一种具有黏液穿透功能的硒纳米酶及其制备方法与在制备药物载体中的应用与流程

1.本发明涉及生物医药材料领域，具体涉及一种具有黏液穿透功能的硒纳米酶及其制备方法与在制备药物载体中的应用。


背景技术：

2.近几年炎症风暴引起的急性肺炎使人类遭受到了严峻的挑战，为了应对复杂的病理条件和降低药物治疗的副作用，联合治疗成为近些年治疗的一个趋势，其中基因治疗(包括sirna和mrna)体积小特异性高的特点在治疗炎症类疾病中展现了强大的治疗潜力，基于治疗能够从根本上抑制炎症因子的表达。此外，炎症反应中会产生大量的损伤因子，例如活性氧(ros)和活性氮(ron)这些损伤因子会无差别的攻击人体组织器官，导致不可逆的损伤，同时大量的ros和ron存在还会破坏核酸中的二硫键结构，导致核酸链分解致使基因治疗药物失效，因此在进行基因治疗的同时还需要消除具有损伤作用的ros。硒纳米酶具有模拟谷胱甘肽过氧化氢酶活性的作用(gpx)具有持续稳定的ros消除能力，因此不仅能有效抑制炎症损伤而且能保持核酸药物稳定。但是硒纳米酶表面负电荷的性质，使其难以负载核酸药物，而且在口服过程中呼吸道中绵密的黏液层的屏障作用，极大地阻碍了基因药物的递送效率和生物利用率。因此，需要合适的策略开发硒纳米酶体系用于负载核酸药物并能穿透黏液屏障效应进行高效递送。


技术实现要素：

3.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法。
4.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
5.一种具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其包含如下步骤：
6.s1.向阳离子柱芳烃溶液中添加亚硒酸钠溶液，搅拌均匀后加入还原剂溶液进行反应，反应结束后分离固体产物得柱芳烃硒纳米酶；
7.s2.取甘露糖溶液，滴加到柱芳烃硒纳米酶溶液中，进行搅拌反应，反应结束后分离固体产物即得所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。
8.发明人在研究中惊奇的发现，采用阳离子柱芳烃以及甘露糖修饰得到的硒纳米酶，具有黏液穿透功能；因此，将其作为药物载体可以使得药物能够穿过黏液层，极大的提高了药物的递送效率和生物利用率。
9.如无特殊说明，本发明所述的溶液均指水溶液。
10.优选地，步骤s1中，所述的阳离子柱芳烃溶液中阳离子柱芳烃的浓度为0.8～1.2mm。
11.最优选地，步骤s1中，所述的阳离子柱芳烃溶液中阳离子柱芳烃的浓度为1mm。
12.优选地，所述的阳离子柱芳烃为阳离子柱[5]芳烃(cwp[5])或阳离子柱[6]芳烃
(cwp[6])。
[0013]
优选地，步骤s1中，所述亚硒酸钠溶液中亚硒酸钠的浓度为1.5～2.5mg/ml。
[0014]
最优选地，步骤s1中，所述亚硒酸钠溶液中亚硒酸钠的浓度为2mg/ml。
[0015]
优选地，步骤s1中，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为3～10mg/ml。
[0016]
最优选地，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为5mg/ml。
[0017]
优选地，步骤s1中，所述还原剂选自抗坏血酸、柠檬酸、半胱氨酸以及还原性谷胱甘肽中的一种或一种以上的混合。
[0018]
优选地，步骤s1中，阳离子柱芳烃溶液、添加亚硒酸钠溶液以及还原剂溶液的体积比为10：3～6：1～2。
[0019]
最优选地，步骤s1中，阳离子柱芳烃溶液、添加亚硒酸钠溶液以及还原剂溶液的体积比为10：5：1。
[0020]
优选地，步骤s2中，所述甘露糖溶液中甘露糖的浓度为0.8～1.2mg/ml。
[0021]
优选地，步骤s2中，所述柱芳烃硒纳米酶溶液中柱芳烃硒纳米酶的浓度为1.5～2.5mg/ml。
[0022]
最优选地，步骤s2中，所述甘露糖溶液中甘露糖的浓度为1mg/ml。
[0023]
最优选地，步骤s2中，所述柱芳烃硒纳米酶溶液中柱芳烃硒纳米酶的浓度为2mg/ml。
[0024]
优选地，步骤s2中甘露糖溶液与柱芳烃硒纳米酶溶液的体积比为0.5～2:10；
[0025]
最优选地，步骤s2中甘露糖溶液与柱芳烃硒纳米酶溶液的体积比为1:10。
[0026]
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。
[0027]
本发明还提供了一种上述具有黏液穿透功能的硒纳米酶在制备药物载体中的应用。
[0028]
优选地，所述的药物载体为具有黏液穿透功能的药物载体。
[0029]
优选地，所述的药物载体是针对生物药物的药物载体。
[0030]
进一步优选地，所述的生物药物为单抗、多肽、sirna以及mrna中的一种或一种以上的混合。
