一种基于RAA技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时检测试剂盒及检测方法与流程

一种基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时检测试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时鉴定检测试剂盒及鉴定检测方法。


背景技术：

2.传统的蚊类鉴定以形态学鉴定为主， 但病媒生物的形态学特征在收集或储存的过程中可能受损，并且不能同时鉴定所有发育阶段，因此只有经验丰富的形态学鉴定专家才能精确鉴定。基于线粒体dna细胞色素氧化酶i基因（cytochrome oxidaseⅰ，coi）、寨卡病毒ns5基因、基孔肯雅病毒的ns2基因、登革病毒的ns1基因的重组酶介导链置换核酸扩增（recombinase-aid amplification，raa）技术应用于蚊类鉴定和蚊类携带病原体检测，与传统的形态学鉴定方法和荧光pcr方法相比，可大大提高蚊类分子鉴定效率和病原体检测效率。


技术实现要素：

3.本发明提供一种基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时鉴定检测试剂盒及鉴定检测方法本发明是由以下技术方案来实现的：本发明设计了一组基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时鉴定检测核酸序列特异性扩增引物，序列如下：线粒体基因组coi基因：白纹伊蚊-f4：ctttaacactgctgctttctagttctatagtag；白纹伊蚊-r4：ggtagtcggtcaagagtaataccagctgatcgta；ns5基因：寨卡病毒（zikv）-f6：tcacttacgctcttaacacatttaccaacctagt；寨卡病毒（zikv）-r6：cttcacaacgcaatcatctccactgactgcca；ns2基因：基孔肯雅病毒（chikv）-f4：ccgttggtatctgtgtattacgcggataaccactg；基孔肯雅病毒（chikv）-r4：agtgtggtagtctcctgttggccggtataatg；ns1基因：登革病毒（denv）-f7：tctatggagcaatggagttctggaaagtgaaat；登革病毒（denv）-r7：tgtggtcctaagagatggtcctcgatttccac。
4.本发明还提供一种基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时鉴定检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物序列。
5.与现有检测手段相比，本发明的有益效果在于：本发明依据线粒体dna细胞色素氧化酶i基因（cytochrome oxidaseⅰ，coi）、寨卡
病毒ns5基因、基孔肯雅病毒的ns2基因、登革病毒的ns1基因的重组酶介导链置换核酸扩增（recombinase-aid amplification，raa）技术应用于蚊类鉴定和蚊类携带病原体检测，与传统的形态学鉴定方法和荧光pcr方法相比，可大大提高蚊类分子鉴定效率和病原体检测效率。
附图说明
6.图1 白纹伊蚊raa检测方法的特异性结果。
7.图2 zikv的rt-raa检测方法的特异性结果。
8.图3 chikv的rt-raa检测方法的特异性结果。
9.图4 denv的rt-raa检测方法的特异性结果。
10.图5 白纹伊蚊raa检测方法的灵敏性结果。
11.图6 zikv的rt-raa检测方法的灵敏性结果。
12.图7 chikv的rt-raa检测方法的灵敏性结果。
13.图8 denv的rt-raa检测方法的灵敏性结果。
实施方式
14.下面利用实施例对本发明作进一步描述。
实施例
15.本实施例提供一组基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时鉴定检测核酸序列特异性扩增引物，序列如下：线粒体基因组coi基因：白纹伊蚊-f4：ctttaacactgctgctttctagttctatagtag；白纹伊蚊-r4：ggtagtcggtcaagagtaataccagctgatcgta；ns5基因：寨卡病毒（zikv）-f6：tcacttacgctcttaacacatttaccaacctagt；寨卡病毒（zikv）-r6：cttcacaacgcaatcatctccactgactgcca；ns2基因：基孔肯雅病毒（chikv）-f4：ccgttggtatctgtgtattacgcggataaccactg；基孔肯雅病毒（chikv）-r4：agtgtggtagtctcctgttggccggtataatg；ns1基因：登革病毒（denv）-f7：tctatggagcaatggagttctggaaagtgaaat；登革病毒（denv）-r7：tgtggtcctaagagatggtcctcgatttccac。
16.实施例2特异性和灵敏性检测核酸提取利用takara minibest viral rna/dna extraction kit ver.5.0 （货号：9766）试剂盒提取白纹伊蚊、骚扰阿蚊、三带喙库蚊、埃及伊蚊、刺扰伊蚊、背点伊蚊等蚊种的各自的一条后足的线粒体基因组核酸，提取寨卡病毒（zikv）、基孔肯雅病毒（chikv）、登革病毒（denv）、乙型脑炎病毒（jev）、黄热病毒（yfv）的rna核酸。
17.raa和rt-raa检测步骤利用杭州众测生物科技有限公司的raa核酸扩增试剂（基础型）扩增各个蚊类的dna核酸，利用杭州众测生物科技有限公司的rt-raa核酸扩增试剂（基础型）扩增各个病毒的rna核酸。
18.白纹伊蚊、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒raa或rt-raa检测方法的特异性检测：结果如图1-4所示，白纹伊蚊f4-r4引物（图1）、寨卡病毒f6-r6引物（图2）、基孔肯雅病毒f4-r4引物（图3）、登革病毒f7-r7引物（图4）相比于相应的对照来看，具有较好的特异性。
19.白纹伊蚊、寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒raa或rt-raa检测方法的灵敏性测试。结果如图5-8所示，白纹伊蚊f4-r4引物（图5）、寨卡病毒f6-r6引物（图6）、基孔肯雅病毒f4-r4引物（图7）、登革病毒f7-r7引物（图8）。
20.对白纹伊蚊一条后足提取的线粒体基因组核酸进行10倍倍比稀释，从图5中可以看出其灵敏度可达10-5
稀释度。对提取的细胞培养的寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒进行10倍倍比稀释，从图6、7、8中可以看出其各自灵敏度可分别达10-4
、10-6
、10-5
稀释度。
21.当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。


