肺功能的影响，由左至右分别为对肺活量、动态肺顺应性、呼气阻力和吸气阻力的影响；
24.图8为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对哮喘小鼠血清ova特异性ige的影响；
25.图9为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对哮喘小鼠balf中il-4和il-6的影响，左图为对哮喘小鼠balf中il-4的影响，右图为对哮喘小鼠balf中il-6的影响；
26.图10为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对哮喘小鼠肺组织病理的影响，由上至下、由左至右分别为h&e染色切片结果、h&e染色统计结果、pas染色切片结果、pas染色统计结果；
27.图11为1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对哮喘小鼠肺组织细胞因子和muc5ac的影响，由上至下、由左至右分别为对哮喘小鼠肺组织il-1β、il-4、il-5、il-6、il-13和muc5ac的影响；
28.图12为小鼠肺组织中pi3k/akt/mek/erk通路蛋白的表达，a图为western blot结果，b-e分别为p-pi3k/pi3k、p-akt/akt、p-mek/mek和p-erk/erk的相对强度统计结果。
具体实施方式
29.本发明提供了1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备防治哮喘药物中的应用。
30.在本发明中，所述1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯的化学结构为
isobutyrylbritannilactone高剂量组(20mg/kg)。除对照组外，其余各组小鼠分别于第1、7、14天腹腔注射致敏物(50μg ova和2mg明矾溶于200μlpbs)。第21～26天，将20μl 5％ova溶液滴入小鼠鼻内，同时用超声雾化器将5％ova雾化30min。对照组小鼠用20μlpbs处理，并用相同体积的pbs进行雾化。第24～26天，雾化及滴鼻前，分别腹腔注射200μl不同剂量药物。末次雾化24h内，测试其肺功能，处死小鼠。然后，留取支气管肺泡灌洗液(balf)、血清和肺组织标本。
57.小鼠肺功能检测采用anires 2005系统，末次雾化24h内，麻醉小鼠打开胸腔使用气管插管，在小鼠昏迷状态评估其肺功能，然后计算肺活量(fvc)、动态肺顺应性(cdyn)呼气阻力(re)和吸气阻力(ri)。结果如图7所示。1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone能显著改善哮喘小鼠的肺功能，其中最高剂量组与阳性对照(地塞米松，2mg/kg)作用相当。
58.小鼠肺功能测试结束后，通过眼眶取血，离心后得到血清，使用elisa试剂盒检测血清中ova特异性ige的含量。结果如图8所示。哮喘的特征是血清中的ige水平升高。与对照组相比，ova组小鼠血清中ova特异性ige浓度明显升高。而1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone(5和20mg/kg)能够降低ova特异性ige水平。
59.眼眶取血后，得到支气管肺泡灌洗液(balf)，使用elisa试剂盒检测balf中il-4和il-6的含量。结果如图9所示。与对照组相比，ova组小鼠balf中il-4和il-6含量升高，而1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone高剂量组(20mg/kg)可以很明显地降低il-4和il-6的水平。
60.小鼠肺组织病理变化
61.肺组织用10％福尔马林溶液固定，石蜡包埋。然后将厚度为5微米的切片用苏木精和伊红(h&e)染色观察炎症细胞的浸润情况，并用pas(过碘酸-schiff)溶液染色评估muc5ac的表达情况。结果如图10所示，h&e染色显示ova诱导小鼠肺部炎症和支气管周围炎性细胞浸润，然而，1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone(5mg kg和20mg/kg)和地塞米松(2mg/kg)显著恢复了这种炎症变化。此外，通过pas染色检测了1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone对肺组织黏液蛋白高分泌的影响，显示ova致敏小鼠肺组织分泌大量黏液，1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone高剂量组和dex组则明显减少。
62.小鼠肺组织中il-1β、il-4、il-5、il-6、il-13和muc5ac的表达
63.使用triquick reagent提取小鼠肺组织中总rna，使用纳米微滴8000分光光度计进行定量。然后，使用ⅱ1st strand cdna synthesis supermix反转录获得cdna。使用sybr greenerqpcr supermixuniversal进行qrt-pcr。采用2-δδct
法，以内源性内参基因(gapdh)为内参，定量il-1β，il-4，il-5，il-6，il-13和muc5ac基因表达。结果如图11所示。ova哮喘小鼠肺组织中il-1β，il-4，il-5，il-6，il-13和muc5ac mrna的水平明显增加，而1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone(5mg/kg和20mg/kg)和dex(2mg/kg)可以明显的改善这种情况。
64.小鼠肺组织中pi3k/akt/mek/erk通路蛋白的表达
65.从ova诱导的哮喘小鼠肺组织中提取蛋白，用bca试剂盒测定蛋白含量。采用westernblot分析pi3k/akt/mek/erk通路蛋白的含量。结果如图12所示，在ova诱导的哮喘小鼠中，pi3k/akt信号通路的活化被激活，p-mek/mek和p-erk/erk的相对强度也明显增加。
然而，1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone能显著缓解pi3k/akt/mek/erk的激活，且呈剂量依赖性。可见1-o-acetyl-6-o-isobutyrylbritannilactone通过抑制pi3k/akt/mek/erk信号通路产生抗哮喘作用。
66.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备防治哮喘药物中的应用。2.1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备抑制哮喘机体炎症药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制哮喘机体炎症包括抑制机体il-1β、il-4、il-5、il-6和il-13的表达。4.1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备抑制哮喘机体黏液分泌药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制哮喘机体黏液分泌包括减少粘蛋白5acmrna的表达。6.1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备改善哮喘机体肺功能药物中的应用。7.1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备抑制哮喘机体pi3k/akt/mek/erk信号通路药物中的应用。8.一种防治哮喘的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯。9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物中1-o-乙酰基-6-o-异丁酰基大花旋覆花内酯的有效剂量为1％-99％。

技术总结
本发明提供了1-O-乙酰基-6-O-异丁酰基大花旋覆花内酯在制备防治哮喘药物中的应用，属于生物医药工程技术领域。本发明首次提出1-O-乙酰基-6-O-异丁酰基大花旋覆花内酯具有防治哮喘的作用，通过体内和体外实验证明1-O-乙酰基-6-O-异丁酰基大花旋覆花内酯具有很强的抗炎作用、较低的细胞毒性和显著的一氧化氮抑制活性，能够有效地改善哮喘机体肺功能，减少哮喘机体血清中卵清蛋白特异性IgE含量，能够减少粘蛋白5ACmRNA的表达，并发现其通过抑制PI3K/AKT/MEK/ERK信号通路从而起到抗哮喘作用。用。用。


技术研发人员：杨诚 谢春锋 李佳航
受保护的技术使用者：南开大学
技术研发日：2023.06.19
技术公布日：2023/8/28