[0031]
更进一步优选地，所述的生物药物为sirna。
[0032]
最优选地，所述的sirna为ccr2-sirna。
[0033]
优选地，所述的药物载体为负载有ccr2-sirna的药物载体。
[0034]
研究表明，当具有黏液穿透功能的硒纳米酶负载ccr2-sirna后，其黏液穿透能力要显著高于未负载ccr2-sirna的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。
[0035]
优选地，所述的药物载体为具有活性氧消除作用的药物载体。
[0036]
有益效果：
[0037]
(1)本发明提供了一种全新方法制备得到的具有黏液穿透功能的硒纳米酶(cwp[5]-se@man或cwp[6]-se@man)；研究表明，该硒纳米酶具有黏液穿透功能，因此，将其作为载药体系可以使得药物能够穿过黏液层，极大的提高了药物的递送效率和生物利用率。
[0038]
(2)进一步研究表明，通过本发明所述方法制备得到的具有黏液穿透功能的硒纳米酶(cwp[5]-se@man或cwp[6]-se@man)具有均一结构，能够有效负载具有高特异性的核酸药物，同时其稳定的纳米酶功能为药物提供了稳定的环境，保持药物的稳定性，为核酸类药
物提供了新的递送载体，尤其进一步为口服类抗炎生物制剂抑制体内过量的炎症反应提供了思路。
[0039]
(3)进一步研究表明，通过本发明所述方法制备得到的具有黏液穿透功能的硒纳米酶(cwp[5]-se@man或cwp[6]-se@man)还具有活性氧消除作用；因此，将其作为载药体系可以防止活性氧破坏核酸药物，增强联合治疗方式的抗炎效果。
[0040]
(4)此外，本发明所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶(cwp[5]-se@man或cwp[6]-se@man)，其制备过程及产物体系简单，产品可直接保存和使用，且制备方法简便，而且所用原料在体内聚集后逐渐，生物相容性良好，无刺激性，具有良好的用前景。
附图说明
[0041]
图1为cwp[5]-se和cwp[6]-se以及cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的化学表征图；其中a为透射电镜图，65000倍，b为水合粒径图，c为h
1-nmr图，d为紫外-可见光谱图；e为红外光谱图。
[0042]
图2是cwp[5]-se和cwp[6]-se以及cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的性质表征图，其中a为cwp[5]-se和cwp[6]-se类谷胱甘肽过氧化氢酶活性图；b为cwp[5]-se和cwp[6]-se模拟gpx活性消除h2o2效率图；c为cwp[5]-se和cwp[6]-se以及cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man模拟gpx活性消除h2o2；图d为cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man负载ccr2-sirna琼脂糖凝胶电泳图；e为负载cy5标记的ccr2-sirna前后cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的荧光强度图；f为负载cy5标记的ccr2-sirna前后cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的电势电位图。
[0043]
图3为cwp[5]-se和cwp[6]-se以及cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的黏液穿透能力的效果图，其中图a和b为cwp[5]-se和cwp[6]-se、cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man以及cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man负载ccr2-sirna后在模拟黏液中不同时间的穿透效果图和穿透深度图；图c为其在模拟黏液中在transwell共培养模型中的穿透靶向效果图。
具体实施方式
[0044]
下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0045]
以下实施例中的阳离子柱[5]芳烃，具体采用的是cas号为1188423-16-6的二甲氧基柱[5]芳烃，购自上海源叶生物科技有限公司。
[0046]
以下实施例中的阳离子柱[6]芳烃，具体采用的是cas号为1207685-12-8的柱[6]芳烃，购自福州康诺生物医药科技有限公司。
[0047]