技术特征：
1.一种基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时检测核酸序列特异性扩增引物，其特征在于，序列如下：线粒体基因组coi基因：白纹伊蚊-f4：ctttaacactgctgctttctagttctatagtag；白纹伊蚊-r4：ggtagtcggtcaagagtaataccagctgatcgta；ns5基因：寨卡病毒（zikv）-f6：tcacttacgctcttaacacatttaccaacctagt；寨卡病毒（zikv）-r6：cttcacaacgcaatcatctccactgactgcca；ns2基因：基孔肯雅病毒（chikv）-f4：ccgttggtatctgtgtattacgcggataaccactg；基孔肯雅病毒（chikv）-r4：agtgtggtagtctcctgttggccggtataatg；ns1基因：登革病毒（denv）-f7：tctatggagcaatggagttctggaaagtgaaat；登革病毒（denv）-r7：tgtggtcctaagagatggtcctcgatttccac。2.一种基于raa技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物序列。

技术总结
本发明涉及一种基于RAA技术的白纹伊蚊及携带寨卡病毒、基孔肯雅病毒和登革病毒同时检测试剂盒及检测方法。本发明依据线粒体DNA细胞色素氧化酶I基因、寨卡病毒NS5基因、基孔肯雅病毒的NS2基因、登革病毒的NS1基因的重组酶介导链置换核酸扩增技术应用于蚊类鉴定和蚊类携带病原体检测，与传统的形态学鉴定方法和荧光PCR方法相比，可大大提高蚊类分子鉴定效率和病原体检测效率。率和病原体检测效率。率和病原体检测效率。


技术研发人员：滕新栋 刘迪 杨宇 于滢泉
受保护的技术使用者：青岛国际旅行卫生保健中心（青岛海关口岸门诊部）
技术研发日：2023.07.04
技术公布日：2023/8/28