实施例1具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备
[0048]
s1.取10ml浓度为1mm的cwp[5]溶液放入烧杯中在26℃磁力搅拌保持10min；接着添加5ml浓度为2mg/ml的亚硒酸钠溶液，搅拌30min；然后加入1ml浓度为5mg/ml的抗坏血酸溶液进行反应1h，待溶液颜色稳定保持不变后，用去离子水清洗3次，通过离心冻干获得柱芳烃硒纳米酶(cwp[5]-se)；
[0049]
s2.取1ml浓度为1mg/ml的甘露糖溶液，滴加到10ml浓度为2mg/ml的cwp[5]-se溶液中，进行搅拌反应4h，反应结束后用去离子水清洗3次，通过离心冻干获得具有黏液穿透功能的硒纳米酶(cwp[5]-se@man)。
[0050]
实施例2具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备
[0051]
s1.取10ml浓度为1mm的cwp[6]溶液放入烧杯中在26℃磁力搅拌保持10min；接着添加5ml浓度为2mg/ml的亚硒酸钠溶液，搅拌30min；然后加入1ml浓度为5mg/ml的抗坏血酸溶液进行反应1h，待溶液颜色稳定保持不变后，用去离子水清洗3次，通过离心冻干获得柱芳烃硒纳米酶(cwp[6]-se)；
[0052]
s2.取1ml浓度为1mg/ml的甘露糖溶液，滴加到10ml浓度为2mg/ml的cwp[6]-se溶液中，进行搅拌反应4h，反应结束后用去离子水清洗3次，通过离心冻干获得具有黏液穿透功能的硒纳米酶(cwp[6]-se@man)。
[0053]
从图1a和图1b中可以看出其中cwp[5]-se呈梭形，粒径大约为220nm，cwp[6]-se为球形，粒径大约为160nm。图1c是cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的h
1-nmr图，从h
1-nmr图可以看出，相比于单独的柱芳烃和甘露糖的h
1-nmr图，cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man结构中均保留了柱芳烃中和man的官能团，从而表明成功合成了cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man。图1d和图1e是紫外-可见光谱和红外光谱图，通过电子结构和官能团进一步证明成功将甘露糖连接在cwp[5]-se和cwp[6]-se表面。
[0054]
实施例2硒纳米酶的谷胱甘肽过氧化氢酶和活性氧消除活性检测
[0055]
(1)使用标准的gr耦合法检测和分析所有形态的se酶类gpx样活性，同时设置天然gpx作为对照组。用1ml，ph＝7.4pbs(100mm)分别配置gsh(2mm)，nadph(0.4mm)，混合。然后在96孔板中在中分别加入50μlgsh，50μlnadph，15μlgr混合均匀，再滴加45μl h2o2(200μm)和20μl pvp-se，cwp[5]-se和cwp[6]-se(20μg.ml-1
)，对照组中天然gpx的浓度为1u.ml-1
。所有测定以及相应的对照均在25℃下进行。最后采用酶标仪检测340nm处吸光度的变化。结果见图2。
[0056]
(2)将18mg feso4.7h2o溶解在10ml去离子水中，并将10μl过氧化氢溶液(h2o2,30％)稀释至10ml。然后10ml h2o2加入到10ml feso4溶液反应10min。反应完成后，将溶液分别滴加到6孔板中。然后分别滴加20μl se、cwp[5]-se、cwp[6]-se、cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man(2mg/ml)混合并反应1h。反应完成后加入1ml水杨酸(sa，1.8mm)溶液反应15min，然后通过紫外可见光谱仪检测560nm处的吸光度。结果见图2
[0057]
如图2a所示，与gpx类似，用pvp-se，cwp[5]-se和cwp[6]-se处理后，nadph在340nm处的吸光度均有所降低，表明三种硒纳米粒子均表现出和天然gpx相同的催化活性，而加入aa处理则没有任何变化，表明硒纳米的ros消除活性并不是来源于aa。相应的三种硒纳米酶的h2o2消除效率分别为51％，59％和69％(图2b)，三者的gpx活性和h2o2消除活性与三者的粒径呈正相关趋势，其中pvp-se可能粒径最小，有更多的活性位点，从而导致其具有最高的催化活性。
[0058]
图2c显示，在制备了ros溶液中加入se、cwp[5]-se、cwp[6]-se、cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man反应1h后，相比于单独的h2o2，sa探针在510nm处的吸光度均明显下降，表明本发明cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man具有和se一样的活性，具有ros消除能力。
[0059]
实施例3cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man负载ccr2-sirna实验
[0060]
将cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man溶于10ml pbs溶液(ph＝7.4)得到浓度为1mg/ml，然后根据cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man的质量比(分别为1：1，2：1，5：1，10：1，20:1和40：1)加入适当的ccr2-sirna，然后在常温下缓慢搅拌共同孵育30min；接着离心收集(5000rpm,10min)，并冷冻干燥。最后通过琼脂糖凝胶电泳实验检测了纳米对ccr2-sirna的负载能力，于1％tae琼脂糖凝胶电泳缓冲液中进行电泳(80v,20min)，其中每个孔中含有1μlgel-green。使用image quant 300(美国ge healthcare)记录图像。
[0061]
图2d为cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man负载ccr2-sirna琼脂糖凝胶电泳图；e为负载cy5标记的ccr2-sirna前后cwp[5]-se和cwp[6]-se的荧光强度图；f为负载cy5标记的ccr2-sirna前后cwp[5]-se和cwp[6]-se的电势电位图。
[0062]
为了检测柱芳烃硒纳米酶负载ccr2-sirna的能力，我们首先采用了琼脂糖凝胶电泳实验分别检测了cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man对ccr2-sirna的负载能力。结果如图2d所示，在柱芳烃硒纳米酶正电荷的吸附作用下，cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man与cy 5标记的ccr 2-sirna的质量比为1:10时基本完全阻止了ccr2-sirna的迁移。并且随后检测了离心后溶液中的ccr2-sirna的荧光强度，结果显示负载了ccr2-sirna的cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man与ccr2-sirna均在发射波为670nm处有明显的吸收峰，表明cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man都能有效负载ccr2-sirna(图2e)。同时我们发现由于cwp[6]-se@man带有更多的正电荷，因此显示更强的负载能力，并表现出更强的荧光强度。
[0063]
实施例4穿透黏液层的实验
[0064]
(1)为了模拟黏液层，我们将混合了加入了少量dna的鸡蛋蛋清液与去离子水按2：1的混合，然后取1ml放置在硬化的1％的明胶凝胶上，其中蛋清混合液用于模拟黏液层，明胶层用于模拟杯状细胞。随后用考马斯亮蓝对样品进行染色(1:10)，然后添200μl样品沉积在人造粘液层的表面，每30min观察一次。结果见图3。
[0065]
(2)将黏液和活化的raw264.7共同培养在用0.4μm大小的微孔膜隔开的transwell系统中，用于观察待测样品穿透黏液层靶向进入下层巨噬细胞细胞内的效果。首先将raw264.7细胞(1
×
105)接种到transwell平板的底部孔中，待贴壁后，在上层小室中加入50μl的模拟黏液，然后再分别滴加50μlcy5标记负载ccr2-sirna的cwp[5]-se、cwp[6]-se、cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man共培养6h。取出上层小室，去除下层孔板中的完全培养基，用pbs清洗三次。随后下层raw264.7细胞用dapi和dio染色并荧光显微镜观察。结果见图3。
[0066]
结果如图3a和b所示，可以观察到cwp[5]-se、cwp[6]-se渗透能力差，其渗透深度远远小于cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man；这说明，本发明制备得到的cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man其能显著提高硒纳米酶的黏液穿透能力；此外，负载了ccr 2-sirna的cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man其渗透深度相对于未负载的cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man得到了进一步的大幅提高；这说明：当具有黏液穿透功能的硒纳米酶负载ccr2-sirna后，其黏液穿透能力要显著高于未负载ccr2-sirna的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。
[0067]
图3c是利用transwell模型进一步观察了本发明具有黏液穿透功能的硒纳米酶的黏液穿透能力，在激光共聚焦图像中也可以清晰地看出cwp[5]-se@man和cwp[6]-se@man在良好地穿透能力和靶向性下快速地进入下层raw 264.7细胞中，而cwp[5]-se和cwp[6]-se由于渗透能力差，因此无法进入孔板下层中被巨噬细胞摄取。
[0068]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的
限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：s1.向阳离子柱芳烃溶液中添加亚硒酸钠溶液，搅拌均匀后加入还原剂溶液进行反应，反应结束后分离固体产物得柱芳烃硒纳米酶；s2.取甘露糖溶液，滴加到柱芳烃硒纳米酶溶液中，进行搅拌反应，反应结束后分离固体产物即得所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。2.根据权利要求1所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述的阳离子柱芳烃溶液中阳离子柱芳烃的浓度为0.8～1.2mm；最优选地，步骤s1中，所述的阳离子柱芳烃溶液中阳离子柱芳烃的浓度为1mm。3.根据权利要求1所述的具有x黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，所述的阳离子柱芳烃为阳离子柱[5]芳烃(cwp[5])或阳离子柱[6]芳烃(cwp[6])。4.根据权利要求1所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述亚硒酸钠溶液中亚硒酸钠的浓度为1.5～2.5mg/ml；最优选地，步骤s1中，所述亚硒酸钠溶液中亚硒酸钠的浓度为2mg/ml。5.根据权利要求1所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为3～10mg/ml；最优选地，所述还原剂溶液中还原剂的浓度为5mg/ml。6.根据权利要求1所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤s1中，阳离子柱芳烃溶液、添加亚硒酸钠溶液以及还原剂溶液的体积比为10：3～6：1～2。最优选地，步骤s1中，阳离子柱芳烃溶液、添加亚硒酸钠溶液以及还原剂溶液的体积比为10：5：1。7.根据权利要求1所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤s2中，所述甘露糖溶液中甘露糖的浓度为0.8～1.2mg/ml。步骤s2中，所述柱芳烃硒纳米酶溶液中柱芳烃硒纳米酶的浓度为1.5～2.5mg/ml；最优选地，步骤s2中，所述甘露糖溶液中甘露糖的浓度为1mg/ml。最优选地，步骤s2中，所述柱芳烃硒纳米酶溶液中柱芳烃硒纳米酶的浓度为2mg/ml。8.根据权利要求1所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶的制备方法，其特征在于，步骤s2中甘露糖溶液与柱芳烃硒纳米酶溶液的体积比为0.5～2:10；最优选地，步骤s2中甘露糖溶液与柱芳烃硒纳米酶溶液的体积比为1:10。9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。10.权利要求8所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶在制备药物载体中的应用。

技术总结
本发明涉及生物医药材料领域，具体公开了一种具有黏液穿透功能的硒纳米酶及其制备方法与在制备药物载体中的应用；所述的制备方法包含如下步骤：S1.向阳离子柱芳烃溶液中添加亚硒酸钠溶液，搅拌均匀后加入还原剂溶液进行反应，反应结束后分离固体产物得柱芳烃硒纳米酶；S2.取甘露糖溶液，滴加到柱芳烃硒纳米酶溶液中，进行搅拌反应，反应结束后分离固体产物即得所述的具有黏液穿透功能的硒纳米酶。本发明所述方法制备得到的硒纳米酶具有黏液穿透功能，因此，将其作为药物载体可以使得药物能够穿过黏液层，极大的提高了药物的递送效率和生物利用率。生物利用率。生物利用率。


技术研发人员：陈旭 李天旺 黄郁凯 黄启当 陈嘉俊 刘杰
受保护的技术使用者：广东省第二人民医院（广东省卫生应急医院）
技术研发日：2023.06.27
技术公布日：2023/8/28